Hemoderivados (V): Productos de origen recombinante
1. Hemoderivados (V):
Productos de origen recombinante
XVII Curso de Introducción a laXVII Curso de Introducción a la
farmacoterapia con hemoderivados
H. Vall d´Hebron, 22 - 25 Abril 2013
Soledad Ruiz
Marketing Manager BioPharma & Vacunas
Baxter
2. Es la técnica mediante la cual se aislan y
transfieren secuencias de ADN altamente
específicas (genes) de un organismo y se
¿En qué consiste la tecnología recombinante?
específicas (genes) de un organismo y se
recombinan con el ADN de otro
3. Productos biológicos versus productos sintéticos convencionales
FVIII: Glicoproteína con 6 dominios
Gen Factor VIII localizado en cromosoma X (Xq28)
2,351 aminoácidos
MW 270,000 Dalton
Aspirina
Ibuprofeno
5. Producto Origen Indicación
FVIII
Plasmático
Recombinante
Hemofilia A
FVIII+FVW Plasmático
Enfermedad de von Willebrand
Hemofilia A
FIX
Plasmático
Recombinante
Hemofilia B
Complejo protrombina
Productos e indicaciones
Complejo protrombina
activado
Feiba®
Plasmático Hemofilia con inhibidor
FVII activado
Novoseven®
Recombinante
Hemofilia con inhibidor
Hemofilia adquirida
Déficit FVII
Trombastenia de Glanzmann con
anticuerpos anti-plaqueta
FXIII
Plasmático
Recombinante
Déficit congénito de FXIII
11. April 2008 mark the 55th anniversary of Dr. James Watson's and Dr.
1962
April 2008 mark the 55th anniversary of Dr. James Watson's and Dr.
Francis Crick's discovery of the double helix. In March of 1953, after
many years of attempting to understand and elucidate the DNA
structure they proposed the complementary double-helical
configuration. Subsequently, Dr. Watson, Dr. Crick and Dr. Maurice
Wilkins received the Nobel Prize in 1962 for "their discoveries of the
molecular structure of nucleic acids and its significance for information
transfer in living material.”
12. 1984
Técnica de hibridomas para la
elaboración de anticuerposelaboración de anticuerpos
monoclonales (Köler y Milstein 1975)
13. ¿En qué consiste la tecnología recombinante?
- Se inicia al aislar el gen de interés
- Se obtiene un vector (plásmido), es decir un
fragmento de DNA con capacidad para crecer
de una forma independiente
- El gen se inserta en el vector, y queda
integrado en él: plásmido recombinante (DNA
recombinante)
14.
15. ¿En qué consiste la tecnología recombinante?
- Se inicia al aislar el gen de interés
- Se obtiene un vector (plásmido), es decir un
fragmento de DNA con capacidad para crecer
de una forma independiente
- El gen se inserta en el vector, y queda
integrado en él: plásmido recombinante (DNAintegrado en él: plásmido recombinante (DNA
recombinante)
- Se clona para obtener cantidades suficientes
de DNA
- Se inserta en una célula huésped que
sintetizará la proteína extraña (a ella) a partir
de este DNA recombinante
16. Transferencia del gen de FVIII (y FvW) en la célula de mamífero
Molécula ADN
Gen FvW
Cadena especial de ADN
(Plásmido)
Gen Factor VIII
Célula huésped
Núcleo
Plásmido se úne al ADN
de la célula huésped
Plásmido
25. Estructura del FVIII humano
COOH
(Carboxl-Terminal)BPéptido de alto peso molecular
(Amino-Terminal) NH2
A1 A2
Punto de escisión proteolítica
Cadena pesada
COOHPéptido de bajo peso molecular A3 C1 C2
80 kd
90 kd
Metal++
Cadena ligera
26. Factor VIII se activa in vivo mediante la escisión del dominio B
Péptido de alto peso molecular
(Amino-Terminal) NH2
A1 A2
Punto de escisión proteolítica
COOH
(Carboxl-Terminal)B
COOHPéptido de bajo peso molecular A3 C1 C2
80 kd
90 kd
Metal++
27. Las funciones del dominio B
• No función hemostática
• Papel en el transporte intracelular
