La replicación del ADN es el proceso por el cual este material genético se duplica para permitir que las células hijas hereden el mismo contenido que la célula madre. Este proceso ocurre gracias a enzimas como la ADN polimerasa, y requiere la apertura de la doble hélice de ADN en los orígenes de replicación para dar inicio a la síntesis semiconservativa de nuevas cadenas. La replicación ocurre de forma coordinada a través de las cadenas continua y rezagada.

1. Replicación del material genético

2. Introducción La información genética contenida en el ADN, experimenta dos procesos clave: replicación y expresión génica . A través de la replicación, el ADN se duplica, lo que permite repartir equitativamente el material genético a las células hijas durante el, proceso de división celular. En la expresión génica los genes son leídos por un conjunto de enzimas, siendo generalmente la síntesis de proteínas el producto final de dicho proceso. La expresión génica, a su vez, incluye: la trascripción y la traducción.

3. GEN: unidad de almacenamiento de información y unidad de herencia C oncepto de gen : secuencia de ADN que dirige la síntesis de una proteína. Actualmente se sabe que algunos genes codifican más de un polipéptido y que un mismo polipéptido puede ser codificado por diferentes genes. El concepto de gen no solamente incluye las regiones de ADN que codifican un polipéptido sino también los genes reguladores que determinan en qué tejidos, en qué momento o en qué cantidad se ha de sintetizar el polipéptido

4. Transcripción (síntesis de ARN mensajero ) Durante la transcripción genética, las secuencias de ADN son copiadas a ARN mediante una enzima llamada ARN polimerasa.

5. La secuencia del ADN está estructurada en codones de 3 nucleótidos. Se pueden distinguir: Genes o secuencias codificantes, que contienen la información para sintetizar proteínas. Secuencias no codificantes, que incluyen secuencias reguladoras de la expresión (promotores, intrones, …). Los genes, unidades de información

6. Los ribosomas traducen el código genético y ensamblan los aminoácidos que forman las proteínas Traducción (síntesis de proteínas)

7. La trascripción es la síntesis de ARN mensajero (ARNm), a partir de la secuencia nucleotídica de un gen. Este proceso ocurre dentro del núcleo en los organismos eucariontes. Luego el ARNm experimenta ciertas modificaciones localizándose finalmente en el citoplasma, en donde sirve como molde en el proceso de traducción. La traducción es la lectura del ARNm para generar una proteína.

8. En 1958, Francis Crick planteó que la información genética fluye del ADN al ARN y luego a las proteínas, nunca en sentido inverso, lo que se conoce como dogma central de la biología molecular. Este dogma constituye la piedra angular de la biología a nivel celular. No obstante, otros procesos escapan a este dogma, como por ejemplo, la trascripción inversa que ocurre en ciertos virus, en donde el ARN puede ser copiado en forma de ADN.

9. El Dogma General de la Biología Molecular - Replicación - Transcripción Síntesis de ARN - Traducción Síntesis de proteínas

10. Naturaleza semiconservativa de la replicación del DNA Profesor Camilo Toncio C

11. El mecanismo para copiar el DNA comporta el desenrollamiento de las dos cadenas del DNA progenitor, de tal manera que cada cadena sirva de molde para la síntesis de una cadena nueva, complementaria y enrollada sobre la cadena progenitora. La replicación completa de una molécula de DNA producirá dos dobles cadenas hijas, cada una consistente en una mitad de DNA progenitor ( una cadena de la estructura de doble cadena original) y otra mitad de material nuevo. Esta forma de replicación se denomina semiconservativa , ya que se conserva la mitad del material original en cada una de las dos copias.

12. Modelo de la replicación del DNA. Cada cadena actúa como molde para una nueva cadena complementaria. Cuando el proceso de copiado se ha completado habrá dos moléculas de DNA hijas de doble cadena, cada una de las cuales es una secuencia idéntica a la molécula original. El proceso real es bastante complejo, pero aquí se presenta el principio básico

13. Se diferencia de otros modelos posibles, el conservativo , en el que una de las dos estructuras de doble cadena hijas es la doble cadena conservada del progenitor, mientras que la otra sintetiza de novo, y el dispersivo , en el que el material del progenitor, se dispersa por las estructuras de las dobles cadenas hijas

