produccion de anticuerpos monoclonales y policlonales

1. Anticuerpos monoclonales

2. César Milstein (izda.) y Georges Köhler,
creadores de la técnica de hibridización
somática para la generación de anticuerpos
monoclonales
Técnica que les valió el Premio Nobel en
Fisiología ó Medicina 1984

3. ¿Qué son los anticuerpos monoclonales?
Son anticuerpos producidos por células que derivan de
un solo clon con lo cual son iguales en estructura y se
unen todos de forma idéntica al antígeno, es decir,
presentan la misma AFINIDAD.

4. ¿Qué es un suero policlonal?
Frente a un estímulo se produce una respuesta inmune en la cual
se activan distintos Lb que se diferencian a plasmocitos y
comienzan a secretar anticuerpos. Cada plasmocito va a producir,
anticuerpos con una especificidad y afinidad característica,
distintos a los de los demás plasmocitos

6. Ventajas
Alta
proporción de
Ac específico
Población
homogénea
Partidas de
calidad
reproducible
Cantidad
ilimitada
Desventajas
Producción
compleja
Caros $$$
Ventajas
Fácil producción
Baratos
Reconocen varios
epitopes
Desventajas
Baja proporción
de Ac específico
(10%)
Mezcla
heterogénea e
irreproducible de
anticuerpos
Cantidades
limitadas

7. Producción de
anticuerpos
monoclonales
Inmunización de los
animales → Plan de
inmunización
Extracción del bazo
Fusión de los
esplenocitos y las
células de mieloma.
→ Hibridomas
Selección por medio
HAT
Aislamiento o
Clonado
Screening para
anticuerpos
específicos
Amplificación del
cultivo
Congelado de las
células para
almacenamiento

8. • Objetivo: obtención de un bazo
enriquecido en clones de
linfocitos B específicos para la
proteína de interés.
Plan de
inmunización
• Células del bazo (esplenocitos)
• ≈50% Linfocitos B
• ≈30% Linfocitos T
• ≈20% otros tipos celulares
Esplenectomía

9. Características de las células que forman el
hibridoma
Células de Bazo del animal inmunizado(LB)
• Capaces de secretar anticuerpos con especificidad definida
• Vida media limitada “in vitro”
• HGPRT + (Hipoxantil-Guanidil-Fosforibosil-Transferasa)
Células de Mieloma
• Son células tumorales modificadas genéticamente de ratón: por ej. Línea
celular NS0 (origen en Ratones BALB/c).
• No secretoras de Ac.
• Capaces de proliferar “in vitro” e “in vivo”
• HGPRT -

10. • Química: Poli etilenglicol, Virus
Sendai, Lisolecitina
• Física: Electro fusión
Fusión

11. Selección en medio HAT
H
• HIPOXANTINA: Precursor para la síntesis de
guanina y adenina
A
• AMINOPTERINA: Análogo del ácido fólico
inhibidor de la síntesis de novo de guanina
y adenina
T
• TIMIDINA

12. Selección en medio HAT
Evaluación de los sobrenadantes por ELISA
Tiempo de selección
en medio HAT ≈ 14
días

13. Clonado
Técnica más utilizada: DILUCIÓN LÍMITE
Se hacen diluciones de la población original
para obtener, con cierta probabilidad
estadística, cultivos que contengan una sola
célula que cuando crezca dará origen al clon
correspondiente.
Incubación 7 -10 días 37°C, 5% CO2

14. + en screening
- en screening
Dilución
5 cél/ml
1 cél/well
(200 ul Vf)
7-10 días incubación 37°C, 5% CO2
Observación en
microscopio
invertido
Búsqueda de blastos:
1 clúster de células –
“monoclonalidad”
2° Screening de Ac
por ELISA
Pocillos positivos:
Se expanden y congelan
Se repiten rondas de clonado +
screening para obtener línea
celular estable del hibridoma
Clonado por dilución límite

15. Amplificación
IN VITRO
En pequeña escala:
• Botellas o placas de cultivo
• El anticuerpo se encuentra
en el sobrenadante
En gran escala:
• Biorreactores
• Concentración de Ac: mg/ml
(grandes volúmenes de
medio de cultivo)
IN VIVO
• Líquido ascítico en ratones
compatibles con el tumor:
RatonesBALB/c, inmunosuprimidos
o atímicos
• Inoculación intraperitoneal de un
aceite mineral
• Desarrollo de tumor y líquido
ascítico
• Extracción del líquido por punción
IP

16. IN VITRO
• VENTAJAS
Poca contaminación
Libre de patógenos y de
proteínas murinas
• DESVENTAJAS
Cc de AcMo: ug/ml (en
botellas de cultivo)
IN VIVO
• VENTAJAS
Cc del AcMo en mg/ml
• DESVENTAJAS
Contaminación con otras
proteínas murinas
Presencia patógenos
La elección del método
depende del uso que se le dará
y de la cantidad que requiera

17. Caracterización
• Isotipo: ELISA, Inmunoprecipitación en gel.
• Epítope reconocido: ELISAs, inmunoblot o Western blot
• Nativo o lineal, repetido, compartido con otras proteínas o reconocidos por
otros monoclonales, etc.
• Afinidad: estimación por ELISA/RIA, de ser posible

18. Aplicaciones
• Terapias oncológicas conjugados a citotoxinas
• Terapia anti rechazo de transplantes y enfermedades
autoinmunes
Terapéuticas
•Purificación de sustancias a partir de mezclas complejas (cromatografía de
afinidad).
•Identificación y cuantificación de moléculas solubles en muestras complejas
•Como reactivo en técnicas de interacción primaria como
inmunofluorescencia, citometría de flujo y ELISA; WB, Mabs quiméricos.
•Diagnóstico de enfermedades infecciosas y cáncer
Analíticas
Diagnósticas

19. AcMo terapeúticos