2. Las razones de su popularidad son su sensibilidad, su fácil
adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su
idoneidad para automatizarla, su capacidad para separar especies
no volátiles o termolábiles, pero sobre todo, su amplia
aplicabilidad a sustancias que son importantes en la industria,
muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general.
Algunos ejemplos de estos materiales son aminoácidos, proteínas,
ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos,
terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies
organometálicas y una variedad de sustancias inorgánicas.
CAMPO DE APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
DE ALTA RESOLUCIÓN
3. Conceptos de Altura de Plato Teórico y factores
que lo afectan como en otras cromatografías
EFICIENCIA DE LA COLUMNA EN
LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
4.
5. Ensanchamiento de banda
extracolumna en cromatografía de líquidos
Se debe a diferencias de velocidad entre distintas capas del
líquido que se desplaza en tubos de inyección, de conexión
y detectores.
Se ha demostrado que la contribución de los efectos
extracolumna a la altura total de plato Hex está dada por
7. Recipientes para la fase móvil y sistemas para el
tratamiento del solvente.
Recipientes
De vidrio o acero de 500 ml
Sistema de tratamento
Para eliminación de gases disueltos y sólidos en suspensión
- desgasificación por vacío
- calentamiento
- agitación
- inyección de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio).
- Filtros para polvo y partículas sólidas en suspensión.
8. Sistemas de bombeo
Generación de presiones superiores a 6000 psi.
En cromatografía de líquidos se utilizan dos tipos de bombas, a saber, la del tipo
jeringa accionada por tornillo y la del tipo reciprocante. Este último tipo de bombas
se usa en casi todos los cromatógrafos comerciales modernos
9. Bombas reciprocantes
- Las más utilizadas
- Movimiento cíclico de uno o
más pistones con válvulas de
entrada y salida.
- Elementos compresibles en el
circuito atenúan variaciones.
- Ventajas: pequeño volumen interno (35 a 400 µµL), altas
presiones (>10000 psi), fácil adaptación a sistemas por
gradiente y caudales constantes e independientes de la contra
presión de la columna y viscosidad del disolvente.
- Desventajas: flujo con pulsaciones
10. - Cámara con un émbolo impulsado por un motor
- Ventajas: flujo libre de pulsos, independiente de viscosidad y
Contrapresión
- Desventajas: capacidad de bombeo limitada (0.25 L), poco
práctica para reposición y cambio de disolvente.
Control de flujo y sistemas de programación
Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos
instrumentos comerciales están equipados con dispositivos controlados por
computadora que permiten medir la tasa de flujo mediante la determinación
de la caída de presión a través de un constrictor colocado en la salida de la
bomba. Cualquier diferencia entre la señal y un valor preestablecido se utiliza
para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba
Bombas de desplazamiento
11. Sistemas de inyección de muestra
Volúmenes pequeños para evitar ensanchamiento de
picos (décimas de µL a 500 µL).
Inyección manual.
- Sencilla
- Evitar despresurización (micro jeringas capaces de
resistir 1500 psi).
- Inyecciones a flujo detenido
- Reproducibilidad: dispersión 2%-3% o mayor
Inyección automatizada
- Inyección a presiones de hasta 7000psi
- Precisión de décimas por ciento.
- Volúmenes de bucles entre 0,5 y 500 µL.
12. Columnas para cromatografía
de líquidos de alta resolución
- Tubos rectos de acero inoxidable
- Tubos de vidrio hasta presiones de 600 psi
- Longitud entre 10 y 30 cm
- Acoplables
- Diámetro interno entre 4 y 10 mm
- Tamaños de partículas entre 5 y 10 µm
- Columnas comunes: longitud 25 cm, diámetro interno 4.6 mm,
relleno de partículas de 5 µm: 40000 a 60000 platos/metro
- Columnas de alta eficacia de menores dimensiones con hasta
100000 platos/metro.
13. Precolumnas
-Eliminación de materia en suspensión y componentes que se
unen irreversiblemente al relleno.
-Saturación del solvente con la fase estacionaria (minimiza
pérdidas de relleno.
-Tamaño de partícula mayor al de la columna.
Control de temperatura
- Entre temp. ambiente y 100º-150ºC
14. Tipos de rellenos
Pelicular
-Bolas de vidrio o polímero, no porosas y
esféricas con diámetros
entre 30 y 40 µm.
-Recubrimiento con una capa delgada y
porosa de distintos
compuestos y recubrimiento adicional de
fase estacionaria líquida
y retenida por adsorción.
-Tratamientos químicos para mejorar
fijación.
-Ampliamente utilizados en pre-columnas
Partículas porosas
-Micropartículas porosas con diámetro
entre 3 y 10 µm entre 30 y 40 µm.
-Preparadas por aglomeración a partir
de partículas pequeñas
-Recubrimiento con películas orgánicas
unidas químicamente o físicamente.
15. Detectores
En la cromatografía de líquidos de alta
eficiencia se requieren detectores con gran
sensibilidad, en general para cantidades de
microgramos a nanogramos. Los detectores
que más se usan son refractómetros y
detectores de ultravioleta (UV). El detector
de refractómetro diferencial, llamado con
frecuencia “detector universal”, mide
cambios en el índice de refracción del
eluyente causados por la presencia de
solutos al salir de la columna.
16. CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
* La más utilizada
* Para compuestos polares, no iónicos, de baja a moderada
masa molecular (<3000)
* Más recientemente para compuestos iónicos
derivatizados (formación de pares iónicos).
- Líquido-líquido: fase estacionaria unida por adsorción
física
-Desventaja: pérdida de fase estacionaria por disolución en
la fase móvil.
-Fase unida químicamente: soporte más común es la sílice.
Diámetro entre 3, 5 o 10 µm); porosidad (hasta 0.80)
17. Fase normal
- Relleno polar (agua o trietilenglicol soportado sobre sílice o
alúmina y fase móvil apolar.
- Competencia del disolvente y del analito por el relleno es determinante
de los factores de retención.
- Solventes no polares (etiléter, cloroformo y n-hexano)
- Rellenos tipo siloxano para fase normal:
• amino (C3H6NH2) (los más polares)
• diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) (polaridad intermedia)
• dimetilaminopropil (C3H6N(CH3)2) (polaridad intermedia)
• ciano (C2H4CN) (los menos polares)
18. - Fase estacionaria no polar (hidrocarburo) y fase móvil polar (agua, metanol,
acetonitrilo).
- Cambios de solvatación del analito en el disolvente es determinante de
cambios de factores de retención.
Fase inversa
23. Ventajas
Los límites de detección que son, para muchos elementos, tres órdenes
de magnitud más sensibles frente a los métodos ópticos.
Espectros notablemente más sencillos, generalmente únicos y con
frecuencia fácilmente interpretables.
Capacidad para medir relaciones isotópicas atómicas
Desventajas
El coste del instrumento es de dos a tres veces el de los instrumentos ópticos
atómicos.
La deriva del instrumento puede ser del orden del 5 o 10%/hora.
Contiene unas determinadas interferencias.