caracteristicas genrales de HPC

1. Cromatografía de líquidos de
alta resolución HPLC
Separar
Identificar
Cuantificar
Aminoácidos
Determinar especies
presentes en muestras de
materiales orgánicos,
inorgánicos y biológicos
Proteínas Ácidos
nucleicos
Esteroides
Fármaco
s

2. HPLC
Tipo de cromatografía en columna
• Trabaja con partículas < 10 µm
• Los
componentes individuales de
la muestra se desplazan por
la columna con una fase
móvil forzado a través
por una alta presión
suministrada por una bomba.
•Menor consumo de eluyente

3. Esquema de un
aparato de HPLC

4.  Contienen unos 500
ml de disolvente
 Sistema para
eliminar los gases
disueltos
 Un dispositivo de
filtración de polvo y
partículas solidas
Esquema de un aparato de HPLC

5. Esquema de un aparato de HPLC
Manual
Automático Se utiliza una
jeringa que no
tiene punta
También se hace mediante
válvulas de inyección (Lup) 5μL
De pendiendo del Lup que se
coloque es lo que se inyectara al
sistema

6. Evitar la
presencia de
contaminantes
Para mezclar
los disolventes
La elución isocrática
Se lleva a cabo con un solo disolvente o con una mezcla de
disolventes, constante, en el tiempo de análisis.
Elución con gradiente
La composición del disolvente cambia continuamente.

7. Filtrado Del
Eluyente

8. Contaminantes
 Todos los solventes
grado HPLC son
prefiltrados, pero
pueden acumular
partículas en
suspención que pueden
ser perjudicales para
los componentes.
 Las partículas pueden
ocasionar daños a la
bomba HPLC, al
guarda columnas, y en
general causar
desgaste del sistema
de HPLC.
 El simple contacto con
los gases atmosféricos
genera dilución de
estos.
 Exposición al polvo en el
aire al abrir el envase y
vaciar en el deposito,
 Degradación lenta del
recipiente solvente,
 Condensación y
polimerización del solvente.
 El Oxigeno puede producir
interferencia en los
detectores de fluorescencia
y electroquímicos.
 El Nitrógeno puede producir
burbujas en la columna de
HPLC y cuando el solvente
entra al detector produce
picos falsos.
 El CO2 puede causar de los
cambios de pH en el
sistema de solvente.

9. Filtro a la entrada del solvente
 Usualmente de
acero inoxidable ú
otra aleación
resistente a la
corrosión
 Poro de 1 a 5
micra.

10. Filtrado al vacio
 Se filtra al vacío a
través de una
membrana
 Filtra casi todas las
partículas que
pueden causar
problemas.
 Hasta 0.2 micras
 Es frágil

11. Filtro en línea
 Se requieren
botellas especiales
que se acoplen a
este sistema.
 Requiere de
sistema de baja
presión.
 0.2 micras

13. Bombas para equipo de
HPLC
Los equipos de HPLC cuentan con un
sistema de bombeo que suministre la
presión adecuada, para que se alcance un
caudal suficiente a su salida.

14. Tipos de bombas
Bombas recíprocas.
Bombas tipo jeringa.
Bombas de presión constante.

15. Bombas recíprocas
Volumen entre 35 y 400 μL
Existen con dobles y triples cabezas de bomba constante,
permiten un bombeo significativamente suave porque se llena
una bomba mientras la otra está en el ciclo de expulsión.

16. Bombas tipo jeringa
 Ideales para columnas pequeñas.
 Volumen de 250-500 ml.
 Operan mediante un tornillo
conductor que bombea fase
móvil a la columna a flujo
constante. La velocidad se
controla cambiando el voltaje
del motor.

17. Bombas de presión constante
La fase móvil es conducida a
través de la columna mediante la
presión de un cilindro de gas.
Una fuente de gas a baja presión
se necesita para generar altas
presiones en el líquido. La
disposición de las válvulas
permite rellenar rápidamente la
cámara del solvente cuya
capacidad esta sobre los 70 mL,
proporcionando flujo de fase
móvil de manera continua.

18. Inyectores de válvula
Consiste en una válvula de seis vías, dos
de ellas conectadas entre si, por un tubo
de volumen conocido llamado “loop”

19. La introducción de la muestra se lleva a
cabo en dos etapas, la primera se realiza
a presión atmosférica y cosiste en cargar
la muestra con ayuda de una jeringa.
En la segunda etapa, se gira la válvula para
hacer pasar el eluyente hacia la columna.

