Daniela Jaramillo Estefanía Orozco

1. ESTEFANÍA OROZCO BETANCUR
DANIELA JARAMILLO LONDOÑO

2. Cancer
 Cancer is a heterogeneous disease
affecting all age groups, nationalities, and
socioeconomic classes
 Cancer is a disease in which cells have
altered genetic processes as a result of
mutations. Mutations lead to gain or loss
of genetic functions that permit abnormal
proliferation, failure to undergo apoptosis
leading to cellular accumulation, or both.

3. OVARIAN CANCER
Malignant ovarian tumors are the leading cause of death from reproductive
tract cancer. The wide range of types and patterns of ovarian tumors is due
to the complexity of ovarian embryology and differences in tissues of origin.

4. Signs and Symptoms
 Asymptomatic or experience only mild nonspecific gastrointestinal
symptoms or pelvic pressure.
 Women with advanced malignant disease may experience abdominal
pain and bloating, and a palpable abdominal mass with ascites.

5. 1. PIK3CA
 The protein encoded by this gene
represents the catalytic subunit, which
uses ATP to phosphorylate
PtdIns(Phosphatidylinositol), PtdIns4P
and PtdIns(4,5)P2. This gene has been
found to be oncogenic and has been
implicated in cervical cancers.
GENES

6. 2. PI3K
 Phosphoinositide 3-kinases play an important role in a variety of
fundamental cellular processes and can be divided into three main classes,
defined by their substrate specificity and domain architecture.
Signaling pathway is critical in many aspects:
 growth and cell survival
 Metabolism
 Protein synthesis
 Transcription

7. 3. PARP
 Nuclear enzyme poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)
 It is part of the family of enzymes involved in various activities in response
to DNA damage in response to environmental stress
 PARP inhibitors show response in BRCA1/2 mutation carriers in 30-45%

8. Ovarian cancer
Caused by
mutations
in DNA symptoms
Abdominal pain
Bloated
abdomen
Diagnosis
Internal
examination
CA125 blood test
Ultrasound
CT scan
Treatments
Surgery
Chemotheraoy
Gene therapy
Radiotherapy
• Epithelial
tumors ( *)
• Germ cell
tumors
• Stromal
tumors
Benign
Malignant
Types of
tumors

9. Objective
Combined inhibition of PI3K and PARP has been shown to be effective in
the treatment of preclinical models of breast cancer and prostate cancer
independent of BRCA or PIK3CA mutational status. However, the knowledge
about this combination treatment in ovarian cancer is limited. The aim of this
study was to evaluate the therapeutic effect of PI3K inhibitor BKM120 and
PARP inhibitor Olaparib on ovarian cancer cell lines bearing wild-type
PIK3CA genes.

10. Métodos
1. Cultivo celular
Se utilizaron diferentes líneas celulares
 OVCAR8 tiene BRCA1metilado
 OVCAR5 tiene wild-type BRCA1/2
 OVCA433 tiene mutación deletérea de BRCA2
Se mantuvieron en medios estables.

11. 2. Ensayo clono génico
Evaluar los efectos de las drogas sobre la proliferación de células
cancerígenas
Evaluar si una célula es capaz de dividirse y formar una colonia luego de
haber sido expuesta a un tratamiento.

12. 3. Ensayo inhibidor del crecimiento y análisis de combinación de drogas
Evaluar viabilidad celular mediante un kit de conteo celular, se expresa
como la fracción entre la inhibición del crecimiento celular por acción de la
droga y las células tratadas durante el procedimiento.

13. 4. Inmunoblot y aislamiento de proteínas
Las proteínas procedentes de extractos celulares son separadas por
electroforesis en gel según su tamaño, por medio de la técnica SDS-PAGE
poliacrilamida gel electroforesis. Tras la electroforesis las proteínas se
transfieren a un filtro, que se incuba con anticuerpos que reaccionan con la
proteína de interés. El anticuerpo es identificado por varios métodos y por
consecuente la proteína se ubica.

14. 5. Análisis de apoptosis
Análisis de la cantidad de apoptosis producida en las células cancerígenas
ováricas utilizando tripsina, una coloración y yoduro de propidio (indicador
de células muertas), luego se hace análisis por citometría de flujo que
permite conocer la información simultánea de varios parámetros de cada
una de las células analizadas.

15. 6. Ensayo cometa
Usada para medir el daño en el ADN de las células.
Se demuestra que el uso de una solución de lisis con proteinasa K durante
3 h y 10 min de corrido electroforético, permite obtener cometas
cuantificables de oocitos bovinos madurados in vitro que pueden ser
utilizados en estudios genotóxicos en este sistema celular.