• Favorece la secreción de factor VIII
COOH
(Carboxl-Terminal)B
Dorner et al. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:7429-32 ; Pipe et al. JBC 1998; 273: 8537-8544 ; Kaufman et al. Blood Coagul
Fibrinolysis;1997 Dec;8 Suppl2:S3-14 ; Moussalli et al. JBC 1999; 274: 32539-32542 ; Pipe SW. Haemophilia 2009; 1–10
• Control en el plegamiento de la proteína de factor VIII
– Interacción con las proteínas chaperonas
• Revisiones recientes sobre las funciones del dominio B, destacan
diferentes vías por las que la deleción del dominio B podría afectar
a la actividad de FVIII en sangre
28. Transferencia del gen de FVIII (y FvW) en la célula de mamífero
Molécula ADN
Gen FvW
Cadena especial de ADN
(Plásmido)
Gen Factor VIII
Célula huésped
Núcleo
Plásmido se úne al ADN
de la célula huésped
Plásmido
29. CHO: Chinese Hámster Ovary cells (Células de Ovario de Hámster Chino)
BHK: Baby Hámster Kidney cells (Células de riñón fetal de hámster)
30. 1er Paso: Desarrollo de una línea celular mamífera
Para sintetizar moléculas biológicas complejas, como el FVIII humano, son necesarios
sistemas celulares biológicos
31. Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO)
• Línea celular ampliamente estudiada y bien caracterizada (no procedente de
línea celular tumoral)
• Se utiliza para producir múltiples proteínas recombinantes:
– EPO (anemia), Interferon-β1a (esclerosis múltiple), folitropina-ß (infertilidad),
Dnasa (fibrosis quística)
Koplove. Ann Hematol 1994; 68: S15-S20
Goochee et al. Biotechnology 1991; 9:1347-1355
Hotchkiss et al. Thromb Haemost 1988; 60: 255-61
• Capaz de realizar todas las modificaciones postranslacionales y
postransduccionales del Factor VIII
• Resistente a infección por la mayoría de virus humanos
(Coronavirus, Sarampión, Influenza, Herpes, Rhino viruses...etc.)
• Posibilidad de producción de grandes volúmenes a gran escala
32. La selección del clon celular productor de FVIII se
basa en ciertos criterios clave
GD 7/8 GE 5/6 GD 8/6
... 600 clones
Programa de selección de clones (Tests)
• Homogeneidad de la población
• Producción robusta de FVIII y FvW
• Perfil de Western Blot
33. Células productoras de rFVIII
Inmunofluorescencia FVIII
W. Mundt, Baxter BioScience.
Clon rAHF-PFM
34. Nutrientes necesarios para mantener las células vivas:
Azúcares
Sales
Aminoácidos
Vitaminas
Selección del Medio de Cultivo Celular
Aditivos que ayudan al crecimiento celular:
Suero ternera fetal 1950s
Insulina, albúmina, aprotinina, transferrina (bovina) 1990s
Albúmina humana e Insulina recombinante finales 1990s
Medio vegetal, sin proteínas humanas (ADVATE) 2004
Evolución
35. Características de los concentrados actuales de FVIIIr
Utilización de proteínas derivadas de plasma humano
Biosíntesis
en cultivo
celular
Purificación Formulación
Primera
Presente Presente Presente
Generación
Presente Presente Presente
Segunda
Generación
Presente Presente Ausente
Tercera
Generacion AusenteAusente AusenteAusente AusenteAusente
36. Desarrollo de:
-Bancos Celulares Maestros (“Master Cell Bank“) y
-Bancos Celulares de Trabajo (“Working Cell Bank“)
Minus
135°C
Células CHO idénticas
con gen de FVIII insertado en
sus genomas
37. Cada fermentación comienza con la reanimación de las
células procedentes del Working Cell Bank
1 ml
(congelado)
70 ml Incubación
(37°C)
38. Viales del Working Cell Bank para comenzar el cultivo celular
*Las fotografías presentadas se tomaron en la planta de Baxter para la fabricación de ADVATE
(Neuchatel, Suiza)
41. Expansión de la solución celular
Incubación en botellas rotatorias a 37ºC