20. La inyección mediante válvulas es la mas
utilizada, ya que reúne todas las
características de un inyector

21. MICROJERINGAS
Es el dispositivo para la introducción de
muestra mas común y consiste en un
cilindro de vidrio calibrado con embolo
interior metálico usado para dispensar
en volumen seleccionado de muestra
por desplazamiento a través de una
aguja

22. Influencia de los parámetros
operacionales en la exactitud
volumétrica de las microjeringas:
 velocidad de inyección
 viscosidad muestra
 temperatura
 técnica de inyección
 adaptación émbolo-cilindro
 estado-desgaste de la jeringa

23. TIPOS DE
MICROJERINGAS
JERINGA COMPACTA
 Volumen de
dispersión de 2.5-5
µL.
 Aguja
intercambiable.
 Émbolo reforzado y
barril de vidrio no
son intercambiables.
 Temperatura
máxima es de 115

24. TIPOS DE
MICROJERINGAS
JERINGAS ESTÁNDAR (ÉMBOLO
DE ACERO INOXIDABLE NO
INTERCAMBIABLE)
 Bajo costo.
 Volumen de dispersión de
5,10,25,50,100,250 y 500 µL.
 Émbolo de acero y barril de
vidrio borosilicato, no son
intercambiables.
 Se utilizan en inyección de
muestra en las válvulas de
HPLC.
 En inyectores automáticos.

25. TIPOS DE MICROJERINGAS
JERINGAS ESTANTAR
(ÉMBOLO PROTEGIDO)
 Disponen de un mango de
metal extendido, que actúa
como soporte y guía del
émbolo.
 Previene la transmisión de
calor de la mano a la muestra.
 Evita que el émbolo retroceda
en aplicaciones de alta
presión.
 Disponibles con aguja fija e
intercambiable.
 Volumen de dispersión de
5,12,25,50,100 y 250 µL.
 Inyección en válvulas de

26. TIPOS DE MICROJERINGAS
JERINGAS ESTANDAR
(ÉMBOLO PROTEGIDO BAJO
COSTO)
 Cuerpo más largo y
reforzado con una funda
metálica.
 Émbolo ajustado dentro del
barril.
 Funda de metal evita la
transferencia de calor de la
mano.
 Inyección de muestra en
HPLC Y TLC.

27. TIPO DE MICROJERINGAS
JERINGAS PARA GASES Y
LÍQUIDOS (ÉMBOLO CON
SELLO PTFE)
 Capacidades de 1-100 mL.
 Barril de vidrio borosilicato,
émbolo de aluminio
recubierto de teflón y
equipado con punta de
teflón de cierre hermético.
 Utilizadas en pipeteo de
materiales corrosivos.
 Inyección de muestras LC y
TLC.

28. TIPOS DE MICROJERINGAS
JERINGAS PARA GASES Y
LÍQUIDOS (ÉMBOLO CON
SELLO DE PTFE)
 Para volúmenes pequeños.
 Barril de vidrio borosilicato,
émbolo de aluminio
recubierto de teflón y
equipado con punta de
teflón de cierre hermético.
 Utilizadas en pipeteo de
materiales corrosivos.
 Inyección de muestras LC y
TLC.
 Utilizado en inyectores
automáticos.

29. TIPOS DE MICROJERINGAS
JERINGAS PARA GASES Y
LÍQUIDOS (ÉMBOLO CON
SELLO PTFE, ÉMBOLO
PROTEGIDO)
 Son herméticas para gases y
líquidos.
 Ideales para líquidos
corrosivos.
 Punta del émbolo de teflón.
 Es totalmente intercambiable
en las partes individuales
(barril de vidrio, émbolo,
mango)
 Capacidad de
10,25,50,100,250 y 500 µL.
 Inyección en válvulas para

30. TIPOS DE MICROJERINGAS
JERINGAS CON VOLUMEN
CONTENIDO EN LA AGUJA.
 Inyecciones rápidas de
volúmenes pequeños, eliminan
totalmente el volumen muerto.
 La capacidad total de la jeringa
está contenida en la aguja y el
fino émbolo de tungsteno
extendido por toda la longitud
de la jeringa.
 Herméticas.
 Lectura fácil del volumen
contenido.
 Capacidad de 0.5-25 µL.

