Información sobre inmunoterápicos

1. 1
INMUNOTERÁPICOS
INMUNOLOGÍA PARA LA CARRERA DE FARMACIA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Dra. MARISA SILVIA CASTRO
AÑO DE EDICIÓN: 2015

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ÍNDICE TEMÁTICO
Página
1. Definición 4
2. Clasificación 4
2.1. Según su origen
2.1.1. Origen Extractivo 4
2.1.2. Origen Recombinante 6
2.1.3. Origen Sintético 7
2.2. Según su aplicación
2.2.1. Aplicación Preventiva 7
2.2.2. Aplicación Terapéutica 7
2.2.2.1. Inmunosupresores 7
2.2.2.2. Inmunoestimuladores 8
3. Proteínas Recombinantes 8
3.1. Selección del gen de interés y clonado 9
3.2. Selección del vector de expresión 10
3.2.1. Bacterias 11
3.2.2. Levaduras 12
3.2.3. Células de mamíferos 12
3.4. Purificación 13
4. Anticuerpos Monoclonales 14
4.1. Método de obtención del hibridoma 14
4.1.1. Inmunización y obtención de esplenocitos 15
4.1.2. Células de mieloma 15
4.1.3. Fusión 16

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4.1.4. Cultivo selectivo 17
4.1.5. Screening 17
4.1.5. Clonado 18
4.1.6. Amplificación 19
4.1.6.1. In vivo 19
4.1.6.2. In vitro 19
4.1.7. Purificación de anticuerpos monoclonales 20
4.2. Método de obtención por tecnología recombinante 20
4.2.1. Anticuerpos quiméricos 21
4.2.2. Anticuerpos humanizados 22
Bibliografía 23

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1. DEFINICIÓN
Un INMUNOTERÁPICO es cualquier compuesto que se administre como apoyo de
un tratamiento o como tratamiento en sí mismo, y que fundamente su mecanismo de
acción en la modulación del sistema inmune o que sea en sí mismo, un componente del
sistema inmune.
Generalmente se trata de sustancias químicamente complejas, habitualmente de
estructura proteica o glucoproteica, lo que dificulta en extremo o impide su síntesis
mediante procesos químicos convencionales.
La inmunoterapia, bioterapia, o terapia biológica, se refiere al conjunto de
estrategias de tratamiento para estimular o reponer el sistema inmune frente a
enfermedades oncológicas, infecciones u otras enfermedades así como para aminorar los
efectos secundarios de tratamientos muy agresivos usados contra el cáncer. El objetivo
puede ser profiláctico (preventivo) o terapéutico (curativo o de mantenimiento).
En función de la definición y de sus posibles usos, los inmunoterápicos incluyen a
los anticuerpos monoclonales, las vacunas, a las citoquinas y factores de crecimiento.
2. CLASIFICACIÓN
2.1. SEGÚN SU ORIGEN
2.1.1. Extractivo o Natural
Al momento de elegir el protocolo a seguir para obtener una proteína desde su
fuente natural, es importante tener en cuenta tanto el material de partida como su
posterior utilización.
En el caso de órganos u otros tejidos animales, es necesario disgregarlos antes de
proceder a la lisis celular. Generalmente estas técnicas involucran la utilización de enzimas
(por ejemplo colagenasa) y/o una ruptura mecánica. Para la ruptura mecánica se pueden
emplear morteros, homogeneizadores eléctricos, tijeras o tamices metálicos (mesh), entre
otros. Cuando el material es un cultivo celular, la extracción puede realizarse adicionando
un detergente, realizando un shock osmótico, o por sonicación.
Los métodos más utilizados para realizar la ruptura celular se basan
fundamentalmente en la homogenización de los tejidos y la destrucción de los límites
celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o químicos para obtener lo que

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se denomina extracto crudo. Se han desarrollado una amplia gama de técnicas de
disrupción celular, que se usan a escala de laboratorio y que se pueden clasificar como:
a) métodos físicos mecánicos: agitación con abrasivos, homogeneización a alta presión
o extrusión por presión;
b) métodos físicos no mecánicos: shock osmótico, ciclos de congelación
descongelación, sonicación o secado;
c) métodos químicos: tratamiento con álcali, solventes, detergentes, ácidos o
sustancias caotrópicas.
Luego de la lisis, suelen aplicarse sucesivos pasos de separación y purificación de los
componentes celulares: centrifugación diferencial para obtener fracciones subcelulares o
para aislar organelas específicas. En este caso, las proteínas asociadas a membrana
quedarán en el pellet y las solubles en el sobrenadante.

