Este documento describe la cromatografía de intercambio iónico, un método de separación basado en las propiedades de carga de las moléculas. Se utiliza una fase estacionaria con cargas electrostáticas que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil. Se explican conceptos como adsorción, elución y aplicaciones como la medición de hemoglobina glicosilada y determinación de ácido delta-aminolevulínico y porfobilinógeno en orina.

1. TÉCNICAS BIOQUÍMICAS:CROMATOGRAFÍADE INTERCAMBIOIÓNICOFERNANDA FUENTEALBAVALENTINA FUENTESMACARENA LOBOCARLA MORAROMINA PULVERMÜLLERJONATHAN RIQUELMEFACULTAD DE MEDICINAESCUELA DE MEDICINABIOQUÍMICADOCENTES: Dr. REGINALDO DEL POZO BQ. MIRNA MUÑOZMIÉRCOLES 30 DE JUNIO DE 2010

2. CROMATOGRAFÍA Método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases: Estacionaria Móvil Las retenciones pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción entre las dos fases: Adsorción Absorción

3. CROMATOGRAFÍAFunciones: Separar los componentes de la mezcla. Medir las proporciones de los componentes. Tipos: Cromatografía plana Cromatografía en columna

4. CROMATOGRAFÍA DEINTERCAMBIO IÓNICOMétodo de separación que permite la separación de moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Fase Estacionaria: Insoluble, lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil.

5. Fase Móvil: Disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas en forma, generalmente de buffer. Los iones de la fase móvil compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria. CROMATOGRAFÍA DEINTERCAMBIO IÓNICOPrincipio: las moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo general, en dos fases: Las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable.Se eluye de la columna con tampones de diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del tampón con el material, por los sitios de unión.

6. PROPIEDADES DE LOSINTERCAMBIADORESIntercambiador Iónico: Polímero que tiene grupos cargados unidos. Intercambiador Catiónico: Si un grupo está cargado negativamente, podrá intercambiar iones positivos. Un grupo típico que se utiliza en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfónico, SO3-. El grupo ácido sulfónico es un intercambiador de cationes fuertemente acido. Otros grupos de utilización corriente son el carbonilo e hidroxilo fenólico, dos intercambiadores catiónicos débilmente ácidos.

7. PROPIEDADES DE LOSINTERCAMBIADORESIntercambiador Aniónico: Si el grupo cargado es positivo, es un intercambiador de aniones. Los intercambiadores aniónicos débilmente básicos más corrientes son grupos aminos alifáticos o aromáticos.

8. MATERIALESColumna de vidrioMatriz de intercambio iónico (Resina) EluyenteMuestra a fraccionar Colectores.

9. PROCEDIMIENTOEquilibrio: Toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones complementarios (que pueden ser cloro o sodio). Aplicación y Lavado: Aplicar la muestra la cual queremos filtrar a través de la columna mediante un lavado específico. Se aplica un buffer con el mismo pH y fuerza iónica que el buffer inicial para que todas las proteínas cargadas se unan al intercambiador. Elusión: Las moléculas captadas por el intercambiador son eluídas debido a cambios en la composición del buffer. Regeneración: Remover las partículas que aún están asociadas al intercambiador. Se debe generar un cambio más drástico en el pH y la concentración salina. La fase estacionaria puede volver a ser utilizada.

10. PROCEDIMIENTO

11. ADSORCIÓN/DESORCIÓN ADSORCIÓN-La fuerza de adsorción aumenta con el aumento de carga neta. DESORCIÓN

12. Reducir la carga neta cambiando el pH

13. Agregar un ión que compita por las cargas del intercambiador.GRADIENTE DE NaCl(A) (B) (C) (D) (E)Resina de intercambio catiónico antes de añadir la muestra. Se añade la muestra, una mezcla de Asp, Ser y Lys. Se añade Na+ (NaCl), el Asp, el aminoácido con menos carga positiva eluye el primero. Se aumenta el Na+, a continuación eluye la Ser. Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee más carga positiva eluye el último.

14. VENTAJAS/DESVENTAJASVentajas: Alta capacidadAlta resoluciónPaso concentrador: Se puedesembrar un granvolumenparaluegoeluirlo en un menorvolumen.Con una misma columna se puede utilizar a diferentes pH y obtener diversos perfiles de elución.Desventajas:Las muestras deben estar desalinizadas antes de ser aplicadas a este tipo de cromatografía

16. TIEMPO DERETENCIÓN Tiempo que un compuesto tarda en salir de la columna.

17. Se basa en la atracción entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones de mayor carga y radio inferior. Cuando la retención de los compuestos se ve afectada, se favorece la elusión de ellos para ser recolectados en una serie de fracciones.pH Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles.