31. TIPOS DE AGUJA
N
Aguja cementada en el
barril en la marca de
acero. No adecuada
para autoclave.
RN
Aguja intercambiable.
Adecuada para
autoclave.

32. TIPOS DE AGUJAS
TLL
PTFE luer lock. Acepta
cualquier aguja Luer.
Adecuada para
autoclave.
LT
Luer tip. Acepta la
mayoría de las gujas
hipodérmicas.

33. TIPOS DE AGUJAS
LTN
Luer tip y aguja
cementada. No
adecuada para
autoclave.
KH
Knurdled Hub. Solo en
jeringas con volumen
contenido en la aguja.

34. TIPOS DE AGUJAS
PT AS
Punta cónica usada
únicamente en jeringas de
auto inyector. Reduce el
deterioro de la membrana
en inyecciones múltiples.
PT 2
Punta biselada especial
para evitar desgarros de
membrana, se recomienda
para una penetración
óptima.

35. TIPOS DE AGUJAS
PT 3
Punta plana para
usar con válvulas de
HPLC y
manipulación de
muestras.
PT 3T
Punta plana para

36. Columnas y
precolumnas de HPLC

37. Precolumnas
Aumentar la vida de la columna analítica
Elimina
Materia en suspensión
Contaminantes de los
disolventes
Saturar la fase móvil con la fase estacionaria
Minimizar las pérdidas
Relleno
semejante al de la columna
analítica
Tamaño de partícula mayor minimizar la caída de presión.

38. Columnas
Longitud 5 y 30 cm
Rectas y se pueden alargar dos o más columnas
Diámetro interno 4 a 10 mm
Tamaños de las partículas 3, 5 y 10 μm
25 cm de longitud
4.6 mm de diámetro interno
Empaquetada con partículas de 5
μm
40 000 a 60 000 platos/metro.
Mas usadas
Acero inoxidable, tubos de vidrio o polímeros

39. Micro columnas
Diámetro interno 1 y 4.6 mm
Tamaños de las partículas 3 o 5 μm
Longitud 3 a 7.5 cm
100 000 platos/metro
Ventajas
Rapidez
Mínimo consumo de disolvente
Desventajas Disolventes caros

40. Tipos de
relleno de la
columna
Pelicular
Bolas de vidrio Polímero
No porosas
Esféricas Diámetro
30 a 40μm
Recubrimiento
adicional
Partícula
porosa
Micro partículas
porosas
Diámetros 3 y
10 μm
Sílice, alúmina o
resinas de
intercambio iónico
Nota: los rellenos peliculares se utilizan ampliamente
las precolumnas y no en las columnas analíticas

41. Sangrado o
desempaquetamiento de una
columna cromatografíca

42. ¿Qué es el sangrado o
desempaquetamiento de una columna
cromatografíca?
Es perdida de fase estacionaria que
sale de la columna y que normalmente
genera una señal de fondo.
Un sangrado de columna bajo
permite una cuantificación
mas fácil.

43. ¿Qué genera el sangrado de una
columna?
 La cantidad de sangrado es
proporcional a la cantidad de fase
estacionaria de la columna, por lo que
columnas con películas de fase
gruesas sangran mas que las
columnas con espesores menores.

44.  Las columnas con menor sangrado duran
mas.
 El sangrado difiere de una columna a otra
 Todas las columnas sangran en cierta
medida
 A mayor temperatura, mayor el nivel de
sangrado y a temperatura constante el
nivel de sangrado debería mantenerse
constante.

45. Se debe determinar el valor de
sangrado
 Método robusto que permita
resultados consistentes y
reproducibles.
 Se efectúa a una temperatura
determinada.
 Se determina en
nanogramos/segundo ya que este
valor puede ser reproducido por
cualquier instrumento.

46. ¿Cómo se determina el valor del
sangrado?
Usando una solución estándar de
octametilciclotetrasiloxano o
polidimetilsiloxano, que son
componentes del sangrado de la
columna.
La solución estándar se inyecta el la
columna y la altura del pico se mide a
una temperatura lo suficientemente baja
para que no haya contribución a la señal
por parte del sangrado de la columna.
La diferencia entre la señal a 50°C
contra el estándar da el sangrado actual
de la columna y permite calibrar.

47.  Al haber determinado el sangrado de la
columna, se pueden ver inmediatamente
los beneficios de porque un sangrado bajo
es mejor ya que significa mejor
sensibilidad y una cuantificación mas
precisa a causa de la mejor relación
señal/ruido.

