1. Luis Fernando Sosa Tordoya
Carrera de Bioquímica
Instituto SELADIS-FCFB-UMSA
fersosat@yahoo.es
lfsosa@umsa.bo
La Paz – Bolivia
2013
AVANCES EN LOS PROCESOS DE
REPROGRAMACION CELULAR A
PARTIR DE CELULAS
DIFERENCIADAS

2. En el 2006 Kazutoshi Takahashi y Shinia Yamanaka dieron a conocer que
las células madre pluripotentes podían ser inducidas a partir de células
diferenciadas.
“Somatic cells can be
reprogrammed into the
embryonic state, 1962”
Shinya Yamanaka
Kazutoshi Takahashi
Jhon Gurdon
Ph.D. in pharmacology
Center for iPS Cell Research
and Application (CiRA)

3. Hallazgos trascendentales que condujeron al desarrollo de las IPCS

4. La reprogramación celular a un estado similar a de células madres
embriónicas fue conseguida gracias uso de 4 /24 factores de
transcripción: OKSM (Oct3/4, Klf4, Sox2 y cMyc).
EL ACTO MAGICO DE GENERAR CELULAS MADRE PRURIPOTENTES
INDUCIDAS: Muchos conejos en el sombrero

5. Las células madres embriónicas (ESC) tienen la capacidad de crecer
indefinidamente mientras mantienen su pluripotencia (se diferencian en las
tres líneas germinales endodermo, mesodermo y ectodermo) para formar
todos los tipos celulares.
EpidermisEpitelio. Cartílago Músculo Tejido Neural
ESC

6. Hasta antes del descubrimiento de las iPCS se podían obtener células
madre embriónicas a partir de animales de experimentación, a partir de
embriones humanos.
Impedimento ética, En el 2001, el Pdte. George Bush y al Papa Juan Pablo II
establecieron claramente que la destrucción de embriones con propósito de
generar líneas celulares de ESC viola los principios bioéticos

7. Paciente
Células Neurales
Células B
Células
cardiacas
Hepatocitos
Terapia celular
Modelos de enfermedades para estudios de
drogas
Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc

8. Neurona
motora muerta
Neurona motora degenerada
Atrofia Muscular
Enfermedad de las Neuronas Motoras
No hay tratamiento efectivo, porque no existe un buen modelo
para estudiar la enfermedad

9. Enfermedad de las Neuronas Motoras

10. Potencial de las iPSC
Tomar tejido somático
del paciente
Crear línea
somática del
paciente
Guardar muestra
del paciente
Introducción de factores
de reprogramación Expansión y
caracterización
Tomar tejido somático
del paciente
Diferenciación in vitro del tipo celular deseado
Modificación genética
Neuronas Miocitos Cel. Hematopoyéticas
Hepatocitos Adipocitos
Cel. Endoteliales
iPSC del paciente
modelo específico
(seguro)

11. Las iPSC que llegaron a producir eran fenotípicamente
indistinguibles de las ESC.
ES=Embrionic Stem Cell, NTERA-2=Human Fibroblast, HDF=Human Dermal Fibroblast.

14. Cel.
Somáticas
pMX-PlatE/Flugene
Cel. Somáticas
Oct3/4, Klf-4,
Sox2,c-Myc
10 iPSC
1x104
HDF La relación
puede variar
20%40%
iPSC iPSC
Otros retrovirus?
Riesgo tumoral
20 sitios de
reintegración viral

15. Cel.
Somáticas
Retrovirus?
Expresión de un gen de resistencia a droga
como marcador de pluripotencia.
Modificación genética de la célula huésped
Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:

16. Cel.
Somáticas
Retrovirus?
Requiere la integración viral de transgenes (C-
Myc) en el genoma
Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:
transducen en células
humanas mas eficientemente
que los retrovirus.
?
SendaiLentivirus Adenovirus
transducen en células
que no se dividen
tumores

17. Cel.
Somáticas
Retrovirus?
Requiere la integración viral de transgenes en el
genoma
Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:
?
SendaiLentivirus Adenovirus
Infectan naturalmente
a hepatocitos
Menos sitios de integración en
fibroblastos que retrovirus.

18. Cel.
Somáticas
Retrovirus?
Requiere la integración viral de transgenes en el
genoma
Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:
?
SendaiLentivirus Adenovirus
No patogénico
en humanos
Alta eficiencia de
reprogramación.
(no integrante)

19. Cel.
Somáticas
Retrovirus?
Modificación genética de la célula huésped
Requiere la integración viral de transgenes
en el genoma
Reactivación de c-Myc en iPSC predispone a la
formación de tumores.
n-Myc una alternativa ?
Problemas sustanciales que implica el uso de retrovirus:

20. Con Lentivirus, las iPSC fueron similares a las ESC en cuanto a
morfología, expresión de marcadores de superficie estatus de metilación
en la región promotora de los genes asociados a pluripotencia e inducción
de teratomas.
fluorescent
protein
puromycin
Reportero Nanog

21. Con adenovirus se evidenció que las iPSC no expresaban transgenes de
integración de los adenovirus

22. El virus Sendai (virus RNA(-) sirve especialmente para reprogramar LT en
casos de inmunodeficiencias debidas a este tipo celular, o para el
desarrollo de marcadores genéticos para futuras aplicaciones en
medicina regenerativa.

23. Bryce Carey reportó el uso de vectores policistrónicos para reprogramar
células somáticas humanas.
Demostró que se podía generar células madre paciente-específicas
superando los problemas éticos y prácticos que se presentan al
momento.
El apthovirus “virus de la enfermedad de pies y boca – FMDV” son
vectores policistrónicos que permiten integrar información en los
ribosomas. Las secuencias 2A tienen afinidad por el sitio IRES en los
ribosomas.
Reportaron que una simple copia viral es suficiente para reprogramar ya
sea células somáticas adultas o embrónicas de ratón. Además
demostraron que el sistema podía funcionar en células humanas.
Luego, se demostró de los poli 2A afectan la producción de muchas
proteinas (desventaja).

25. El uso de virus y plásmidos para reprogramar células en los experimentos
hasta aquí presentados tienen una eficiencia que varía del 0,0001 al 0,5%)
En general se observó que el uso de vectores policitstrónicos reprogramaba
las células de tal manera que eran mucho más similares a las ESC.
Un gran hallazgo en la reprogramación celular fue el uso de los transposones
como piggyBac.
Los trasnposones eliminaban la necesidad de instalaciones especializadas de
contención biológica o la producción de stocks de altos títulos de virus con
potencial patogénico.
Los trasnposones ofrecen una baja eficiencia en la reprogramación y también
implica una potencial toxicidad genómica.

26. Otros vectores no integradores estudiados son los episomas
(autoreplicables) y vectores minicírculos.
El uso de miRNA que codifique OKSM han mostrado tener alta eficiencia
en la reprogramación con efectos adversos mínimos.

27. Al usar RNA se previene el uso de DNA o cDNA
Se dosifican de mejor manera los constituyentes del coctel obteniendo una
mejor tasa de reprogramación.

30. Yang Zhao, de 10000 moléculas analizadas encontró un coctel que favorece
la reprogramación
“son moléculas permeables, no inmunogénicas, son costo efectivas,
fácilmente sintetizables preservadas y estandarizadas. Activan proteinas
especificas y pueden ser modulables en su concentración”
100% de viabilidad de las CiPSC a los 6 meses, rendimiento mayor al 0,2%.
Los ratones transgénicos vivieron y ya tiene sus crías.

32. PRIMER ENSAYO CLÍNICO CON iPSC

33. A tu Memoria