Biotecnología

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA AP MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA
BIOTECNOLOGÍA
TRUJILLO – PERÚ
2015
SEMINARIO 1: Desarrollo y manejo de inóculos
1

2. Inóculo: Cantidad de microorganismos o células
capaz de garantizar, las condiciones económicas y de
fermentación en un volumen dado el mosto.
Volume útil del fermentador = V
Volume de inóculo = 0,005.V a 0,5.V
0,5 a 50%
El valor, depende del organismo, del tipo de medio, del
proceso de que se trate, etc., se debe definir
previamente experimentalmente

3. Condiciones ambientales
El medio ambiente en el que crece el microorganismo va a
determinar su adecuado desarrollo. El pH, la temperatura y la
presencia de oxígeno son los parámetros ambientales más
importantes cuando se pretende utilizar un microorganismo
industrialmente
CRITERIOS PARA LA OBTENCIÓN DE UN BUEN INOCULO

4. EN LA INDUSTRIA
Estado líquido
(acuosos u oleosos)
Estado sólido
Polvo o granular
INÓCULO

5. ETAPAS PARA PREPARAR EL
INÓCULO
Reactivación
de la cepa
Crecimiento en medio
sólido/líquido
Crecimiento en medio
líquido

6.  Cultivo preservado se reactiva en medio líquido o en medio
sólido.
 Según el método de preservación se requerirá tiempo para la
recuperación del cultivo.
 Sucesivamente se irá incrementando el volumen del
recipiente de cultivo, para conseguir la velocidad de
crecimiento adecuada.
DESARROLLO DE INÓCULO

7.  Es vital ir incrementando el volumen para que a escala
industrial se alcancen los resultados óptimos.
 Si el número de células no es el adecuado, la producción no
será óptima Además, si crece en condiciones diferentes a
como crecerá después (industrialmente), existirá una fase de
latencia en el fermentador, reduciendo la rentabilidad.
DESARROLLO DE INÓCULO

8. Etapas del desarrollo
del inóculo
2. Crecimiento del
microorganismo en
medio sólido o líquido
1. Reactivación de
la cepa.
3. Crecimiento del
microorganismo en un
medio de cultivo liquido

9. Esquema de un fermentador típico para cultivo en
suspensión con microorganismos o células animales.
Inóculo

10. Características de los
inóculos microbianos
utilizados en
bioprocesos industriales

11. Características de inoculo
 La cepa o cultivo a utilizar debe ser genéticamente estable.
 La cepa o cultivo debe estar libre de contaminantes.
 El microorganismo a usar debe ser de fácil conservación sin
pérdida de sus características.
 El inoculo puede ser un consorcio de diversas especies
microbianas, como las que se encuentran en lodos aerobios
(aguas residuales).
 Un inoculo debe tener la capacidad de crecer e invadir
rápidamente el sustrato (velocidad de crecimiento alta).
 El inoculo implica obtener una suspensión de microorganismos
viables y aptos para reproducirse y producir metabolitos a escala
industrial.
 Si el objetivo es obtener un producto, este debe ser obtenido en
altas concentraciones.

12. Fuente Cepas silvestres/
Colecciones
Antibióticos
Enzimas
Aminoácidos
Otras
sustancias

13. LA CANTIDAD DEL INÓCULO REQUERIDA PARA
EL PROCESO DE FERMENTACIÓN:
la cantidad del inóculo que se prepara y se
agrega, en la mayoría de los casos, es el 10%
del volumen total del trabajo.

14. LA CONCENTRACIÓN DE MICROORGANISMOS
EN EL INÓCULO:
Cuando el producto deseado es la biomasa, la
concentración de microorganismos representa la
eficiencia del proceso.
Si el interés va dirigido hacia los metabolitos, el
mismo parámetro es una medida indirecta de su
producción.