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La obtención de proteínas por esta vía es sin duda trabajosa, conlleva altos costos y muy
bajo rendimiento.
2.2.2. Recombinante
Considerando la dificultad para obtener proteínas extrayéndolas de su fuente se le
ha dado gran importancia a la biotecnología o tecnología de ADN recombinante para la
obtención de inmunoterápicos. La tecnología de ADN recombinante puede ser definida
como el proceso mediante el cual se consigue la inserón del gen que codifica para una
determinada proteína en un vector de clonado, y su posterior expresión en un organismo
diferente como puede ser una bacteria o una célula de mamífero.
La expresión de estas proteínas se ha convertido en una herramienta muy popular,
ya que es posible obtener altas cantidades de proteína con bajos costos de producción y
altas purezas de una o varias proteínas de interés. Asimismo, las proteínas recombinantes
en muchos casos son idénticas o ligeramente diferentes a las proteínas nativas.

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2.2.3. Sintético
Son productos químicos definidos.
2.2. SEGÚN SU APLICACIÓN
2.2.1. Preventivo
La inmunoterapia preventiva, que también se conoce como profiláctica o de
mantenimiento, se aplica para prevenir la aparición de una patología, para evitar la
aparición de síntomas cuando una patología ya está implantada, o para que esos síntomas
sean lo más leves y menos frecuentes posible.
El ejemplo característico de este tipo de inmunoterapia lo constituyen las vacunas.
También se incluye la administración de ciertos sueros y anticuerpos monoclonales, y el
consumo de probióticos y prebióticos.
2.2.2. Terapéutico
Los inmunoterápicos terapéuticos son aquellos pensados para combatir una
determinada patología, ya sea estimulando al sistema inmune o suprimiéndolo según la
necesidad de la enfermedad de base.
2.2.2.1. Inmunosupresores
Los inmunoterápicos inmunosupresores son ampliamente utilizados en
tratamientos clínicos de desórdenes autoinmunes, prevención de rechazo a transplantes,
y desórdenes de carácter no autoinmune tales como las alergias.
Según su modo de acción pueden clasificarse en cuatro categorías:
*Drogas antinflamatorias de la familia de los corticosteroides.
*Inmunosupresoras específicas inhibidoras de la calcineurina.
*Citotóxicas o antiproliferativas.
*Anticuerpos específicos.

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2.2.2.2. Inmunoestimuladores
Los inmunoterápicos inmunoestimuladores se emplean en patologías donde sea
imperioso estimular al sistema inmune como tratamiento de la misma. Es frecuente su uso
en enfermedades oncológicas y en trastornos asociados a inmunosupresión
(inmunodeficiencias primarias o secundarias). En la mayoría de los casos se trata de
citoquinas o factores de crecimiento.
3. PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Un proceso general de producción de proteínas recombinantes comienza con la selección
e identificación del gen responsable de la producción de la proteína de interés. Después
de la identificación y selección, se deben colocar en plásmidos e insertarlos dentro del
hospedero que puede ser una bacteria, levadura o célula animal. Se deben aislar copias
idénticas de las células transformadas y aquellas que producen la proteína de interés en
mayores cantidades, son subcultivadas, colocadas en crio-viales, bajo buenas prácticas de
fabricación y guardadas en sistemas refrigerados a -80 °C o en nitrógeno líquido y
denominado como banco maestro. Un vial de este banco maestro es subcultivado
nuevamente para poder producir el banco de trabajo y de éste se utilizarán los viales para
la producción.
Por otra parte, la purificación es un aspecto muy importante en la producción de
productos recombinantes y normalmente es el más costoso. El objetivo de la purificación
es obtener la mayor cantidad de producto con respecto al inicial, con el menor
desperdicio posible y con la pureza exigida como mínima para el producto. Así, en las
operaciones y procesos de separación y purificación de los productos, estas etapas
comprenden en forma general, separación de insolubles por filtración, centrifugación, o
decantación, separaciones primarias por extracción, absorción, adsorción, ultrafiltración y
purificación por extracción líquido-líquido, extracción a dos fases acuosas, o cromatografía
de afinidad y finalmente aislamiento del producto. En caso de proteínas terapéuticas, en
el mayor de los casos, la pureza final debe ser mayor al 90%. En el caso de que las
proteínas sean producidas por el hospedero de manera intracelular, los cultivos son
seguidos por una centrifugación con la finalidad de obtener la biomasa en forma de pasta
celular, desechando el sobrenadante. Se obtiene el material intracelular por ruptura de las
células mediante sistemas enzimáticos y/o mecánicos. Dependiendo de la naturaleza del
producto se debe obtener el sobrenadante o el precipitado celular, esto en el caso de que
las proteínas se produzcan como cuerpos de inclusión. Existen muchos métodos de