14. Meselson y Sthal demostraron que el DNA se replica de forma semiconservativa La primera prueba experimental de este modelo se obtuvo en 1958, cuando Mathew Meselson y Franklin Sthal verificaron que las moléculas cuya densidad difiere en cantidades muy pequeñas podía separarse unas de otras mediante centrifugación en gradientes de densidad. En este método se crea un gradiente de densidad mediante la centrifugación de una solución concentrada de una sal de un metal pesado, como el CsCl. Si se suspenden moléculas de ácidos nucleicos de distintas densidades en un gradiente de este tipo, cada una migrara hasta el punto en que la densidad de la solución sea igual a la suya. Esta técnica permitió a Meselson y Sthal rastrear el camino de un DNA marcado por densidad a través de varias tandas de replicación, con los resultados que se presentan a continuación

15. Se aplicó el marcaje de densidad mediante el cultivo de la bacteria E. coli en un medio que contenía el isótopo pesado de nitrógeno, N15, durante muchas generaciones, de manera que el DNA alcanzaba una densidad mas alta mediante una sustitución amplia del N14 por el N15 en sus bases púricas y pirimidicas. Al aislarlo y centrifugarlo hasta el equilibrio a pH 7, este DNA formaba una banda única en una región del gradiente que correspondía a una densidad de 1,724 g/ml

16. En cambio cuando se analizaba de forma similar el DNA de las bacteria que proliferaban en un medio ligero que contenía N14, la banda producida tenia una densidad de 1,710 g/ml.

17. Cuando se transferían las bacterias con marcaje de densidad que proliferaban en el medio pesado al medio ligero, el DNA aislado después de una generación de crecimiento producía una banda exclusiva en una densidad intermedia de 1,714 g/ml

18. Este resultado es el esperado si el nuevo DNA replicado es una especie molecular híbrida , formada de una mitad de material del progenitor y una mitad de nuevo DNA (sintetizado en el medio ligero) Si estas bacterias se cultivaban durante una generación más en el medio ligero, se observan dos bandas del mismo tamaño una ligera y una de densidad hibrida, como era de prever si el DNA de densidad hibrida sufría un segundo ciclo de replicación semiconservativa

19. Estos resultados concordaban con la idea de que cada cromosoma replicado contiene una cadena procedente del progenitor y una cadena hija, pero los datos no excluían otras formas alternativas de replicación semiconservativa que implicaran la ruptura de las cadenas de DNA. Estos modelos se descartaron mediante análisis de centrifugación de los DNA marcados por densidad a pH 12 en el que las cadenas se separan.

20. Cuando se centrifuga hasta el equilibrio después de la proliferación bacteriana en el medio pesado seguido de una generación en el medio ligero, el DNA formaba dos bandas: una ligera ( igual a la observada en el análisis de las bacterias que proliferaban en N14) y una pesada

21. El DNA analizado después de un segundo ciclo de replicación en el medio ligero presentaba tres cuartas partes de material ligero y una cuarta parte de material pesado. La conclusión inevitable era que el híbrido obtenido por replicación contenía una cadena completa de DNA del progenitor y una cadena completa de DNA de nueva síntesis.

22. Resúmen

23. Resúmen

26. Replicación del ADN El proceso de replicación, duplicación o síntesis del ADN permite que las células, a través de la mitosis, hereden más o menos el mismo material genético que su célula madre. Este hecho es altamente importante pues permite no sólo la herencia desde una célula a la siguiente, sino que también hacia las siguientes generaciones.

27. Síntesis del ADN La replicación del ADN es posible gracias a la actividad de una enzima denominada ADN polimerasa. Esta enzima añade nuevos nucleótidos a la hebra naciente, requiriendo para ello de un grupo hidroxilo (OH) 3´ libre en un nucleótido localizado en la nueva hebra. El extremo 3´ libre es aportado por una corta secuencia de ribonucleótidos, complementaria a una región del ADN, que se conoce como ARN cebador, partidor o primer.

28. El cebador es más proclive al error, por lo que debería eliminarse y el RNA puede detectarse y eliminarse fácilmente por la DNApol I ¿Por qué el cebador es RNA?

29. Replicación del DNA Enzimas que sintetizan (replican) el DNA E. coli DNA polimerasa I (rellena huecos y repara) DNA polimerasa II y III (función principal en la síntesis) Añade bases en ambas cadenas en la dirección 5’  3’ Requiere un 3’ OH final Eucariotas 5 polimerasas  y  principal en replicación  ,  y  exonucleasas Corrección de pruebas: actividad 3’  5’ exonucleotídica. Sustituye bases mal emparejadas por correctas ; mecanismos de reparación adicionales la reducen hasta 10 -10

30. La cadena nueva de ADN crece en sentido 5´ a 3´ , mientras que la enzima lee la hebra molde de 3´a 5´ . Cada nuevo nucleótido incorporado aporta un extremo 3´ libre y se añade siguiendo las reglas de complementariedad de bases