42. Proceso de fermentación FVIII
• Los cultivos celulares crecen en las botellas rotatorias
• Al llegar a una densidad determinada, se aúnan y se
utilizan para comenzar la fermentación en biorreactores
• 3 pasos de fermentación en biorreactores:
1. Biorreactor 40 l
2. Biorreactor 320 l
3. Biorreactores 2500 l (2 X)
44. Proceso de Fermentación CHEMOSTAT
Medio Fresco Sobrenadante
- Densidad celular
- Viabilidad celular
- pH
- Gasto de oxígeno
- Mezclado / agitación
Medio Fresco
estéril
Sobrenadante
celular
cosechado
continuamente
BIORREACTOR
en modo
Chemostat
Monitorización constante de:
45. Densidaddecélulas[OD]
Extracción del sobrenadante celular
con factor VIII recombinante
c
Alimentación por perfusión continua
Tiempo [días]
Densidaddecélulas[OD]
1 2 3 4 5 6 180
a
b
a fase de latencia b fase logarítmica c fase estacionaria
Fase de
crecimiento
46. Proceso de Cultivo Celular continuo y estable
DensidadCelular
Tiempo
DensidadCelular
Proceso de Alimentación por lotes Proceso Chemostat
47. El proceso de fabricación de FVIIIr consiste en 3 pasos principales:
1. Biosíntesis de FVIII en cultivo celular en biorreactores
2. Purificación de FVIIIr mediante distintos pasos cromatográficos2. Purificación de FVIIIr mediante distintos pasos cromatográficos
3. Formulación final, llenado y liofilización
48. Purificación de FVIIIr mediante cromatografía
(Inmunoafinidad y cromatografía de intercambio iónico)
49. Cromatografía de
inmunoafinidad /
Ligandos sintéticos
Cromatografía de
intercambio catiónico
Proceso Purificación
Línea celular de hibridoma para la producción de
anticuerpos monoclonales anti-FVIII adaptada a
un medio vegetal libre de proteínas
FVIII
Inactivación viral
Cromatografía de
intercambio aniónico
Tratamiento solvente/detergente S/D
(TNBP+TritonX-100/Tween 80)
(NF)
El eluído es congelado y almacenado a –80ºC
Para la formulación final, llenado y liofilización
50. Recogida del FVIIIr purificado
El “bulk“ de FVIIIr se
almacena a -80°C
hasta la formulación
final
55. Características de los actuales concentrados de FVIIIr
Utilización de material derivado de plasma humano
Biosíntesis en
cultivo celular Purificación Formulación
Primera
Presente Presente Presente
Primera
Generación
Presente Presente Presente
Segunda
Generación
Presente Presente Ausente
Tercera
Generacion AusenteAusente AusenteAusente AusenteAusente
56. LÍNEA CELULAR CHO BHK CHO CHO
MOLÉCULA FVIII FVIII COMPLETO FVIII COMPLETO BDD-FVIII FVIII COMPLETO
UTILIZACIÓN DE
ALBÚMINA
SI SI NO NO
INACTIVACIÓN Y
RECOMBINATETM
3ª GENERACIÓN2ª GENERACIÓN1ª GENERACIÓN
FACTOR VIII
INACTIVACIÓN Y
ELIMINACIÓN
VIRAL
CROMATOGRAFÍA SD SD + NF SD
CROMATOGRAFÍA
1. Cromatografía
de intercambio
iónico
2. Cromatografía
inmunoafinidad
1. Cromatografía
de intercambio
iónico
2. Cromatografía
inmunoafinidad
1. Cromatografía
de intercambio
iónico
2. Cromatografía
con ligandos
sintéticos
(químicos)
1. Cromatografía
de intercambio
iónico
2. Cromatografía
inmunoafinidad
EXCIPIENTES
Aminoácidos
Albúmina
Cloruro sódico
Sacarosa
Aminoácidos
Cloruro Sódico
Sacarosa
Aminoácidos
Cloruro Sódico
Trehalosa
Manitol
Aminoácidos
Cloruro Sódico
57. Ovario de hamster chino
Cromatografía y
nanofiltración
No presencia de albúmina
nanofiltración
1.Cromatografía de
intercambio iónico
2.Cromatografía de
inmunoafinidad por
anticuerpos monoclonales
murinos
Aminoácidos, sacarosa y
Tween 80
58.
59. FVIIa Plasmático y FVIIa Recombinante (rVIIa)
• Estructura protéica idéntica (aminoácidos,
péptidos).
• Igual estructura de hidratos de carbono.• Igual estructura de hidratos de carbono.
• Propiedades ezimáticas idénticas.
