Este documento describe un estudio realizado en 7 niños con síntomas como neutropenia, disfunción de los neutrófilos, fibrosis de la médula ósea y hematopoyesis extramedular, con el objetivo de describir el mecanismo de un nuevo síndrome de defecto de los neutrófilos asociado con mutaciones en el gen VPS45. Los resultados mostraron que las mutaciones en VPS45 causan defectos múltiples que afectan las células neutrófilas y fibroblastos. La transfección con un vector no mutado de VPS45 redujo la

1. Juliana Ceballos Giraldo
Juan Felipe Giraldo Aristizabal
Tercer semestre
Universidad Pontificia Bolivariana

2. Introduction
• Congenital is any characteristic present at the
moment of birth that was acquired inside the womb.
It might be the result of genetic, physical, chemical
or infectious factors.
• Neutrophil Defect Syndrome characterized by
a severe defect in neutrophils, bone marrow fibrosis,
nephromegaly and life-threatening infections.

3. Introduction
• VPS45 mutation is a mutation that causes
Thr224Asn or Glu238Lys modification depending on
the ethnicity.
• The mutation of the VPS45 gen causes a defect in
the neutrophils that is expressed before the birth
what makes this a congenital condition, affecting the
innate immunity.

4. Objective
• The study was performed in 7 kids that had similar
symptoms : neutropenia, neutrophil dysfunction, bone
marrow fibrosis and renal extramedullary
haematopoiesis, in order to describe the mechanism
of this new disease.
• The mutation of the VSP45 gen causes multiple
defects that affects not only the neutrophil cells but
also the fibroblasts.

5. Materiales y Métodos
Pacientes:
 Estudio realizado en 7 niños.
 4 familias palestinas y 1 marroquí.
 Presencia de síntomas anteriormente mencionados.
 Los padres firmaron consentimiento informado.

6. Materiales y Métodos
Polimorfismo de nucleótido simple (SNP):
 La genotipicación de los SNP se realizó en ADN
genómico con el uso del HumanOmniExpress DNA
Analysis Bead-Chip.
 Los SNPs fueron analizados mediante el uso del
software GenomeStudio.

7. Materiales y Métodos
Secuenciación:
 Se utilizó un método de hibridación en solución de
captura de exones.
 Las variantes del VPS45 fueron examinados por medio
de secuenciación didesoxi, con cebadores que cubren
el exón 7 y su región intrónica de acompañamiento.

8. Materiales y Métodos
Estudios celulares
 Fibroblastos cultivados de biopsias del antebrazo de
niños afectados.
 Comparación con fibroblastos de adultos normales.

9. Materiales y Métodos
Transfección:
 Transfección de los fibroblastos de los pacientes y
de control con un vector pCMV6 con un plásmido Myc-
DDK.
 Su eficiencia fue de un 70%

10. Materiales y Métodos
Función neutrófila:
 En neutrófilos aislados de sangre heparinizada se
probó la producción de superoxido y H2O2.
 También se realizó un análisis de las subunidades de la
NADPH-oxidasa y la quimiotaxis.

11. Materiales y Métodos
Citometría:
 Muestras de sangre periférica de pacientes y
controles.
 Fueron incubadas con anticuerpos anti-CD45 PerCP y
anti-CD29 FTC.
 Los linfocitos, granulocitos y monocitos fueron
separados.
 La expresión de ambos marcadores fue medida con
citometría de flujo.

12. Materiales y Métodos
Estudios en el pez cebra:
 Se microinyectó morfolinos de
genes específicos en los sacos
vitelinos de los embriones de
pez cebra de la raza Ekkwill.
 Los embriones se incubaron a
28°C en medio de embrión E3
por 24 horas post-fertilización.
 Se realizó hibridación in situ con
ribosondas y tinción con Negro
Sudán B.

13. Fundamentos
Secuenciación:
 Se utilizan desoxirribonucleótidos para terminar las
cadenas y detener la elongación.
 Como "molde" se utiliza una de las cadenas del
fragmento de ADN que se va a secuenciar.
 Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un
corto oligonucleótido complementario del extremo de
la cadena.

14. Fundamentos
Desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP,
dGMP, dCMP.
Didesoxinucleótidos de una base en cada una de las
cuatro reacciones de secuenciación.
Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la
polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse
un didesoxinucleótido.
En el estudio se utilizó para examinar las variaciones
del gen VPS45 que causan los defectos.

