BIOLOGIA DE PLASMIDOS

1. BIOLOGIA DE PLASMIDOS
JUAN CARLOS MUNEVAR N
GENETICA MOLECULAR MICROBIANA
1

2. PLASMIDOS
• La primera demostración de INFORMACION TRANFERIBLE
entre bacterias (1940)
Lederburg & Tatum
• DNA extracromosomal
asociado con transferencia de
resistencia múltiple a antibióticos
en las bacterias. (1960)
Watanabe, Falkow y Rownd
2

3. PLASMIDOS
• Los plásmidos son moléculas de ADN citoplásmico
descubiertas en Japón en los años 1955-60.
• Aisladas de enterobacterias multiresistentes
(Shigellas SCTSu) responsables de diarreas.
» Moléculas de ADN circular de doble
cadena, citoplásmicos.
» Poseen replicación autónoma
» Poseen una talla variable (0.5 -500 Kb)
3

4. DEFINICION
• Replicones extracromosomales presentes en bacterias
Gram +/Gram -, así como en algunas levaduras y hongos
• La mayoría son moléculas de ADN doble cadena,
circulares.
• Se han aislado plásmidos líneales, como intermediarios
durante la replicación en ciertas Gram +
» ESTA DEFINICION INCLUYE:
- formas replicativas de colifagos filamentosos
- estado profago de algunos fagos temperados (P1)
4

5. PLASMIDOS
EN LA NATURALEZA:
• Varían en estructura, tamaño.
• Modo de replicación.
• Número de copias por bacteria.
• Capacidad de propagarse en diferentes
bacterias
• Transferencia entre especies bacterianas.
• Características que poseen.
Se han identificado plásmidos líneales en Gram+ y Gram-
5

6. PLASMIDOS
• Los plásmidos median numerosas propiedades que
permiten una mejor adaptación de las bacterias.
⇒ Indispensables para el metabolismo normal de la célula.
P por plásmido, 2 ó 3 letras
según las combinaciones y
una cifra:
• pSC 102; pIP 15; pUD 12
» El modo de transmisión natural se efectúa normalmente
de una célula a otra generalmente por conjugación.
6

7. •Pueden ser visualizados por microscopia electrónica o
por electrofóresis en gel de agarosa.
• Se pueden cortar por diversas endonucleasas,
razón por la cual pueden ser caracterizados según
su perfil de restricción.
7

8. ESTRUCTURA
• ADN circular de doble cadena
de 2696 pb.
• Fueron construidos por
recombinación de un fragmento
de PBR 322 (2250 pb) y uno de
M13 doble cadena (446 pb)
• El ADN PBR 322 contiene el
gen ampr y el ADN de M13 tiene
el promotor del gen Lac Z
•Después del promotor del gen lac Z viene una región denominada
sitio de clonación múltiple (polylinker).
• Seguido de la secuencia de la parte NH2 del gen de βgalactosidasa
8

9. •Si el polylinker es hidrolizado por una de las enzimas
de restricción, puede recibir una secuencia de ADN ligada por
recombinación
• En este caso se interrumpe la expresión del péptido
complementario de la β Galactosidasa, la bacteria no podrá
digerir X- gal
No tomarán el color azul característico
• Solo permanecerán las colonias blancas
resistentes a la ampicilina
9

10. •ADN circular, doble cadena de
4361 pb.
•El nucleótido 1 se situa en medio
del sitio de restricción EcoR I
• Posee un origen de replicación
(2535).
• Un gen tetr (86 – 1276) y un
gen (ampr 4153 – 3293)
• El gen ampr codifica para una Beta-lactamasa (286 a.a.)
• Posee numerosos sitios de restricción. Muchos de estos sitios son
únicos permitiendo obtener ADN líneal: gen BamH I (375)
10

11. •La digestión por BamI permite recombinar el vector con un
fragmento de digestión BamI del ADN a clonar.
• La ligasa del bacteriofago T4 permite recircularisar el ADN
del plásmido.
•Las células transfectadas con este plásmido recombinante
replicaran este plásmido durante su crecimiento
• Sin embargo, esas células no expresaran mas el gen tetr, pero
permanecen resistentes a la ampicilina.
• Esto permite seleccionarlas y aislar el ADN del plásmido clonado
11

