Este documento describe la tecnología del DNA recombinante y los procedimientos para la fabricación de DNA recombinante, incluyendo el uso de enzimas de restricción y diferentes tipos de vectores como plásmidos, bacteriófagos y cósmidos. Explica que los cósmidos son vectores híbridos que pueden transportar insertos de DNA más grandes que los bacteriófagos y replicarse como plásmidos, lo que los hace útiles para clonar y estudiar genes.

1. Cósmidos
José David Navarro Jiménez; Iván Kerguelén; Mario Chadid
Medicina
Universidad de Sucre
2014

2. Introducción

3. Conceptos
• El término DNA recombinante hace referencia a segmentos o
moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera
natural.
• Este término se reserva a las moléculas de DNA producidas por
la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes
biológicas.
• La tecnología del DNA recombinante utiliza técnicas que
provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas a
metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la
investigación de bacterias y de virus.

4. Procedimientos
• La utilización del DNA recombinante es una herramienta
poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de
secuencias específicas de DNA a partir de una población de
secuencias mezcladas. Los procedimientos básicos incluyen una
serie de pasos:

5. Procedimientos
1- Las endonucleasas de restricción,
cortan el DNA por secuencias
nucleotídicas específicas.
2- Los fragmentos productos de las
enzimas de restricción se unen a DNA
vectorial.
Los vectores pueden replicarse
autónomamente en la célula
huésped y facilitan la
manipulación
3. La molécula de DNA
recombinante, se transfiere
a una célula huésped.
4- Al replicarse las
células huésped, las
células descendientes
heredan el DNA
recombinante clones.
5-Los segmentos de
DNA clonados se
recuperarse, purifican y
analizan.

6. Fabricación de DNA recombinante
 El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrece
nuevas oportunidades para la investigación, ya que
simplifica la obtención de grandes cantidades de DNA que
codifican genes específicos, y facilita las investigaciones de
la organización, estructura y expresión génicas.
Procedimiento

7. Fabricación de DNA recombinante
 Esta metodología también ha dado un impulso al desarrollo
de la naciente industria biotecnológica, que está
suministrando un número creciente de productos al
mercado.
Procedimiento

8. Fabricación de DNA recombinante
 La piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es un tipo
de enzimas denominadas endonucleasas de restricción.
 Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de
nucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula de
DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia.
Procedimiento
Enzimas de restricción

9. Fabricación de DNA recombinante
 El premio Nobel de 1978 se otorgó a Werner Arber, Hamilton Smith y
Daniel Nathans por su investigación sobre las enzimas de restricción.
Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas
de restricción diferentes.
 Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que
limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleico
invasor
Procedimiento
Enzimas de restricción

10. Fabricación de DNA recombinante
 Las enzimas de restricción se denominan según el organismo
en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico.
 La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se
descubrió en Hemophilus influenzae. Hay dos tipos de
enzimas de restricción:
Procedimiento
Enzimas de restricción

11. Fabricación de DNA recombinante
• Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en
una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de
restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de
DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.
Procedimiento
Enzimas de restricción

12. Fabricación de DNA recombinante
• Las enzimas de Tipo II: reconocen una secuencia
específica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNA
con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida.
• Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinante
puesto que cortan en sitios específicos.
• Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son
simétricas es decir, la secuencia de una de las cadenas leída
en dirección 5' Ö 3' es la misma que la secuencia de la
cadena complementaria leída también en dirección 5' Ö 3'.
Procedimiento
Enzimas de restricción

13. Fabricación de DNA recombinante
Procedimiento
Enzimas de restricción

14. Fabricación de DNA recombinante
Procedimiento
Enzimas de restricción

15. Fabricación de DNA recombinante
Otras tipo dos
 Las moléculas de DNA recombinante pueden formarse a partir
DNA cortado con enzimas que dejan extremos romos.
 En este método se utiliza la enzima desoxinucleotidil
transferasa terminal para crear colas complementarias
mediante la adición de fragmentos de poli-dA y de poli-dT.
 Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes y
para crear moléculas de DNA recombinante, que son unidas
covalentemente por tratamiento con la DNA ligasa.
Procedimiento
Enzimas de restricción

16. Fabricación de DNA recombinante
Otras tipo dos
 Las moléculas de DNA recombinante pueden formarse a partir
DNA cortado con enzimas que dejan extremos romos.
 En este método se utiliza la enzima desoxinucleotidil
transferasa terminal para crear colas complementarias
mediante la adición de fragmentos de poli-dA y de poli-dT.
 Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes y
para crear moléculas de DNA recombinante, que son unidas
covalentemente por tratamiento con la DNA ligasa.
Procedimiento
Enzimas de restricción

17. Fabricación de DNA recombinante
 Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un
segmento de DNA puede llegar a entrar en una célula huésped
y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente,
moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una
molécula de DNA debe tener unas determinadas
características:
Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores:
- los plásmidos
- los bacteriófagos
- los cósmidos
Procedimiento
Vectores