15. Factores a considerar:
Concentración de células Alcanzado (inóculo)
 Concentración celular inicial (fermentación)
 Concentración inicial sustrato Requerido
 Volumen y número de fermentadores disponibles
 Fase de crecimiento apropiado
Influencia de la cantidad de transferencias sobre el
crecimiento y formación de producto
Tipos de inóculo, a nivel de:
 Laboratorio (para investigación y en la etapa
temprana de la escala industrial)
 Producción industrial

16. IMPORTANCIA DEL
DESARROLLO DE
INÓCULOS

17. IMPORTANCIA DEL DESARROLLO DE
INÓCULOS
Para la elaboración de procesos
fermentativos .
En la industria de los alimentos,
panadería, lácteos y otros.
Para la optimización de los resultados en
los procesos biotecnológicos.
En la Comercialización como cultivos
liofilizados.

18. Desarrollo de inóculos microbianos
empleando lodos activados para la remoción
de acido sulfhídrico (H2S) mediante
biofiltración
Desarrollo de inóculos para la determinación
de la DBO:
Desarrollo de inóculos de microorganismos
lácticos y levaduras para la nutrición y
alimentación animal

19. PREPARACIÓN DEL INÓCULO:
El cultivo láctico para yogurt, está constituido por una
combinación de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus
al 50%; estos dos microorganismos crecen en simbiosis y
ambos son responsables de la fermentación láctica de la leche.
Para obtener un buen yogurt, es importante mantener el
balance en producciones sucesivas.
- Los tratamientos severos de temperatura podría inhibir el
crecimiento de ST y favorecer el crecimiento de LB. El
tratamiento a 90ºC durante algunos minutos inactiva
bacteriófagos presentes en la leche. Se prefiere utilizar leche
descremada en lugar de leche desengrasada para aumentar
los sólidos en el medio de cultivo.
- Las plantas deben trabajar cercanamente con los
distribuidores de los cultivos a fin de monitorear a los
fagos.

23. Desarrollo de inóculo para la producción de metabolitos secundarios
METABOLITOS SECUNDARIOS
Son moléculas sintetizadas por determinados
microorganismos, normalmente en una fase
tardía de su ciclo de crecimiento.
Características
No son necesarios
para el crecimiento
del microorganismo
que los produce.
Cada uno de estos
productos es producido
por un grupo muy
reducido de organismos.
La producción puede
perderse fácilmente por
mutación espontánea.

24. Desarrollo de inóculo para la producción de metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios se sintetizan normalmente en
idiofase (fase estacionaria)
Ejemplos:
 Antibióticos
 toxinas
(micotoxinas)
 Alcaloides
(ácido lisérgico)
 Factores de
crecimiento
vegetal
(giberelinas)
 Pigmentos.

27. CONSERVACIÓN DEL INÓCULO
• El problema de trabajar con microorganismos es su corto
tiempo de vida, ya para trabajar con ellos son necesarias
sucesivas generaciones que se mantengan idénticas entre
sí. Esto puede presentar una serie de problemas.
• La conservación de cepas de producción en un período
largo de tiempo es un requerimiento básico para la
fermentación industrial.
• El objetivo no será solo la supervivencia del organismo,
sino que este mantenga sus capacidades de producción
después de la conservación. Que se mantenga sin
cambios celulares tanto tiempo como sea posible y ha de
encontrar el método más adecuado para cada cepa.

29. FORMAS DE CUANTIFICAR
EL INÓCULO

30. FORMAS DE CUANTIFICAR EL INÓCULO
Existen varios métodos para medir la
concentración de microorganismo, los mas
comunes son:
A. La determinación del número de células
B. Determinación de la masa celular o
biomasa

31. A. La determinación del número de
células
1. Métodos directos :
Cuenta total microscópica (Cámara de
Neubauer, de Petroff, método de Breed)
Cuenta viable (en placa, cuenta en tubo de
Hungate, tinción con azul de tripano)