16. 7. Inmunofluorescencia
Usado para la determinación de proteínas, drogas y hormonas por la unión
del anticuerpo a una molécula de fluorocromo
 Isotiocianato de Fluoresceína
 Rodamina
 Cianina
 Cumarina
Se trata de sustancias que absorben la luz a una longitud de onda mayor
de 200 a 400nm y emiten una luz de onda de 400 a 700 nm

17. 8. Transcripción reversa cuantitativa de la cadena de la polimerasa
Es una técnica de amplificación directa de un gen o un fragmento de DNA o
indirecta de un RNA, presentes en mezclas de muy diversas fuentes.
Se basa en:
1. La desnaturalización del DNA para dar hebras sencillas,
2. hibridación especifica de la hebra sencilla con oligonucleótido(Primer) y
3. la replicación de la hebra sencilla por una DNA polimerasa a partir del
oligonucleótido anterior como cebador.

18. 9. Información del paciente, preparación de tejido y cultivo ex vivo del tejido
con tumor del paciente
1. presentación del caso de una paciente (Ca 1rio de grado severo)
2. Ovarectomía bilateral
3. Obtención del tejido con tumor para el aislamiento del total de RNAs y
su uso como plantillas para la reacción de la transcripción reversa
usando un kit para generar cDNAs
4. Cultivo ex vivo

19. 10. Histología e inmunohistoquímica
Es la identificación de un tejido(in situ) por medio de una interacción
especifica entre un antígeno y un anticuerpo donde el anticuerpo ha sido
visiblemente marcado, la célula se colorea para demostrar la presencia y
localización celular de una molécula de interés.
Fundamento:
Se hizo con la finalidad de saber el impacto
del tratamiento en la habilidad para reparar
las rupturas del DNA por parte de las
células cancerígenas de ovario

20. RESULTADOS
Células tratadas con BKM120
por 48 horas, análisis western
blot en las proteínas pAKT y
pS6RP. Vinculina como control
Células cancerígenas
fueron tratadas con los
inhibidores por 10 días

21. Efectos del BKM120 y Olaparib como agentes
individuales y en combinación en la
supervivencia de las células del cáncer de
ovario.
Análisis Western Blot.
El tratamiento
generó
incremento de
Cleaved PARP
que es un
marcador de
apoptosis activa

22. La (+) de ERK está relacionado con la regulación
a la baja de BRCA1/2 y BKM120 no tuvo efecto
y en el OVCAR8 no se expresó porque está
metilado
BKM120 (solo y en
combinación) redujo la
expresión de pS6RP
También redujo la
pAKT en OVCAR5 Y 8

23. Efectos del BKM120 y el Olaparib como
agentes individuales y en combinación en
la respuesta al DNA dañado en las células
cancerígenas
Ensayo cometa: intensidad para identificar
DNA dañado
Inmunofluorescencia

24. Integridad
Apoptosis

26. DISCUSSION
AUTHOR WHAT THEY SAID YES OR NO
C.K. Sun, F. Zhang, t. Xiang, Q. Chen,
T.K. Pandita, Y. Huang, et al
“It has been shown recently that
phosphorylation of S6RP confers PARP
inhibitor resistence in BRCA- deficient
cancer”
A. Juvekar, L.N Burga, H. Hu, E.P
Lunsford, Y.H Ibrahim, J. Balmana, et al
“ERK- dependent BRCA 1/2
downregulation has been shown to
account for sensitivity to PARP inhibition
in BRCA proficient triple negative breast
cáncer”
D. Wang et al “Recent study with PIK3CA mutant
ovarian cancer cells and PIK3CA mutant
ovarian cancer cells revealed that
irrespective of BRCA or PIK3CA
mutational status, ovarian cancer cells
with downreg of phosphorylated S6RP
following BKM120 or mTOR inhibitor
RAD001 exhibited impaired DNA damage
response and compromised homologous
recombination repair and were responsive
to PARP inhibition”

27. AUTHOR WHAT THEY SAID YES OR NO
Y.H Ibrahim et al, A. Juvekar et
al
“ Combined inhibition of PI3K
and PARP effectively blocked
cell proliferation and survival in
three in vitro ovarian cancer cell
line models and one patient-
derived ex vivo culture model of
ovarian cancer with wild type
PIK3CA genes. In accordance
with previous findings from
preclinical studies of breast
cancer”

28. Conlusions
 Combined therapy is promising for diverse types of cancers due to the posible
synergistic effect, therefore investigation can make a big impact on which cancer
pathways may be suppresed in a better way than others.
 The study of more combinations of many inhibitors of the cancer signaling
pathway may lead to diverse posibbilities in cáncer treatment according to the
activation or inhibition of certain genes implicated in cancer effect wich may be
different in every patient.
 The use of predictive biomarkers such as phosphorylated S6RP can be
promising to determine cell response to the cáncer treatments, therefore used
as a complement to determine the efficacy of the correspondant treatment.

29.  This therapy may benefit not only ovarian cáncer but also other cáncer
associated genetic alterations, not limited to those with BRCA or PI3K
alterations.