12. PROPIEDADES BIOLOGICAS
RESISTENCIA METABOLISMO
Antibióticos Aminoácidos
Antisépticos Carbohidratos
Metales iónicos Hidrocarburos
Irradiación
Resistencia al huésped Otras
Factores de adherencia Replicación
Exotoxinas Movilización
Factor invasivo Incompatibilidad
Oncogénesis
12

13. PROPIEDADES BIOLOGICAS
Los plásmidos poseen genes que especifican
funciones distintas:
• Resistencia a antibióticos.
• Resistencia a metales pesados.
• Sensibilidad a mutagénos.
• Sensibilidad/resistencia a fagos
• Producción de enzimas de restricción
• Síntesis de aminoácidos raros.
• Producción de toxinas.
• Determinación de la virulencia
• Catabolismo de moléculas orgánicas complejas.
• Capacidad de formar relaciones simbióticas
• Habilidad de transferir ADN entre distintas especies 13

14. PROPIEDADES BIOLOGICAS
• La adición de esas propiedades se deben a
una misma cepa.
• La adquisición de una o varios caracteres
metabólicos:
Producción de SH2 (E. Coli)
Producción de lisin decarboxilasa (Proteus)
Utilización de hidrocarburos (tolueno, xilol)
PLASMIDOS SIN FUNCION CONOCIDA
SE DENOMINAN CRIPTICOS 14

15. La transmisión de una célula a otra se efectúa
a menudo por conjugación.
(codifican pilis sexuales)
Se presenta también transformación, pero
frecuentemente sin especificidad del huésped.
DIFUSION A OTRAS BACTERIAS.
Difusión plasmidica en diversos grupos
15

16. CLASIFICACION
Primeros sistemas de clasificación:
1. Capacidad de plásmidos de transferir información
genética por conjugación.
2. Funciones especializadas codificadas por plásmidos.
3. Número de copias.
4. Capacidad de sobrevivir en diferentes bacterias.
5. Tipo de replicones*
16

17. CLASIFICACION
• DEBIDO AL ELEVADO NUMERO DE COMBINACIONES DE
CARACTERES Y AL RIESGO DE UNA “EPIDEMIA”
⇒ CLASIFICACION (1970)
en grupos o clases de incompatibilidad (Inc)
Pertenecen a un mismo grupo
hay EXCLUSION
Este clasificación dio origen al
descubrimiento de genes móviles
17

18. CLASIFICACION
INCOMPATIBILIDAD
FALLA DE 2 PLASMIDOS DE SER HEREDADOS DE
FORMA ESTABLE EN LA MISMA LINEA CELULAR
(sin presión selectiva)
La incapacidad de coexistir es consecuencia del hecho de
compartir elementos comunes de funciones heredadas
La Inc nos da una idea de la estrecha relación entre los
plásmidos.
Se relacionaron como grupos de incompatibilidad
18

19. REPLICACION
Para la conservación de plásmidos estables se
necesitan funciones codificadas por el huésped y por los
plásmidos.
La capacidad del plásmido de regular el inicio de su
replicación a partir de un origen específico (ori)
El inicio de la replicación del plásmido es especifico de
la molécula y de importancia para:
1. Proceso de propagación
2. Número de copias.
3. Incompatibilidad
19

20. REPLICACION
Los mecanismos moleculares que regulan el número
de copias poseen la capacidad de corregir los cambios:
1. Del número de copias causados por la división
celular
2. Por la introducción de ADN plasmídico
Los replicones plasmídicos contienen:
• 1 o varios ori
• 1 o más elementos reguladores
Fragmento de ADN de +/- 3
Kb.
• Gen que codifica una proteína o una molécula de ARN
20