60. Indicaciones del rFVIIa
• Registros: EU (96), USA (99), Japón (00)
• Hemofilia congénita con inhibidor
• Hemofilia adquirida• Hemofilia adquirida
• Déficit congénito de factor VII
• Trombastenia de Glanzmann
61. Próximos factores recombinantes en el mercado
Factor IX recombinante (FIXr)
MOLÉCULA COMPLETA
TERCERA GENERACIÓN
BAXTER
Factor VIII recombinante (FVIIIr)
DOMINIO B TRUNCADO
TERCERA GENERACIÓN
NOVO-NORDISK
Factor VIII recombinante (FVIIIr)
MOLÉCULA COMPLETA
TERCERA GENERACIÓN
BAYER
Factor VIII recombinante (FVIIIhr)
TERCERA GENERACIÓN
OCTAPHARMA
Factor XIII recombinante (FXIIIr) TERCERA GENERACIÓN NOVO-NORDISK
Factor VIII recombinante (FVIIIhr)
TERCERA GENERACIÓN
CÉLULAS HUMANAS
OCTAPHARMA
Factor VII recombinante activado
(aFVIIr)
TERCERA GENERACIÓN BAXTER
Factor von Willebrand
recombinante (FvWr)
TERCERA GENERACIÓN BAXTER
Factor VIII recombinante porcino
(OBI-1)
Molécula de FVIII porcina
de origen recombinante
BAXTER
62. CRITERIOS DE UTILIZACIÓN DE LOS FACTORES
ANTIHEMOFÍLICOS
(Fundación Victoria Eugenia, 2006)
Dado su perfil de eficacia y seguridad se recomienda el paso progresivo
del tratamiento de la hemofilia a concentrados de FVIII o FIX de origen
recombinante, en modalidades terapéuticas habituales (a demanda,
profilaxis primaria, profilaxis secundaria)
“Es particularmente importante, en temas de seguridad, que no creemos una
situación en la que pudiera peligrar la disponibilidad de derivados de plasma para
aquellos que lo necesiten”
(Goldfard B. National Hemophilia Foundation, Hemacare 2007; 12:15-22)
68. Inhibidores: Estudio RODIN
OBJ: Evaluar si el tipo de FVIII y el
intercambio de productos puede
estar asociado al incremento de
inhibidores en PUPs con HAG
MET: Recogida retrospectiva de 75 DEs
en 574 ptes HAG nacidos entre
2000-20102000-2010
RESULTADOS:
1. FVIIIr y FVIIIdp confieren igual riesgo de
desarrollo de inhibidores
2. Contenido FvW y cambio entre productos
no estuvo asociado con riesgo de
desarrollo de inhibidor
3. Inesperadamente, los FVIIIr de 2ª gen se
asociaron a un riesgo aumentado (60%),
comparando con 3ª gen
70. Retos en los factores de la coagulación
• Inhibidores
• COSTE
• Adherencia
71. Coste:
Eficiencia
• Reducción de hemorragias en 99,4% en la
mediana de la TAH
• La profilaxis individualizada (pK) con FVIII 3ª
gen de molécula completa redujo nº sangrados
incluso en dosificación cada 3 días
• 42% de los pts tuvieron CERO sangrados/año
72. Retos en los factores de la coagulación
• Inhibidores
• Coste
• ADHERENCIA
73. • Adherencia a profilaxis es aún problema
• Lindvall K,et al. Haemophilia 2006; 12: 47-51.
• Duncan N, et al . Haemophilia 2010; 16: 247-55.
Adherencia
• Personalización de la profilaxis para cada tipo de paciente, e
infusiones menos frecuentes pueden mejorarla
74. ¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia?
Infusiones IV de factor menos frecuentes
Tratamiento sin infusiones IV
75. ¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia?
Infusiones IV de factor menos frecuentes:
– Desarrollo de cocentrados de Factor VIII de más larga duración:
• Unión a proteínas de fusión: IgG o albúmina
Hace a la molécula más resistente a la acción de la trombina, manteniéndose
activo más tiempoactivo más tiempo
• Unión a otras moléculas: PEG/ PSA/PEGlip
Para disminuir la velocidad de inactivación por parte de la trombina, y
aumentar el tiempo que la molécula permanece activa (ABC) -- PEG
Para conservar la función con un aumento de la estabilidad
• Combinación de FVIII pegilado o polisializado con FvW
• Modificación de aminoácidos: Análogos, rFVIII variante
Prolonga la vida media, por ej. aumentando unión a plaquetas
76. ¿Siguientes pasos en el tratamiento de la hemofilia?
FVIII:
Vida media corta
No atraviesa piel ni pulmón
Se destruye en el tracto GI
Genera inhibidores si se administra por vía no IV
Tratamiento sin infusiones IV:
– Moléculas sintéticas
– Restauran la capacidad de generación de trombina por la vía
extrínseca (por ejemplo, bloqueando los inhibidores de la
coagulación, inhibidores del TFPI)
– Fucoide como tto adyuvante del FVIII en profilaxis
Tratamiento vía oral
77. La tecnología recombinante:
Permite generar proteínas para uso terapéutico no procedente de
donaciones
No está sujeto al abastecimiento y disponibilidad de plasma
CONCLUSIONES
No está sujeto al abastecimiento y disponibilidad de plasma
Minimiza el riesgo de transmisión de virus humanos
Tiene un perfil de seguridad específico
La fuente de partida es única, sistematizada y bien caracterizada
Es un proceso industrial técnicamente exigente y regulado
78. La tecnología recombinante :
Supone un incremento potencial en el nivel de seguridad de los
hemoderivados, aunque no deben obviarse las medidas de
CONCLUSIONES
hemoderivados, aunque no deben obviarse las medidas de
seguridad implementadas en los productos plasmáticos
Abre el camino a nuevas generaciones de proteínas
terapéuticas