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purificación de proteínas recombinantes; sin embargo, los métodos cromatográficos son
los más usados por su facilidad en escalamiento, reproducibilidad y fácil validación.
3.1. SELECCIÓN DEL GEN DE INTERÉS Y CLONADO
Los genes a clonar pueden provenir de un banco de ADN genómico (donde cada
fragmento del ADN total incorporado a un plásmido va a parar a una bacteria distinta),
pero generalmente se utiliza ADN copia (ADNc). Este se obtiene utilizando como molde
ARNm, obtenido de un tipo de célula que está sintetizando activamente la proteína
buscada. Una vez logrado eso, es posible introducir este ADNc en un plásmido y hacer
crecer bacterias con el plásmido recombinante.
Clonar un gen significa aislarlo de su contexto celular natural e introducirlo en el ADN
de otro organismo vivo. Este nuevo gen, como parte integrante de la información genética
de la célula receptora, se multiplicará con ella. Para lograr esto se emplean endonucleasas
de restricción, o enzimas de restricción, que cortan el ADN de forma específica en
secuencias determinadas. Utilizando enzimas de restricción es posible cortar un ADN en
dos sitios específicos, aislar el fragmenta y luego unirlo a otro ADN distinto, previamente
cortado en un punto, con la ayuda de otra enzima, la ligasa, que es capaz de unir dos
pedazos de ADN.
La resistencia de ciertas bacterias a los antibióticos en determinadas cepas bacterianas
se debe a la presencia de pequeñas moléculas de ADN circular (plásmidos), que se
autorreplican en las bacterias. Estos plásmidos naturales se emplean como “vectores de
clonaje”, es decir, como vehículos transmisores de información. Este plásmido puede ser
introducido en una bacteria apropiada y, cuando dicha bacteria se reproduzca, todas las
bacterias originadas llevaran el plásmido recombinante formando un don. Los virus
también pueden utilizarse como vectores de clonado ya que se aprovecha su capacidad de
introducirse y replicarse.

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3.2. SELECCIÓN DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN

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La elección del sistema para expresar la proteína de interés depende en gran medida
de las características fisicoquímicas de la proteína a producir. Los sistemas procariotes
expresan proteínas solubles o en forma de agregados intracelulares o cuerpos de
inclusión, sin plegamiento, lo que implica su estructuración in-vitro. Los sistemas
eucariotes introducen modificaciones postraduccionales como glicosilaciones, eliminación
de la metionina inicial y ruptura proteolítica de un precursor, entre otros, asemejando las
proteínas recombinantes a las endógenas. Si bien es cierto, las bacterias presentan altas
productividades de producción (del orden de 10–15 g/L de la proteína de interés), la
complejidad de las proteínas que puede producir es baja. Por otra parte, las células
animales pueden producir proteínas de características complejas pero con muy bajos
rendimientos de producción.
3.2.1. Bacterias
Dentro de las bacterias la más empleada para la expresión de proteínas es
Escherichia coli, pero también se emplean otras como Baillus subtilis e incluso,
Lactobacillus lactis, Streptomyces lividans, entre otras.
En términos generales los vectores de clonación para expresión de proteínas en
bacterias contienen el gen que codifica para la proteína, un origen de replicación, un
marcador de selección, un promotor que regula la transcripción del gen insertado y un gen
de terminación de transcripción. A nivel de laboratorio pueden emplearse marcadores de
selección como ser genes que codifiquen para la resistencia a un antibiótico; sin embargo
esto no es posible cuando se producen proteínas para uso humano debido a la posibilidad
de generar respuestas alérgicas. Para evitar el uso de antibióticos se desarrollaron cepas
mutantes que carecen de un gen fundamental para su sobrevida. Un ejemplo es un gen
que codifica para las enzimas que sintetizan la pared celular, gen que se fusiona al
operador lac. En ausencia de lactosa este gen no se transcribe debido a que la molcéula
represora se une al operador de lac, y por lo tanto la célula no sobrevive. En cambio, si la
bacteria tiene un plásmido con el sitio operador, habrá una competencia del represor y se
unirá preferentemente al operador del plásmido permitiendo la transcripción del gen
esencial y la proliferación celular.
Dentro de las grandes ventajas en el empleo de células procariontes se encuentran
el bajo costo de los medios de cultivo, la facilidad y rapidez de crecimiento, el
conocimiento de la fisiología bacteriana, y la amplia disposición de vectores de expresión.
La gran limitación de los sistemas de expresión procariontes radica en la no
ejecución de modificaciones post-traduccionales lo que imposibilita que pueda emplearse
para sintetizar proteínas si dichas modificaciones son necesarias para su estabilidad y/o
actividad.