21. Varios ori de plásmidos siguen el mecanismo molecular
utilizado por oriC (E. Coli)
Se necesita de una proteína codificada específica a ori de
plásmidos, o un transcrito
Esa proteína de replicación actúa en ori, sola o junto con
DNaA (proteína de inicio de la replicación para el cromosoma)
La replicación de algunos plásmidos requiere de enzimas
celulares normales : DNA poli I, IHF,
damMetilasas, Hsp.
21

22. BACTERIAS GRAM (-) BACTERIAS GRAM (+)
Replicación idéntica a la cromosomal
- Inicio en un ori especifico. Replicación por mecanismo de
CIRCULO RODANTE (ØX174)
- Replicación bidireccional
completando el círculo. - Intermediario específico
- Plásmidos de ADN monocatenario
- Intermediario en theta.
- Plásmido líneal se replican:
- Enzimas del huésped responsables
de la replicación del plásmido * Unión de la proteína a 5’ de cada
cadena utilizada para iniciar la
* Los genes del plásmido: síntesis de ADN.
+ Control temporal del inicio de
la replicación El número de copias controlado por:
El número de copias controlado por:
1. Genes del plásmido
1. Genes del plásmido
+ Reparto de copias de plásmidos 2. Interacciones huésped/plásmido
2. Interacciones huésped/plásmido
22

23. MANTENIMIENTO
La replicación no es suficiente para que los
plásmidos constituyan una línea celular genéticamente
estable
Conservar las funciones de los plásmidos desempeña un
papel esencial para mantener ESTABLES los caracteres
hereditarios.
••Sistemas que asesinan
Sistemas que asesinan
••Reparto equitativo de copias
Reparto equitativo de copias bacterias sin plásmidos
bacterias sin plásmidos
•• Sistemas antiagregamiento
Sistemas antiagregamiento ••Sistemas de recombinación
Sistemas de recombinación
especifica según el sitio.
especifica según el sitio.
23

24. PARTICION
El mecanismo de reparto involucra el reconocimiento de
pares de moléculas de plásmidos seguidos por un proceso
activo de separación de los miembros del par hacia los lados
opuestos de la membrana de la célula en división.
PLASMIDOS F y P1 (Número de copias = 1))
• Rápida generación de líneas celulares sin plásmidos.
• IMPORTANCIA DE LOS SISTEMAS DE PARTICION.
Los sistemas de reparto están codificados por los
plásmidos, aunque se necesitan las funciones celulares
24

25. FUNCIONES ESPECIALIZADAS
Los plásmidos codifican funciones que dotan a las bacterias de
atributos que las hacen relevantes para la medicina, para el
medio ambiente, en el sector industrial, en el sector agrícola.
Resistencia a antibióticos y metales pesados
Factores de virulencia (seroresistencia,adhesividad)
Metabolismo de compuestos orgánicos
Fijación biológica de nitrógeno.
Formación de tumores en plantas.
Producción de compuestos tóxicos en larvas
25

26. CONCLUSIONES
 Los plásmidos son elementos extracromosomales
encontrados en una gran variedad de bacterias.
 Los plásmidos pueden codificar funciones esenciales
para la célula hospedera que las dotan de atributos especiales.
 Para la conservación de plásmidos estables son necesarias
funciones codificadas por la célula huésped y los plásmidos
 Para mantener estables los caracteres hereditarios una
función se relaciona con la partición equitativa de plásmidos
 Existen otros mecanismos para aumentar su estabilidad;
sistemas de recombinación específicos según el sitio,
sistemas antiagregamiento,
sistemas que asesinan a las células hijas sin plásmidos.
26

27. BIBLIOGRAFIA
 Madigan, Martinko and Parker. Brock Biology
of Microorganisms. 9ª edición. 1999.
 Tomalsky M, Actis L, Crosa Jorge. Plasmids.
Enciclopedia of Microbiology, 1992. Volumen 3, 431- 442.
 Feinbaum Rhonda. Vectors derived from plasmids. Current
Protocols in molecular biology. Seccion II. Unidad 1.5. 1998.
 Alberts B, Bray, Lewis, Raff. Watson J. Molecular biology of
the cell. 3a edición. 1999. Capítulo 6.
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov
27