15. Fundamentos
Transfección:
 Consiste en la introducción de material genético
externo en células eucariotas mediante plásmidos,
vectores víricos u otras herramientas para la
transferencia.
 Fosfato de Calcio, una solución
salina tamponada con HEPES y que contiene iones
fosfato se combina con una solución de cloruro de
calcio que contiene el DNA a transfectar.

16. Fundamentos
Se forma un precipitado, quedando el DNA en su
superficie.
Esta suspensión se añade a las células que se quieren
transfectar.
En el estudio se utiliza para ingresar a los cultivos de
fibroblastos el ADN complementario mediante los
vectores pCMV6.

17. Fundamentos
Citometría:
 Se analiza La dispersión y difracción de la luz que
ocurre cuando se la hace pasar por una suspensión de
células.
 Se analiza el tamaño y la complejidad de estas.

18. Fundamentos
 Las células se pueden poner en presencia
de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas
fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen
los antígenos complementarios a los anticuerpos
monoclonales usados.
 En el estudio se utiliza para ver la expresión de los
marcadores en la superficie celular en respuesta a los
anticuerpos añadidos a las muestras de sangre.

19. Resultados
Los padres de las
cinco familias
fueron
clínicamente sanos
Exámenes
realizados en
padres y hermanos,
dieron resultados
normales.
Figura 1

20. Resultados
 En el estudio,
algunos pacientes
presentaron
hematopoyesis
extramedular.
Figura 1

21. Resultados
 Hipercelularidad.
Distorsión del tejido
hematopoyético .
Prominente fibrosis
reticular.
Fibrosis en todas las
biopsias.
Figura 1

22. Resultados
Menor proporción
de gránulos en los
neutrófilos.
Mayor presencia
de mitocondrias.
Aparato de Golgi
y retículo
endoplasmático más
desarrollados.Figura 1

23. Resultados

24. Resultados
Expresión reducida
de VPS45 en sangre y
en fibroblastos de
pacientes.
 reducción de
rabenosyn-5 y la
sintaxina-16 (STX16)
Figura 2

25. Motilidad
celular reducida
en pacientes.
Fibroblastos
recubiertos con
fibronectina.
Figura 2
Resultados

26. Resultados
análisis de
citometría de flujo
para CD45 y β1
integrina
La sangre del
paciente tiene
muchas menos
células que son
positivas para la
integrina β1. Figura 2

27. Resultados
 Presencia de
apoptosis aumentada
en fibroblastos de
los pacientes
Figura 2

28. Resultados
 Los niveles de
las proteínas se
restauran luego
de la trasfección
con un plásmido
no mutado.
Figura 3

29. Resultados
Los fibroblastos
transfectados
tuvieron una
motilidad mayor.
Figura 3

30. Resultados
 La transfección con
el vector de VPS45 no
mutado reduce la
apoptosis en un 50%.
Figura 3

31. Resultados
Figura 4

32. Conclusions
 Progress in laboratory techniques and methods are
of great help in understanding molecular biology’s
field and its importance in medicine, is of vital
importance in explaining the mechanism by which
certain diseases occur, in this case of congenital
defect neutrophil syndrome associated with
mutations in VPS45.

33. Conclusions
 The use of these techniques are very useful in the
clinic, as knowing exactly what is efective or mutated
in patients with congenital defects in neutrophils,
could eventually be given a better treatment.

34. Conclusions
 The importance of understanding the molecular level
of the diseases that have been around us troughout
our lives is evident. The ability to achieve that
specific level, will in the future recognize new
methods of diagnosis and more effective treatments.

35. Conclusions
 It's amazing to understand that the body is
completely perfect and that a minimum burst of
normal functions, causes imbalance. For example
neutrophil defects associated with VPS45 mutations
cause a new immunodeficiency syndrome that involves
deterioration in the function of neutrophils.

36. Discussion
Author Theory Yes or no
Malech HL One component of this
system, the neutrophil,
plays a particulary
prominent role in the
defense against bacterial
and fungal infections.
Yes
Zucker- Franklin D Congenital neutropenia:
and intrisic cell defect
demonstrated by
electron microscopy of
soft agar colonies.
Yes

37. Discussion
Author Theory Yes or No
Kinchen JM One critical component
of the endocytic pathway
in neutrophils involves
vacuolar sorting (VPS)
Yes
Rahajeng J Common and distinc
roles for the binding
partners Rabenosyn-5
and VPS45 in the
regulation of endocytic
trafficking in mammalian
cells.
Yes

38. Mapa

39. Mapa

40. GRACIAS