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Las proteínas sintetizadas a partir de bacterias en muchos casos no son liberadas al
medio de cultivo sino que en algunos casos son dirigidas al espacio periplásmico o quedan
en el interior de la célula. Para la obtención de la proteína si fue dirigida al espacio
periplásmico es necesario la utilización de proteasas periplásmicas que pueden ocasionar
un daño de la proteína de interés que lleven a la pérdida de la actividad biológica.
Además, el proceso de purificación desde el periplasma puede complicarse por la
presencia de contaminantes de la célula bacteriana.
En los casos en que la proteína queda soluble en el citoplasma, el proceso de
purificación es largo y costoso pero no es que la proteína sea solubilizada ni renaturalizada
para su correcto plegamiento. En cambio, si la proteína se expresa como cuerpos de
inclusión, sí será necesario una solubilización y refolding pero tiene la ventaja delos altos
rendimientos.
3.2.2. Levaduras
El empleo de levaduras como sistema de expresión demostró ser una alternativa
eficiente y económica de obtención de proteínas recombinantes. Dentro de las levaduras,
la más ampliamente utilizada es Sacharomyces cereviseae que es reconocida como un
microorganismo GRAS (Generally Recognized as Safe) por la FDA. Además, es uno de los
organismos mejor caracterizado y su genoma ha sido totalmente secuenciado. Otras
levaduras que también se emplean son Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, y otras.
A diferencia de las bacterias, las levaduras ofrecen un ambiente apto para el
plegamiento de proteínas eucariotas y además, permiten llevar a cabo algunas
modificaciones post-traduccionales y pueden secretar las proteínas al medio de cultivo.
Asimismo, las levaduras mantienen la ventaja de los microorganismos de ser unicelulares,
de fácil manipulación y rápido crecimiento, y a diferencia de los cultivos bacterianos
pueden realizarse en medios químicamente definidos pero no hay necesidad de remover
endotoxinas bacterianas.
Con respecto a la glicosilación, ciertas cepas de S. cereviseae son capaces de realizar
N-glicosilaciones en proteínas heterólogas. Sin embargo, la glicosilación de estas proteínas
(rica en manosa) difiere de la glicosilación de la proteína original. La glicosilación rica en
manosa puede causar la disminución de la vida media de la proteína debido a que puede
unirse a los receptores para manosa presentes en fagocitos y de esta forma ser eliminada.
3.2.3. Células de Mamíferos
Son el sistema de expresión de elección para proteínas cuyas glicosilaciones sean
fundamentales para su actividad in vivo. La principal línea celular empleada es la conocida