31. La cadena nueva de ADN crece en sentido 5´ a 3´, mientras que la enzima lee la hebra molde de 3´a 5´ . - Cada nuevo nucleótido incorporado aporta un extremo 3´ libre y se añade siguiendo las reglas de complementariedad de bases

32. Orígenes de replicación Trabajos realizados con cromosomas bacterianos permitieron revelar la existencia de un origen de replicación , que corresponden a un punto de dichos cromosomas donde se inicia este proceso ( Ori ). En este punto, la doble hebra de ADN se abre, separándose ambas cadenas y originándose el ojal o burbuja de replicación . En cada extremo de este ojal se forman las horquillas de replicación

33. Orígenes de replicación Las proteínas que inician la replicación reconocen esa secuencia del origen de replicación Proteínas se pegan al DNA formando la burbuja de replicación

34. Orígenes de replicación La replicación del DNA prosigue en ambas direcciones hasta que la molécula se copie completamente En ambos terminales de la burbuja de replicación está la horquilla de replicación

39. Alargamiento de la banda de DNA La DNA polimerasa es la enzima que alarga el nuevo DNA en la horquilla de replicación Los nucleótidos se alinean con sus bases complementarias a lo largo de la banda templada de DNA, y se pegan una por una al terminal de la banda de DNA en proceso Los nucleótidos que sirven de sustrato de DNA polimerasa son nucle ó sidos trifosfatos

40. Cada monómero se pega al terminal de la banda en proceso del DNA perdiendo dos grupos fosfatos como una molécula de pirofosfato (PPi) La hidrólisis del pirofosfato hacia dos moléculas de fosfato inorgánico (Pi) es la reacción exerg ó nica que dirige la reacción de polimerización Alargamiento de la banda de DNA

41. ATP

42. Arreglo antiparalelo de las bandas de DNA Las dos bandas del DNA son antiparalelas, lo que significa que una banda corre en dirección opuesta de la otra Un grupo OH - esta en el terminal 3’ Un Grupo PO 4 - esta en el terminal 5’

43. La DNA polimerasa adhiere nucleótidos solo del terminal 3’ al terminal 5’ El alargamiento de la nueva banda de DNA solo puede ocurrir en dirección 5’ -> 3’ Arreglo antiparalelo de las bandas de DNA

44. Continuación…….

45. - Las cadenas de ADN son antiparalelas, es decir, la dirección 5´ a 3´ de una hebra respecto de la otra es inversa. - Así mientras se abre la horquilla de replicación, la enzima ADN polimerasa puede trabajar continuamente, leyendo la hebra molde que se abre en la dirección 3´a 5´ , pero no la hebra paralela que se abre desde 5´ a 3´.

46. Esto constituyo un dilema hasta que el científico jampones Reiji Okazaki descubrió que en la hebra que se abría en dirección 5´ a 3´ la replicación se desarrollaba de manera retrasada, a saltos, a medida que la horquilla se abría. Para esto moléculas de ARN cebador se adicionan continuamente a la hebra que se abre en sentido 5´ a 3´, denominada hebra retrasada .

47. Banda continua o lider de DNA (“leading DNA strand”) Esta banda es sintetizada continuamente por la DNA polimerasa en el tenedor de replicación

48. De esta manera, en la hebra retrasada, el proceso de replicación se realiza discontinuamente, través de la síntesis de pequeños fragmentos de ADN llamados fragmentos de Okasaki . Una vez completada la replicación en la hebra retrasada, una enzima llamada ADN ligasa une los diferentes fragmentos.

49. Banda rezagada de DNA (“lagging DNA strand”) Es la nueva banda que sintetiza la DNA polimerasa en dirección opuesta al tenedor de replicación Al abrirse la burbuja de replicación se sintetizan fragmentos cortos de DNA fuera del tenedor de replicación Los fragmentos de Okazaki son segmentos cortos de DNA adheridos a la banda regazada. La ligasa de DNA es la enzima que une los fragmentos de Okazaki

51. Síntesis de DNA con RNA La DNA polimerasa sólo adhiere nucleótidos a una cadena ya existente apareada a la banda templada Ella solamente puede añadir el terminal 3’ a una hebra ya comenzada El cebo o “ primer” es un segmento corto de RNA que marca el comienzo de la nueva cadena de DNA.

52. Síntesis de DNA con RNA La primasa es una enzima que adhiere los nucleótidos de RNA para hacer el cebo o “primer” Mas tarde otra DNA polimerasa reemplaza los nucleótidos de RNA del primer con nucleótidos de DNA Se requiere un sólo primer para que la DNA polimerasa sintetice la banda continua (“leading strand”) de DNA.

