Cultivos Celulares Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular
Objetivos <ul><li>-Equipo básico de un laboratorio de cultivo celular </li></ul><ul><li>-Cultivos primarios y líneas estab...
Microscopio Invertido <ul><li>Seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicación, contaminación. </li></ul><ul><li>Contro...
Botellas y Placas de Cultivo
Puntos Importantes <ul><li>Esterilidad </li></ul><ul><li>Asepsia </li></ul><ul><li>Hábito de trabajo </li></ul>
Cultivos Primarios (El principio de la historia.....)   <ul><li>      A-  Aislamiento del tejido </li></ul><ul><li>     B-...
Preparación cultivos
Cultivos secundarios y líneas estables <ul><li>Si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-siembran (sub...
Selección de la línea estable
Líneas celulares estables <ul><li>Control del entorno celular </li></ul><ul><li>Homogeneidad celular </li></ul><ul><li>Con...
Medios de Cultivo: Medios Base <ul><li>Medios base:  Eagle’s Basal Medium, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), RPMI...
Medios de Cultivo: Aditivos <ul><li>Antibióticos:  estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras...
Propiedades físico-químicos del Medio CO 2 :  Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO 3 - ] pH ..................
Test de medio completo con suero <ul><li>Previamente a la realización de experimentos los medios deben ser probados a dife...
Elección del medio de cultivo adecuado a cada línea celular <ul><li>Se deben realizar diferentes pruebas con varios medios...
Conceptos básicos en el mantenimiento de una línea estable <ul><li>Subcultivo </li></ul><ul><li>Confluencia </li></ul><ul>...
¿Qué son y cómo se realizan los subcultivos? <ul><li>Objetivos:  </li></ul><ul><li>Propagación de la línea celular </li></...
Curva de Crecimiento (líneas estables): Fases del cultivo <ul><li>Fase de latencia  (período lag). Fijación al sustrato e ...
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Cultivos Celulares

  1. 1. Cultivos Celulares Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular
  2. 2. Objetivos <ul><li>-Equipo básico de un laboratorio de cultivo celular </li></ul><ul><li>-Cultivos primarios y líneas estables </li></ul><ul><li>-Preparación del medio de cultivo </li></ul><ul><li>-Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad </li></ul><ul><li>-Rutina en el mantenimiento de la línea celular estable </li></ul><ul><li>-Congelación y almacenamiento de las líneas celulares </li></ul>Puntos que deben ser asimilados
  3. 3. Microscopio Invertido <ul><li>Seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicación, contaminación. </li></ul><ul><li>Control sobre cambios morfológicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc. </li></ul>
  4. 4. Botellas y Placas de Cultivo
  5. 5. Puntos Importantes <ul><li>Esterilidad </li></ul><ul><li>Asepsia </li></ul><ul><li>Hábito de trabajo </li></ul>
  6. 6. Cultivos Primarios (El principio de la historia.....) <ul><li>     A- Aislamiento del tejido </li></ul><ul><li>    B- Disección/disgregación </li></ul><ul><li>C- Cultivo celular en recipiente </li></ul><ul><li>(Placa Petri) (Cultivo primario) </li></ul>Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.
  7. 7. Preparación cultivos
  8. 8. Cultivos secundarios y líneas estables <ul><li>Si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario. </li></ul><ul><li>La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinará qué células se desarrollarán. </li></ul><ul><li>Las líneas estables son las que se obtienen por sub-cultivo y selección de cultivos secundarios. También se pueden obtener a partir de tejidos tumorales. </li></ul>
  9. 9. Selección de la línea estable
  10. 10. Líneas celulares estables <ul><li>Control del entorno celular </li></ul><ul><li>Homogeneidad celular </li></ul><ul><li>Conocimiento del tipo celular </li></ul><ul><li>Economía </li></ul>Ventajas Desventajas <ul><li>Falta de diferenciación </li></ul><ul><li>Inestabilidad de la línea (mutaciones DNA) </li></ul>
  11. 11. Medios de Cultivo: Medios Base <ul><li>Medios base: Eagle’s Basal Medium, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), RPMI1640, etc. </li></ul><ul><li>Contienen: Hidratos de Carbono, ácidos grasos esenciales y otros lípidos, aminoácidos, sales minerales, oligoelementos. </li></ul>*Cada línea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio
  12. 12. Medios de Cultivo: Aditivos <ul><li>Antibióticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos) </li></ul><ul><li>Tampón pH: Hepes, bicarbonato, etc. </li></ul><ul><li>Indicador pH. </li></ul><ul><li>Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2-50%). </li></ul><ul><li>Aditivos específicos: Suplemento de piruvato, suplemento de glucosa, etc. </li></ul>
  13. 13. Propiedades físico-químicos del Medio CO 2 : Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO 3 - ] pH .............................................................(7.0-7.7) Osmolaridad .............................................(290-320) mOsm/Kg Viscosidad ................................................ Suero Temperatura ............................................. 37ºC (mamífero) (aves: 38,5ºC; epitelio de ratón: 33ºC; insectos: 28ºC)
  14. 14. Test de medio completo con suero <ul><li>Previamente a la realización de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles. </li></ul><ul><li>Posible Contaminación </li></ul><ul><li>Niveles de Proliferación Celular (eficiencia) </li></ul>
  15. 15. Elección del medio de cultivo adecuado a cada línea celular <ul><li>Se deben realizar diferentes pruebas con varios medios de cultivo en la elección del medio más adecuado a las características de nuestra línea. </li></ul><ul><li>Las pruebas consisten en la realización de diferentes curvas de crecimiento </li></ul>
  16. 16. Conceptos básicos en el mantenimiento de una línea estable <ul><li>Subcultivo </li></ul><ul><li>Confluencia </li></ul><ul><li>Tiempo de duplicación </li></ul><ul><li>Criogenización </li></ul><ul><li>Ciclo celular: Fases G 1 ,S,G 2 ,M y G 0 </li></ul>
  17. 17. ¿Qué son y cómo se realizan los subcultivos? <ul><li>Objetivos: </li></ul><ul><li>Propagación de la línea celular </li></ul><ul><li>Producción de células para la experimentación </li></ul><ul><li>Usualmente se realizan al llegar a c onfluencia. </li></ul><ul><li>Evitar que el medio de cultivo esté agotado. </li></ul>
  18. 18. Curva de Crecimiento (líneas estables): Fases del cultivo <ul><li>Fase de latencia (período lag). Fijación al sustrato e inicio del ciclo celular. </li></ul><ul><li>Fase de crecimiento exponencial . El número de células se duplica aproximadamente cada 24 horas. </li></ul><ul><li>Fase de confluencia . Las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por contacto; suspensión: consumo del medio). </li></ul><ul><li>Fase de muerte . Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo. </li></ul>

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