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CHO (Chinese Hamster Ovary), pero también se utilizan las líneas BHK (Baby Hamster
Kidney) y HEK293 (Human Embryonic Kidney).
Para expresar una proteína en una célula de mamífero, es necesario que el vector
posea un promotor eucarionte que regule y promueva la expresión del gen de interés.
Generalmente se emplean vectores virales como el adenovirus. Además es necesario un
sitio de clonación, una secuencia de poliadenilación, un origen bacteriano de replicación y
un marcador de selección.
Si bien la capacidad de glicosilación es alta, las células CHO tienen la imposibilidad
por falta de enzimas, de glicosilar los extremos terminales de las proteínas humanas. En
los últimos años se han desarrollado líneas celulares CHO transfectadas con genes que
codifican para estas enzimas y así son capaces de generar las glicosilaciones propias de las
proteínas humanas nativas.
Dentro de las desventajas de este sistema de expresión se encuentra que aunque las
líneas celulares están bien establecidas, la mayoría de ellas derivan de células tumorales y
pueden ser portadoras de retrovirus. Además, pueden contaminarse con agentes virales
presentes en los sueros que se emplean para enriquecer los medios de cultivo. Esto
conduce a que las proteínas sintetizadas por esta vía puedan estar contaminadas con virus
o micoplasmas, contaminaciones que deben ser estrictamente controladas. Por último, la
expresión en células de mamífero conduce a costos elevados por las exigencias en
nutrientes para su crecimiento.
3.4. PURIFICACIÓN
Los aspectos a considerar para un proceso de purificación exitoso son los siguientes:
 Se debe conseguir que la proteína recombinante se encuentre en mayor
concentración respecto de proteínas endógenas.
 La ubicación de la proteína recombinante en el sistema de expresión:
citoplasmática, secretada, cuerpos de inclusión
 Es necesario conocer las características fisicoquímicas de la proteína (PM, PI,
solubilidad, etc), y de ser posible de los contaminantes también.
 Podemos introducir “tags” durante su producción para facilitar la purificación
empleando columnas de afinidad. Los “tags” son marcas que se agregan durante la
producción de la proteína que son de utilidad para la purificación. Un ejemplo son
las colas de histidina agregadas al extremo terminal de la proteína que luego
permite purificarla mediante columnas de afinidad con níquel.
Los método de purificación pueden ser no adsortivos (cromatografía de Exclusión
molecular) o adsortivos (cromatografía de Afinidad, de pseudoafinidad, de Interacción
hidrofóbica, o de Intercambio iónico).

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4. ANTICUERPOS MONOCLONALES
El inicio de la obtención de anticuerpos monoclonales puede datarse en 1975, en un
artículo publicado por Köhler y el argentino César Milstein que describía la obtención de
un anticuerpo específico, monoclonal, frente a una proteína diana, mediante la fusión de
linfocitos B procedentes del bazo de ratones inmunizados con la proteína de interés, y una
célula de mieloma, es decir, una célula neoplásica de la misma estirpe que los linfocitos B.
Atendiendo a dicho origen híbrido, la nueva célula así obtenida se denominó hibridoma y
recogía las dos propiedades fundamentales de sus precursoras: la capacidad para producir
el anticuerpo (linfocito B) y la inmortalidad en cultivo (célula de mieloma). La
multiplicación selectiva o clonaje de este hibridoma permitía conservar una fuente
permanente de producción del anticuerpo.
La aparición de la técnica del hibridoma fue determinante para la producción de
anticuerpos monoclonales con fines terapéuticos y les valió a los Dres. Milstein y Köhler la
obtención del Premio Nobel en Medicina.
4.1. MÉTODO DE OBTENCIÓN DEL HIBRIDOMA

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4.1.1. Inmunización y Obtención de Esplenocitos
El primer paso en la obtención de un Ac monoclonal requiere la generación de
linfocitos B específicos para el antígeno de interés lo cual se obtiene mediante
inmunización con ese antígeno a los animales. En un principio se trató sólo de ratones
pero hoy en día también se pueden obtener Ac monoclonales de otras especies. El animal
más utilizado para la obtención de Ac monoclonales es el ratón, sobre todo de la cepa
BALB/c debido a que son buenos generadores de respuestas inmunes de tipo Th2 y
fundamentalmente porque las células de mieloma más ampliamente conocidas son de
origen BALB/c. Se debe considerar que el animal sea adulto joven al momento de iniciar el
plan de inmunización y si bien pueden emplearse indistintamente animales de ambos
sexos, suele trabajarse con machos debido a que suelen ser mejores productores de
anticuepos.
Los aspectos críticos para una buena inmunización incluyen los ya vistos: elección
correcta del antígeno en concentración óptima, selección de la ruta de inmunización y
dosis de administración, uso de adyuvantes y chequeo de la respuesta inmune para
comprobar la eficiencia de la misma antes de sacrificar al animal. Dentro de los antígenos
empleados estos suelen ser proteicos (purificados o recombinantes) aunque también
pueden emplearse antígenos de otra naturaleza química.
Una vez finalizado un exitoso plan de inmunización, se procede a la ablación del
bazo (órgano linfoide secundario) para la obtención de los esplenocitos entre los cuales
están las células B específicas para el antígeno.
4.1.2. Células de Mieloma
Las células de mieloma son células tumorales de estirpe linfocitaria B y como tales
tienen capacidad de proliferar ilimitadamente.