32. Cámara de Neubauer

33. Recuento en placa

34. A. La determinación del número de células
2. Métodos indirectos:
Espectrofotometría
Nefelometría
Numero más probable (NMP)

35. Determinación por Nefelometría

36. B. Determinación de la masa celular
1. Métodos directos
– Peso seco
Extracción Filtración Desecador
Pesado
– Peso húmedo
– Volumen húmedo

37. B. Determinación de la masa celular
2. Métodos indirectos
–Determinación de Nitrógeno total: Técnica
de micro-Kjeldahl
–Espectrofotometría
–Radiación IR

38. Espectrofotometría
Cuanto mayor es
el número de
células en
suspensión,
tanto menor es
el porcentaje de
luz que atraviesa
el medio.

39. GRACIAS

42. BIOGAS
Metano (CH4)Dióxido de carbono
(CO2 )
Pequeñas cantidades
de hidrógeno (H),
sulfuro de hidrógeno
(SH2 ) y nitrógeno (N)
Materia orgánica
fermentación anaerobia
CONSORCIO:
3 grupos de
microorganismos
anaerobios
Microorganismos
en relación
simbiótica
• Amplio espectro a los
excrementos animales y
humanos
• Aguas residuales
orgánicas de las
industrias (producción de
alcohol, procesado de
frutas, verduras, lácteos,
carnes, alimenticias en
general)
• Restos de cosechas

43. • La diversidad microbiana en los digestores de
biogás es tan grande como la del rumen, donde se
han reportado diecisiete especies de bacterias
fermentativas que juegan un importante papel
para la producción de biogás.

44. • Inóculo del Biogás: Excremento de animales
conteniendo diferentes grupos de microorganismos,
por ejemplo las excretas de animales.
• Dado las notables diferencias de textura en algunas
excretas, se tiene que añadir agua hasta lograrla
disolución aproximada de los sólidos en la mezcla, para
la activación del inóculo
• Activación: se disuelve en agua en una relación
estiércol agua de 1:3. Luego se homogeniza la mezcla
con la ayuda de una varilla de madera. Antes de
ingresarlo al biodigestor, se realiza un simple filtrado
para evitar que entren sólidos muy grandes y
ocasionen la formación de costras sobre los lodos y
evite la liberación del biogás.

45. Condiciones del inóculo:
• Ausencia de oxígeno disuelto e inhibidores
• pH de 6.8 a 7.5.
• Mezclado
• Presencia suficiente de nutrientes
• Sólidos totales.
• Contenido de agua
• Relación Carbono/Nitrógeno

46. DESARROLLO DE
INÓCULO DE Bacillus sp.
PARA LA PRODUCCIÓN
DE AMILASAS

47. • FUENTE DE INÓCULO:
- Criopreservación de un cultivo de Bacillus sp.:
Las cepas aisladas y seleccionadas se inoculan en un medio
mínimo e incubada a 37°C con agitación orbital a 250 RPM
hasta alcanzar una OD de 0.6 a 1.0, posteriormente las
bacterias son centrifugadas descartando el sobrenadante y
resuspendidas en medio mínimo con glicerol 10%, y se
almacenan en viales en nitrógeno líquido.
Almacenamiento en
nitrógeno líquido
-80° a -196°CCultivo de Bacillus sp.
PRODUCCION DE BIOMASA

48. • Cepa de B. subtilis BSR6 (ΔnprE, Δamy, hisA,
glyB, aprE::lacZ, CmR; Jan et al., 2000).
*BSR6 es una derivada de la cepa 168 y tiene una
fusión transcripcional aprE-lacZ integrada en el
locus amyE de B. subtilis (amyE::pTTGACA cat)
CEPAS CARACTERIZADAS

49. • DESARROLLO DE INOCULO
A) ACTIVACIÓN DE INÓCULO:
Placas con Agar Luria Bertani (LB), las cuales fueron
inoculadas con diluciones de las bacterias
criopreservadas permitiendo la formación de colonias
aisladas.
Medio LBDiluciones
Microorganismo
criopreservado