48. Mantenimiento: Limpieza,
purga y almacenamiento de la
columna

49. Limpieza
 Las columnas deben limpiarse antes
de su purga y almacenamiento ya que
este proceso permite regenerar la
fase estacionaria.

50. Purga de la columna
 Después de la limpieza, la columna se
debe purgar para eliminar cualquier
traza de sales (tapones) y/o aditivos
provenientes de la fase móvil.

51. Detectores para HPLC

52.  Son dispositivos capaces de convertir una
propiedad física no medible directamente
en una señal elaborable
 Compara las propiedades del eluyente
puro con el eluyente que arrastra a cada
uno de los componentes que se han
separado en la columna.
 La lectura es convertida en una señal
eléctrica que puede ser amplificada y
graficada.

53. Tipos de detectores
 De acuerdo a una propiedad de la
disolución
◦ Índice de refracción
◦ Constante dieléctrica
◦ Densidades
 De acuerdo a la propiedad del soluto
◦ Absorbancia UV
◦ Fluorescencia

54. Características de un detector de
HPLC
 Alta sensibilidad y respuesta predecible
 Responde a todos los solutos o tienen
especificidad predecible.
 Amplio rango de linealidad
 No son afectados por cambios en la
temperatura y flujo de la fase móvil
 Responden independientemente de la fase
móvil
 Son confiables y convenientes para usarse
 No es destruido el soluto
 Proveen información cualitativa de las
detecciones
 Son de respuesta rápida

55.  Los principales fabricantes de
instrumentación para HPLC son
Waters, Agilent, Shimadzu y Hewlett
Packard. Todos los instrumentos de
HPLC pueden funcionar con distintos
detectores y programas

56. Detectores de absorbancia
 Usan el modelo de forma de Z para medir
las absorbancias y minimizar el
ensanchamiento de la banda
extracolumna.
 El volumen, se procura el mínimo 1 a 10
µL
 Las presiones no deben ser mayores a
600 psi.
 Longitudes de cubeta de 2 a 10 mm.

58. Detector de fluorescencia.
La fluorescencia tiene lugar en compuestos que poseen grupos
funcionales específicos que se excitan con la energía de ciertas
longitudes de onda y emiten radiación de mayor longitud de onda que
la absorbida.

59.  La fluorescencia se detecta por medio
de un detector colocado
perpendicularmente al haz de
excitación
 Los más sencillos usan una fuente de
excitación de Hg y 1 o más filtros, (o
Xe y un monocromador de red)para
aislar la radiación fluorescente.

60. Detector de
quimioluminiscencia
 Similar a FL, pero en lugar de utilizar
una fuente de luz para excitar los
átomos de analito, la excitación se
inicia por reacción química.
 Puesto que no se basó en la fuente de
excitación externa, el ruido es
pequeño, resulta en elevada relación
de señal a ruido, es decir, que
proporciona una sensibilidad aún
mayor que FL.

61. Detector Rotación Óptica
 Específico para la medición isómero
óptico.
 La columna puede separar R-y de tipo
L-isómeros ópticos, pero los
detectores generales (por ejemplo,
UV) no puede distinguir que es ni R L.
 Detector Rotación Óptica proporciona
esta información

62. Detector electroquímico
Responde a analitos que pueden
oxidarse o reducirse, como fenoles,
aminas aromáticas, peróxidos,
mercaptanos, cetonas, aldehídos.
Para solutos oxidables, son comunes
los electrodos de cobre o de carbón
vitrificado.
Para solutos reducibles, un buen
electrodo son las gotas de mercurio.

63. Detector de índice de
refracción

64. Ventajas
Responden a casi
todos los solutos
(detectores
universales) incluso
aquellos q absorben
poco el UV
Buen
funcionamiento
No depende del
caudal

65. Desventajas
Son sensibles a
los cambios de
temperatura
(~0.01°C)y presión
No son tan
sensibles como
otros detectores ya
que son 1000 veces
peor que un UV y
debido a esta baja
sensibilidad no sirve
para análisis de
trazas

66. Factores que afectan al índice
de refracción
Longitud de
onda
(cambio del
haz de luz
incidente)
Densidad (relación lineal
entre el índice de refracción
y la densidad)
La densidad del medio se ve
afectada por:
-composición
-temperatura
-presión