18. Las resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catiónico, reduciéndose así, el tiempo de retención.

19. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad, reduciéndose también el tiempo de retención.CARGAS La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la carga. La fuerza de retención es mayor y, por consiguiente la de elusión es menor, mientras más cargado se encuentre el compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes). CARGAS Los iones polivalentes se unen con mayor fuerza a la fase estacionaria que los monovalentes.GRADIENTE Aumentando la concentración de la fase móvil, los iones compiten cada vez más favorablemente con la muestra por los sitios activos cargados de la fase estacionaria.poro grande (mayor de 600Å) poro pequeño (menor de 600Å) POROSIDAD En membranas cuyo tamaño de poro es pequeño no hay espacio suficiente para unir el ión dentro de dichos poros por lo que la cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor.

20. En membranas con tamaño de poro mayor, se puede unir el compuesto móvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la cantidad de intercambiador por unidad de superficie. La porosidad busca una mayor superficie de intercambio.SUPRESORESDE IONES La conductividad de la fase móvil se hace muy elevada debido a la alta concentración iónica necesaria para eluir a la mayoría de los iones; esto hace muy difícil la detección de pequeñas concentraciones de analito.

21. Este problema se resolvió mediante un sistema supresor de conductibilidad colocado a la salida de la columna cromatográfica.

22. Los primeros supresores fueron columnas de intercambio iónico que convierten los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas y por lo tanto poco conductoras. CROMATOGRAMAEl cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada.

23. La posición de los máximos nos indica el ión presente (carácter Cualitativo) y su área nos indica la cantidad existente de dicho ión (carácter Cuantitativo). CROMATÓGRAFOUna vez separada, la muestra pasa a través del detector donde se registra la señal obtenida respecto al tiempo de retención.

24. Registran los cromatogramas.

25. Se emplean en la determinación de fluoruros, cloruros, nitritos, nitratos, bromuros fosfatos y sulfatos.APLICACIONESMEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA.

26. DETERMINACIÓN DE PBG Y ALA EN LA ORINA.HEMOGLOBINAGLICOSILADA El porcentaje de proteína unida a la glucosa es lo que se denomina hemoglobina glicosilada (HbA1). Cuanto mayor es la cantidad de glucosa en la sangre, más se une a las proteínas y su porcentaje de unión indica cual ha sido la cantidad media de glucosa circulante durante el tiempo de vida de la hemoglobina.

27. Como los eritrocitos son fácilmente permeables a la glucosa, el nivel de la HbA1 en una muestra de sangre facilita la historia glicémica de los 120 días anteriores, que corresponde a la vida media de estas células. HEMOGLOBINAGLICOSILADA

28. HEMOGLOBINAGLICOSILADA

29. HEMOGLOBINAGLICOSILADA El método de cromatografía de intercambio iónico se basa en la elusión diferencial de la hemoglobina glicosilada por el cambio de carga que se produce en la molécula debido a la glicación del grupo amino terminal de la cadena. Para realizar el procedimiento se utiliza carboximetil celulosa cargada (-).PBG Y ALAEN ORINAPorfirias: grupo de enfermedades de origen genético o adquirido. Existe alteración en la actividad de una o varias enzimas de la vía metabólica del grupo HEM, lo que ocasiona niveles anormalmente elevados de porfirinas o sus precursores (ácido delta-aminolevulínico [ALA] y porfobilinógeno [PBG]).

30. Estos se acumulan en los tejidos y se excretan en la orina y las heces. Las manifestaciones patológicas son producidas casi en su totalidad por los efectos sobre el sistema nervioso y la piel.PBG Y ALAEN ORINA La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es un desorden autosómico dominante, que causa deficiencia parcial de la actividad de la porfobilinógenodesaminasa (PBGD), tercera enzima de la ruta de síntesis del grupo HEM.

31. Cuando los pacientes con PAI presentan una crisis aguda, disminuye la actividad de la PBGD y, como consecuencia los niveles de BPG y/o ALA en la orina se incrementan significativamente.

32. Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta de 20 a 200 mg/día, cuyos valores de referencia son de 0-4 mg/día, y la excreción de ALA se eleva aproximadamente a la mitad, 10-100 mg/día, cuando sus valores de referencia son 0-7mg/día.PBG Y ALAEN ORINA El método de Mauzerall-Granick es el más usados para la cuantificaciónde estos dos precursores. Se basa en la técnica de cromatografía de intercambio iónico, en la cual se utilizan columnas con resinas aniónicas y catiónicas.

33. El PBG se queda retenido en la aniónica y el ALA en la catiónica. En la columna con PBG, se utiliza ácido acético 1M para que éste eluya y pueda ser cuantificado. En la columna con ALA, se le agrega acetato de sodio 1M para que éste eluya y sea cuantificado. Luego, el eluido de cada columna reacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un producto rojo intenso. Este reactivo está conformado por 4-dimetilbenceno diluido en ácido acético y ácido perclórico.