50. B) PROPAGACIÓN DE INÓCULO:
Se toma una colonia aislada de una placa con
medio LB y esta se inocula en 50 ml de medio LB
(en matraz Erlenmeyer de 250 mL), el cultivo es
incubado a 37°C con agitación orbital a 250
rpm,14 horas hasta alcanzar una O.D. de hasta
2.0. Luego las bacterias son centrifugadas y
resuspendidas en 10 mL de caldo LB.
Colonias aisladas de Bacillus sp. Cultivo de Propagación Cultivo resuspendido

51. • Medio Luria Bertani (LB):
-NaCl ……………………………..10 gr.
-Bacto-Triptona ………………10 gr.
-Extracto de levadura ……… 5 gr.
Aforando a 1000 mL con agua destilada con un pH ajustado a 7.0. Agar a
una concentración de 1.5% fue utilizado en medio sólido.
• Otros medios de Propagación:
- Medio de cultivo (g/L): Pectina, 2; Extracto de levadura,
1; Peptona de carne, 10; Peptona de soja, 10; KH2PO4,
0,2; CaCl2, 0,05; (NH4)2SO4, 3; MgSO4, 0,8;MnSO4.6H2O,
0,05; FeSO4.7H20, 0,015; pH 5,0.
- Medio Basal: caldo nutritivo, 0.8; extracto de levadura,
0.3; almidón soluble, 0.2; KH2P04, 0.1 y K2HP04, 0.3

52. DESARROLLO DE
INÓCULO DE A. niger
PARA LA PRODUCCIÓN
DE ÁCIDO CÍTRICO

53. Fuente de inóculo:
• La conservación de esporas de Aspergillus niger se
lleva a cabo mediante:
-Congelación (-18°C ó -196°C en Nitrog.
líquido),
- Secado en suelo estéril o
- Liofilización.
Estas técnicas de conservación, se usan con éxito
para pequeñas cantidades de esporas, pero el
elevado costo del equipo y funcionamiento, las
hacen de uso limitado para escalas mayores.

54. Método de conservación con aceite
mineral
• Método usado cuando la criopreservación y la
liofilización no resultan económicas.
• Consiste en recubrir con aceite mineral estéril un
cultivo que se encuentre en condiciones optimas
de crecimiento, generalmente de usa aceite
mineral de alta calidad de grado medicinal.

55. Desarrollo del inóculo:
A) ACTIVACIÓN DEL INÓCULO:
Se usa de preferencia caldo de papa dextrosa (PD),
sembrando una cantidad de microorganismo
liofilizado en 50 ml de PD (5 días a 30°C ) en un
shaker orbital con 150 rpm.
Después de activada la cepa, se siembra
nuevamente el microorganismo en medio sólido
(PDA), manteniéndolo a 30°C por 5 días hasta que
se formen las esporas.

56. Al cabo del tiempo de incubación y
habiendo esporulado el
microorganismo, se guarda para su
conservación a 4 ºC.
De las cajas de Petri refrigeradas se
preparan suspensiones de esporas con
una concentración aproximada de 2 x
107 esporas/mL con el fin de favorecer
la formación de pellets.

57. Conservación del cultivo

58. Activación del inóculo

59. SEMINARIO 1
BIOTECNOLOGIA
DESARROLLO DEL INOCULO

60. Desarrollo del inóculo
• Las técnicas biotecnológicas consisten en
la manipulación de los organismos,
fundamentalmente a escala genética, para
usos específicos. En esos conceptos está
comprendida la biotecnología tradicional y
la denominada biotecnología moderna en
la que la tecnología del ADN recombinante
(también llamada ingeniería genética) se
ha convertido en parte central de la
misma.