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Las células de mieloma para poder ser empleadas en la obtención de Ac
monoclonales deben cumplir una serie de requisitos:
*crecimiento ilimitado “in vitro” tanto a altas como a bajas densidades
*no sintetizar ni secretar inmunoglobulinas propias
*presentar un fenotipo para ser capaces de secretar Igs en alta cantidad
*ser genéticamente deficientes en la enzima HGPRT (hipoxantil – guanil –
fosforribosil transferasa). Esta deficiencia incapacita a las células a realizar
la síntesis de purinas a partir de hipoxantina o guanina. Esta deficiencia es
fundamental para la selección de los hibridomas.
*presentar la capacidad de inducir tumores “in vivo”
Las células empleadas son las llamadas NS-0, NS-1, SP2/0-Ag14.
4.1.3. Fusión
Para realizar la fusión entre los esplenocitos y las células de mieloma se procede a
mezclar ambas suspensiones celulares en presencia de un agente fusionante, siendo el
polietilenglicol (PEG) 1500 el típico agente fusionante empleado. El PEG fusiona las
membranas de las células por perturbación de las estructuras de bicapa lipídica.
Se debe considerar la relación de las células en la mezcla, generalmente se emplea
una relación célula de mieloma/célula de bazo que varía entre 1:1 a 1:4. El tiempo de

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contacto con el agente fusionante es una variable a considerar debido a la desventaja del
PEG de su elevada toxicidad.
4.1.4. Cultivo Selectivo
Luego de la fusión se obtienen tres tipos de híbridos:
Esplenocito – esplenocito (HGPRT+)
Célula de miloma - célula de mieloma (HGPRT-)
Esplenocito – célula de mieloma (HGPRT+)  híbridos de interés
Es necesario realizar un crecimiento selectivo de los híbridos de interés para poder
avanzar en la producción del Ac monoclonal.
La fusión de dos esplenocitos no sobrevivirá más de15 días en cultivo porque
carecen dela capacidad de crecimiento ilimitado in vitro.
Para la selección de los híbridos esplenocito-célula de mieloma se emplea un medio
de cultivo selectivo, el medio HAT, que posee Hipoxantina, Aminopterina y Timidina. La
Aminopterina es un inhibidor de la síntesis de novo de purinas, de modo que los híbridos
sólo podrán sintetizar purinas por la vía de rescate. De esta forma, al emplear células de
mieloma deficientes en la enzima HGPRT, se garantiza la sobrevida de los híbridos de
interés.
4.1.5. Screening
Una vez realizada la selección se lleva a cabo el primer screening en búsqueda de los
hibridomas productores de anticuerpos específicos para el antígeno de interés.
La técnica seleccionada variará según la futura utilidad del anticuerpo y se elegirá
una técnica sensible, específica, que se pueda realizar con bajo volumen y que permita
evaluar muchas muestras con rapidez. Normalmente, la técnica de ELISA es la de elección
para este fin.

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Luego se continuará trabajando sólo con aquellos hibridomas específicos para el
antígeno.
4.1.6. Clonado
Es necesario el aislamiento de los clones de hibridomas para alcanzar la
monoclonalidad. Este proceso de separación o aislamiento, llamado clonado, puede
hacerse por el método semisólido o el de dilución límite, método de elección.
El método semisólido es similar al crecimiento en agar de bacterias. Se emplea un
medio semisólido sobre el cual se colocan distintas diluciones de las suspensiones
celulares con el fin de obtener “colonias” aisladas.
El método de dilución límite consiste en hacer un recuento celular de las
suspensiones y diluir cada una de ellas de manera tal que se alcanzara una concentración
de 1 célula por pocillo.
Una vez finalizada la clonación, se procede a realizar un nuevo screening para
identificar los clones productores de interés y suele hacerse un reclonado para garantizar
la monoclonalidad.
En el screening posterior, se elige el o los clones que se decidirá amplificar en
función de ser los productores de anticuerpos de mejor calidad. En este paso se determina

