Es una descripción breve de las condiciones necesarias para el crecimiento de un cultivo de microorganismos y los métodos para su conteo.

1. MÉTODOS EN
MICROBIOLOGÍAAislamiento y cultivo de microorganismos,
medios de cultivo, factores que influyen sobre
el crecimiento microbiano: requerimientos
nutricionales y fisicoquímicos.

2. Nutrientes
macronutrientes
Carbono y nitrógeno.
Fósforo, azufre,
potasio, magnesio,
calcio, sodio.
micronutrientes
Cromo, cobalto,
manganeso,
Molibdeno, Niquel,
Selenio, Tungsteno,
Vanadio, Zinc, Hierro.

3. Factores ambientales
Para el desarrollo de un
microorganismo además de los
requerimientos nutricionales,
existen un gran número de
factores ambientales que
influyen sobre el crecimiento,
supervivencia y actividades
metabólicas de los
microorganismos.

4. Esterilización.
Proceso que permite liberar todos los materiales empleados para el
aislamiento y cultivo de microorganismos. Se puede llevar a cabo de
varias formas:
Agentes antimicrobianos
físicos.
Agentes antimicrobianos
químicos.
Calor Radiaciones Filtració
n
Alcoholes
y fenoles.
Halógeno
s
peróxido
s
Metales
pesados
Gases
Detergentes

5. Cultivo y aislamiento de
microorganismos
• CULTIVO: poblaciones bacterianas con millones de
individuos.
• CULTIVO MIXTO: Es el que contiene varios tipos de
microorganismos creciendo juntos.
• CULTIVO PURO O AXÉNICO: Es el que contiene una
sola clase de microorganismo.
• AISLAMIENTO: Proceso que permite separar un
microorganismo del resto de las poblaciones con las que
coexiste en la naturaleza.
Para el aislamiento de microorganismos se pueden emplear
medios sólidos o líquidos.

7. Medios de cultivo líquidos:
No contienen ningún
agente solidificante. El
medio líquido más utilizado
es el llamado caldo
nutritivo, compuesto
principalmente de extracto
de carne, peptona y agua.
Se utiliza
fundamentalmente cuando
se pretende la obtención
de una suspensión
bacteriana de una
determinada
concentración.
Medios de cultivo semisólidos:
Contienen una pequeña
cantidad de agar, unos 3 g/litro.
Se preparan a partir de los
medios líquidos, agregando a
éstos un agente solidificante en
una proporción menor que para
preparar medios sólidos. Uno
de sus usos es la investigación
de la movilidad de las bacterias.

8. Medios sólidos: Se preparan a partir de los
medios líquidos, agregándoles un agente
gelificante. Los más utilizados son la
gelatina y el agar en una proporción de
unos 12-15 g/litro. Son sólidos por debajo
de 45 °C. Por encima de esta temperatura
de encuentran en estado líquido.

9. Medidas directas del crecimiento microbiano
Recuentos en placa o de colonias
Es el método más usado para medir poblaciones bacterianas, ya que a
diferencia de otros permite contabilizar el crecimiento de células viables,
es decir células que pueden dar una descendencia. Es muy usado en la
microbiología de alimentos, pero puede ser impreciso cuando se toman
muestras naturales, como por ejemplo el suelo; donde no todos los
microorganismos a pesar de estar presentes en la misma muestra
podrán crecer en el medio de cultivo seleccionado dado a la diferencia
de requerimientos nutricionales.
En la naturaleza hay muchísimos más microorganismos de los que
podemos detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De hecho,
se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar únicamente
proporciones menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es
debido a varias causas entre las que se cuenta la falta de medios de
cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para el cultivo
debido a procesos de sintrofía y la oligotrofía (inhibición por altas
concentraciones de nutrientes) que muestran algunos microorganismos.

10. Filtración
Es un método muy usado en microbiología de aguas cuando la
concentración de bacterias presentes en la muestra es muy
baja. Para la filtración por membranas 100 ml de agua
atraviesan un filtro con poros muy pequeños que no pueden
pasar las bacterias, las cuales se quedan en la superficie del
filtro, éste se transfiere a una almohadilla con medio de cultivo
donde las colonias pueden crecer y con una incubación previa
hacer el recuento. Es una técnica muy usada para detectar y
cuantificar bacterias de contaminación fecal (coliformes fecales).

11. Método de extensión en placa
Se coloca un volumen de inóculo no superior a 0.1 ml (100 µl) sobre la
superficie de un medio de cultivo y se extiende uniformemente por toda la
placa con un asa o varilla de vidrio estéril hasta que el medio lo absorba
por completo, posteriormente se incuba a una temperatura determinada
hasta que aparezcan las colonias y así realizar el recuento.
Método de placa vertida
Sobre una placa estéril sin medio de cultivo se agrega cierto volumen del
inóculo (0.1 – 1.0 ml) al que se añade el medio de cultivo con una
temperatura de 45 o 50 °C, luego se agita suavemente la placa para mezclar,
después que el agar se solidifica y se incuba las colonias crecerán y en la
superficie del agar. El principal inconveniente de este método es que ciertos
microorganismos sensibles al calor pueden verse dañados por la temperatura
del agar fundido.