61. • En el proceso de obtención del producto deseado, los
sistemas biológicos actúan como catalizadores de la reacción
propiciando que ésta se lleve a cabo en condiciones óptimas
y con el mayor rendimiento. Los sistemas biológicos usados
son: microorganismos, cultivos celulares, enzimas o esporas.
De todos ellos destacan los microorganismos debido a dos
razones fundamentales: su elevada diversidad y plasticidad
metabólica y la sencillez y economía de su cultivo.
• La operación tiene dos fases: la de preparación, incluyendo la
fermentación, y la de obtención del producto.

62. • Los aspectos clave de esta etapa consisten en:
la localización de un microorganismo de interés
industrial. Normalmente ese microorganismo
provendrá de colecciones o bien de las cepas
salvajes existentes en la naturaleza

63. • La producción de bioetanol, es un ejemplo de
mucho interés. La materia prima usada en la
fermentación para producirlo consiste
típicamente en una mezcla de hexosas y
pentosas. Por tanto el bioetanol es el producto
de la transformación de una mezcla de sustratos
mediante microorganismos.

64. • Cuando un microorganismo crece en presencia de al
menos dos sustratos, uno de ellos es normalmente
agotado primero, lo que resulta en un cambio en la
pendiente de la curva de crecimiento de biomasa. La
población de levaduras usadas en la producción de
bioetanol, a escala industrial, puede variar de
acuerdo con las condiciones particulares del proceso
de cada planta así como del estrés que el ambiente
fermentativo impone a los consorcios de
microorganismos. Por ello, las levaduras aisladas de
una industria en particular pueden estar adaptadas a
dichas condiciones y por tanto son mejores para ese
proceso que una cepa comercial pura.

69. • Propagación:
• Manejo: Dirección y gobierno de un negocio.
• En microbiología hace referencia a dirigir una
secuencia correcta de un procedimiento o proceso.

70. • cultivo preservado se reactiva en medio líquido en
agitación o en medio sólido, en condiciones adecuadas
para la fermentación posterior. Según el método de
preservación se requerirá más o menos tiempo para la
recuperación del cultivo. Sucesivamente se irá
incrementando el volumen del recipiente de cultivo, para
conseguir la velocidad de crecimiento adecuada. Es vital ir
incrementando el volumen para que a escala industrial se
alcancen los resultados óptimos. Si el número de células no
está en el número adecuado, la producción no será
adecuada. Además, si crece en condiciones diferentes a
como crecerá después, existirá una fase de latencia en el
fermentador, reduciendo la rentabilidad.

71. • Inóculo: Suspensión de microorganismos que se
transfieren a un ser vivo o a un medio de cultivo a través
de la inoculación.
• Por otra parte:
• Un inoculo microbiano es una preparación solida o líquida
la cual contiene una gran cantidad de microorganismos.
• Crecimiento: Dicho de un ser orgánico: Tomar aumento
natural (se dice principalmente de la estatura).
• En microbiología, la palabra crecimiento se define como
un incremento en el número de células.

72. Preparación del inóculo.
Conservación
Microorganismos
viables

73. Métodos de conservación.
Resiembra:

74. Consiste en remover el agua celular e impedir la
rehidratación de las células de los
microorganismos.
La
Desecación

75. Ordinaria
• Temperaturas entre -5 y -20 ºC.
Ultrafría
• Temperaturas entre -50 y -80 ºC.
Nitrógeno
líquido
• Temperaturas entre -150 y -196 ºC.
La congelación:

76. Es la remoción de agua de células congeladas
a presión reducida (sublimación).
La liofilización

77. Fase de laboratório Fase industrial
Fases de produccion de inóculo.

78. DESARROLLO DE INÓCULO
http://www.powershow.com/view4/5f5c84-
ZGRkN/CRESCIMENTO_MICROBIANO_powerpoint_ppt_presentation

79. DESARROLLO DE
INÓCULO
http://www.powershow.com/view4/5f5c84-
ZGRkN/CRESCIMENTO_MICROBIANO_powerpoint_ppt_presentation

80. DESARROLLO DE INÓCULO