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el isotipo de inmunoglobulina, la afinidad a su antígeno, si reconoce epitope lineal o
conformacional y de ahí su uso factible (ELISA, WB, etc), si el epitope es compartido con
otros antígenos, entre otros parámetros.
4.1.7. Amplificación
Una vez que se elige el clon, o clones, de interés en la mayoría de los casos es
necesario amplificarlos para obtener el anticuerpo de interés en mayor cantidad. La
amplificación puede llevarse a cabo in vivo empleando la capacidad de inducir tumores en
animales, o in vitro si se amplifica en bioreactores.
4.1.7.1. In vivo
Para amplificar in vivo se inoculan ratones, generalmente BALB/c, por vía
intraperitoneal con el hibridoma y luego de 7-14 días se recoge de la cavidad peritoneal el
líquido ascítico, rico en el anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma.
La cavidad abdominal es una óptima cámara de crecimiento para el hibridoma
debido a que se garantiza el aporte de una temperatura constante, oxígeno en proporción
adecuada, los nutrientes esenciales, y la remoción óptima del dióxido de carbono y
productos metabólicos. Los hibridomas crecen a altas densidades y consecuentemente, la
producción del anticuerpo monoclonal es alta.
El método de ascitis tiene varias desventajas y por eso se evita en determinadas
situaciones. Entre las desventajas se cuentan:1) el dolor y estrés causado a los animales;
2) existe evidencia de contaminación del producto con virus u otros microorganismos
murinos así como con otros componentes inmunológicamente activos y; 3) la
incrementada eficiencia en los métodos in vitro de amplificación.
Se obtienen por animal entre 5 a 10 ml de líquido ascítico que puede contener
una concentración de aprox 1-10 mg/ml del anticuerpo monoclonal.
4.1.7.2. In vitro
Es el método que permite el posterior uso del anticuerpo en terapias medicinales ya
que no puede emplearse inmunoterápicos amplificados in vivo. El anticuerpo se obtiene
libre de proteínas y posibles patógenos murinos pero con componentes del medio de
cultivo y del suero fetal bovino empleado para enriquecer los medios, aunque se pueden
emplear medios libres de suero que favorecen también la purificación posterior.

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Asimismo, el cultivo in vitro puede realizarse en baja o alta escala. En pequeña
escala se realiza en botellas o placas de cultivo y el anticuerpo secretado al sobrenadante
se puede encontrar en una concentración de µg/ml. Para la amplificación a gran escala se
emplean bioreactores que pueden ser de distintos tipos (rotatorios, estacionarios, de fibra
hueca). Este crecimiento implica obtener mayor crecimiento celular y por ende, mayor
rendimiento en la producción de anticuerpos.
4.1.8. Purificación de Anticuerpos Monoclonales
El esquema general de purificación de un anticuerpo monoclonal comprende un
primer paso de enriquecimiento y luego la purificación propiamente dicha mediante
métodos cromatográficos.
El enriquecimiento suele realizarse por medio de precipitación salina con sulfato de
amonio al 50% o 30% de saturación.
La purificación puede comprender el paso por resinas de intercambio iónico
(aniónicas o catiónicas), o el uso de columnas de afinidad.
4.2. MÉTODO DE OBTENCIÓN POR TECNOLOGÍA RECOMBINANTE
La obtención de anticuerpos monoclonales fue una herramienta sumamente exitosa para
el tratamiento de diversas patologías, sin embargo, con el advenimiento de la tecnología
recombinante la obtención de los mismos se modificó para obtener anticuerpos que
presentaran menor inmunogenicidad luego de su administración como inmunoterápico,
que poseyeran una mayor vida media y pudieran llevar a cabo todas las funciones
biológicas de los anticuerpos. Así se desarrollaron los anticuerpos quiméricos y
humanizados.

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4.2.1. Anticuerpos Quiméricos
Los anticuerpos quiméricos son monoclonales modificados de modo que conservan
sólo un 30% aproximadamente de estructura murina, sólo la región variable de las
cadenas H y L son murinas siendo el resto de origen humano.

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4.2.2. Anticuerpos Humanizados
Los anticuerpos humanizados reducen aún más la porción murina conteniendo sólo los
CDRs originales del anticuerpo monoclonal de ratón y el resto de la estructura de
origen humano.

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BIBLIOGRAFÍA
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proteínas recombinantes para la aplicación en acuacultura. Memorias del VII Simposium
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