18. Fabricación de DNA recombinante
Características
 1. Debe poder replicarse independientemente junto con el
segmento de DNA que transporta.
 2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de
restricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de
restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan
para insertar segmentos de DNA cortados con la misma
enzima.
 3. Debe tener algún marcador de selección (normalmente
genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que
la célula huésped no tiene) para poder distinguir las células
huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.
 4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.
Procedimiento
Vectores

19. Fabricación de DNA recombinante
• Plásmidos.
- Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena
extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de
replicación (ori+).
- Se replican autónomamente en las células bacterianas.
- Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se han
modificado o diseñado plásmidos de manera que contengan un
número limitado de sitios de restricción y genes de
resistencia a antibiótico s específicos.
Procedimiento
Vectores

20. Fabricación de DNA recombinante
• Plásmidos.
Procedimiento
Vectores

21. Fabricación de DNA recombinante
• Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13
- Se extrae el DNA de una preparación de fago lambda y se
elimina el grupo central de genes por tratamiento con una
enzima de restricción.
- El DNA a clonar se corta con la misma enzima y se liga entre
los brazos del cromosoma de lambda.
- Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las
proteínas del fago para formar un virus recombinante.
- Este virus puede infectar células bacterianas y replicar su
cromosoma, incluido el inserto de DNA.
Procedimiento
Vectores

22. Fabricación de DNA recombinante
• Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13
Procedimiento
Vectores

23. Fabricación de DNA recombinante
• Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13
Procedimiento
Vectores

24. Cósmidos

25.  Descritos por primera vez por Collins y Hohn en 1978.
 Son vectores híbridos construidos utilizando partes del
cromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico.
 Contienen la secuencia “cos” del fago lambda.
 Secuencias plasmídicas de replicación y de genes de
resistencia a antibióticos.
Cósmidos

26.  Su DNA, que contiene DNA insertado, se empaqueta en la
cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas
infectivas.
 Una vez el cósmido entra en la célula huésped, se replica
como un plásmido.
 Los cósmidos pueden transportar insertos de DNA mucho
más grandes que los que lambda puede llevar.
Cósmidos
Características

27. Características
 Cósmidos: 37-52 kb de ADN.
 Vectores fágicos: 15 kb.
 Plásmidos: 1- 10kb (limitados).
Cósmidos

28. Características
Cósmidos
Sitios de restricción
para la clonación

29. Características
Cósmidos
Sitios de restricción
para la clonación

30. Características
 Pueden replicarse como plásmidos si tienen un origen de
replicación adecuados.
 Generalmente contienen marcadores genéticos que permiten
su selección en los dos sistemas huésped.
 SV40 ori en células de mamífero.
 ColE1 ori para la replicación del ADN de doble cadena.
 f1 ori para la replicación de ADN de cadena sencilla en
procariotas.
Cósmidos

31. Cósmidos

32. Pasos en la clonación usando cósmidos como vectores

35. Aplicación

37. Clonación y caracterización de genes involucrados en la
utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena

38. • Sacarosa
• PTS
• SACAROSA
6-fostato
Hidrólisis
• D-glucosa -6-
fosfato
• D-fructosa
Fosforilación
• Fructokinasa
dependiente
de ATP
Vías
metabólicas
Clonación y caracterización de genes involucrados en la
utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena

39. OBJETIVOS:
• Determinar la capacidad de nueve cepas de E. coli
enteropatógenas.
• Aislar y caracterizar los genes involucrados.
Clonación y caracterización de genes involucrados en la
utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena

40. 9 cepas de E. coli
MackScr0.2%
M9Scr0.2%
Clonación y caracterización de genes involucrados en la
utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena

41. Clonación y caracterización de genes involucrados en la
utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena.

42. pCP13
E.Coli
W3110Sc
r-
W3110
Sacarosa +
Clonación y caracterización de genes involucrados en la
utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatógena.

43. • Las nueve cepas de E. coli crecen en medios de
M9Scr0.2% y producen colonias rojas en MackScr0.2%.
Clonación y caracterización de genes involucrados en la
utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatogena
Resultados y Discusión

44. • Las nueve cepas utilizadas son capaces de crecer en
presencia de sacarosa pero su capacidad de emplear esta
azúcar es diferente.
• La utilización de un procedimiento de selección positiva nos
permitió aislar los genes involucrados en el catabolismo de
esta azúcar.
Clonación y caracterización de genes involucrados en la
utilización de la sacarosa en cepas de E. coli enteropatogena
Conclusiones

45. Gracia
s

46. “Si el amor es el que guía
tu vida, realizarás
grandes empresas”
San Agustín

47. • Características de un vector
• ¿Qué es un cósmido?
• Diferencias entre cósmido, plásmido y bacteriófago