12. Método de diluciones seriadas
Cuando una muestra contenga muchos microorganismos que
superen las 300 UFC se recomienda realizar diluciones seriadas
que faciliten el conteo y permita obtener resultados confiables;
luego de las diluciones se siembran las placas y se procede a
hacer el conteo del número de colonias que debe ser multiplicado
por el factor de dilución para obtener las UFC por mililitro de
muestra original.
Método de diluciones seriadas para recuento en placa de colonias (tomado de Tortora et al. 2007).

13. Recuento microscópico directo
En esta técnica un volumen definido se coloca en un portaobjetos
para luego ser observado al microscopio. El método de recuento
de Breed es muy usado en la industria láctea, en éste se colocan
0.01 ml de muestra sobre un portaobjetos con un recuadro de 1
cm2 que se tiñe con un colorante para luego contar las células
observadas con el objetivo de 100X, al final el número de
bacterias contadas se multiplica por 100. Los recuentos
microscópicos también se realizan usando la cámara de Petroff-
Hausser; estos métodos no requieren tiempo de incubación
(Tortora et al. 2007).
Entre las principales desventajas del recuento directo tenemos: se
pueden contar células muertas y vivas, dificulta el conteo de
bacterias móviles, se requieren concentraciones de bacterias
adecuadas

14. Medidas indirectas del crecimiento
microbiano.
Los métodos indirectos se basan en la medida de
algún parámetro del cultivo que nos permite
deducir información sobre la evolución del
número de microorganismos.
Entre los más conocidos tenemos:

15. Recuento de viables en placa.
Este método consiste en sembrar cajas de petri con 1
ml de muestra (y de sus diluciones) y agregar de 10 a
12 ml de agar nutritivo estéril fundido (teniendo la
precaución de dejarlo enfriar hasta 44-46 grados). Se
mezcla rápidamente y, una vez solidificado el agar, se
incuban las placas durante 7 días a 20 grados C.

16. Recuento en filtros de membrana.

17. Recuento del NMP: Número más probable.
El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o
negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias
obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u
otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva
puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la
realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo,
en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo
de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de
esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos
que recibieron una o más células microbianas procedentes de la
muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron
ninguna célula permanecerán transparentes.

18. Tabla 8.7. Métodos de determinación del número de microorganismos.
Método
Microorganismos para los que se
utiliza
Tipo de recuento Usos / Limitaciones
Indirecto
Turbidez La mayoria de las bacterias y
levaduras
Total Determina la turbidez con un
espectrofotómetro; rápido y
reproducible; la suspensión debe
contener más de unos l0 millones de
células por ml; se requiere una curva
patron
Peso seco Cualquier microorganismo Total Tedioso y requiere un cierto tiempo,
pero preciso y reproducible
Actividad metabólica Cualquier microorganismo viable Viables Requiere un cierto tiempo y puede
ser impreciso; puede utilizarse con
materiales complejos
Directo
Recuento microscópico Cualquier microorganismo unicelular Total Muy útil para el recuento de un tipo
de células de una mezcla; requiere
un cierto tiempo; no es adecuado
para cultivos diluidos
Recuento electrónico Cualquier microorganismo unicelular Total Muy útil para el recuento de células
de un cultivo axénico; rápido y
preciso; no debe estar presente
material extralio
Recuento en placa Cualquier microorganismo unicelular
viable
Viables Muy sensible - puede detectar incluso
una célula; lento y tedioso; para
evitar el error debido al muestreo, se
debe recontar un gran número de
colonias
Numero más problable Cualquier microorganismo viable Viables Utilizado para microorganismos que
son dificiles de cultivar en medio
sólido y para determinar
contaminación por Escherichia
coli en aguas; requiere un cierto
tiempo
Filtración Cualquier microorganismo viable Viables Se concentra una muestra, de
manera que se puede recontar un
pequeño número de células a partir
de grandes volúmenes de un líquido

19. Bibliografía y webgrafía.
• http://www.cbm.uam.es/jlsanz/docencia/archivos/02.pdf
• http://datateca.unad.edu.co/contenidos/358010/exe/leccin_18_medi
das_directas_del_crecimiento_microbiano.html
• aulavirtual.usal.es
• http://www.faciasuncoma.com.ar/Carreras/Saneamiento%20Ambie
ntal/MicrobiologiaAmbiental/8%20RECUENTO.pdf
• http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-3.htm
• http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_conte
nt&view=article&id=464&Itemid=526