53. Otras proteínas envueltas en replicación de DNA Helicasa : enzima que abre la doble hélice en el tenedor de replicación separando las dos bandas Proteína que se enlaza a una sola hebra (“single binding protein”): luego de que la helicaza separa las bandas, esta proteína mantiene estabilizadas las bandas

54. El proceso descrito anteriormente es bidireccional, pues por cada ojal de replicación hay dos horquillas de replicación, cada una avanzando en dirección opuesta. La enzima helicasa separa ambas hebras. Este desenrollamiento provoca provoca a su vez superenrollamiento en los extremos de la horquilla de replicación. Otro par de enzimas, llamadas topoisomerasas , liberan esta tensión al cortar y luego reunir la doble hélice.

64. En el DNA nuclear de eucariotas hay muchos orígenes de replicación (~500 en levaduras y 60000 en mamíferos). Cada unidad de replicación es un replicón. La replicación es bidireccional

65. En el DNA nuclear de eucariotas hay muchos orígenes de replicación (~500 en levaduras y 60000 en mamíferos). Cada unidad de replicación es un replicón. La replicación es bidireccional

66. Lectura de prueba (“Proofreading”) y reparación durante la replicación del DNA La DNA polimerasa hace lectura de prueba o “proofreading” en cada nucleótido Si se encuentra algún nucleótido mal apareado, la DNA polimerasa lo cambia por el correcto Los nucleótidos que no estén apareados correctamente, en ocasiones, no pasan por el proceso de “proofreading” de la DNA polimerasa o se arregla luego de completarse la replicación del DNA

67. Factores que pueden dañar el DNA Los reactivos químicos, emisiones radiactivos, rayos X y la luz UV pueden dañar el DNA El DNA puede pasar por cambios espontáneos bajo condiciones normales Cada célula monitorea y repara constantemente su material genético

68. Mecanismos de reparación Nucleasa : enzima que corta una porción alrededor de los nucleótidos mal apareados. Reparación de escisión del nucleótido (“nucleotide excision repair”) : los daños de luz UV a la piel producen un “ dimer” de timina. Da ñ os al DNA -> Nucleasa -> DNA polimerasa -> ligaza

69. Mecanismos para terminar la replicación La maquinaria de la replicación no completa el terminal 5’ de las bandas nuevas de DNA Como resultado se repiten rondas de la replicación y por consiguiente las moléculas de DNA se van haciendo mucho mas cortas En células procariotas no sucede esto ya que su DNA es circular

73. Tel ó meros Son secuencias especiales de nucleótidos al final del DNA cromosomal eucariótico Estos no contienen genes, pero si secuencias cortas repetidas de nucleótidos (TTAGGG en humanos) Protegen el genoma de errores durante las rondas de replicación Previenen el envejecimiento y muerte celular Tel ó meros y telomerasas

74. Telomerasas Los telómeros se van acortando según van ocurriendo las replicaciones DNA Las telomeras son enzimas que alargan los tel ó meros Tienen una secuencia corta de RNA unido a su proteína La secuencia de RNA sirve como molde (“template”) para extender el tel ó mero hasta el terminal 3’ No están activamente en las células somáticas, pero si en células embrionarias Anormalmente están presentes en las células cancerosas Los punto anaranjados marcan los tel ó meros en cromosomas de ratón

78. Replicación de DNA resúmen

79. Concepto Básico del Modelo de Replicación La molécula parental tiene dos hebras complementarias de DNA. Cada base es apareada con otra en específico. T (timina) con A (adenina) y G (guanina) con C (citosina).

80. Concepto Básico del Modelo de Replicación El primer paso durante la replicación del DNA es la separación de las dos hebras

81. Concepto Básico del Modelo de Replicación Cada hebra parental ahora sirve como templado aunque determina el orden de nucleótidos a lo largo de la nueva hebra complementaria

82. Concepto Básico del Modelo de Replicación Los nucleótidos están conectados para formar los enlaces entre los fosfatos y azúcares de la nueva hebra Cada molécula “hija” de DNA consiste de una hebra parental y una hebra nueva

83. Resumen de la replicación de DNA La helicaza desenrolla la doble hélice del DNA Las proteínas que se enlazan a una sola hebra o “single binding proteins” estabilizan la hebra parental desenrollada del DNA La hebra continua o “leading strand” es sintetizada en dirección de 5’a 3’ por la DNA polimeraza

84. Resumen de la replicación de DNA La hebra discontinua o “lagging strand” es sintetizada por la primaza que coloca pequeñas secuencias de RNA que son extendidos por la DNA polimeraza formando fragmentos de Okazaki Otra DNA polimeraza reemplaza los cebos o “primers” de RNA por DNA La DNA ligaza une los fragmentos de Okazaki