Este documento describe la investigación sobre la deconstrucción de la celulosa desde perspectivas moleculares y de proceso. Se utilizó microscopía de fuerza atómica y confocal para observar cambios en la microestructura de la celulosa durante la hidrólisis enzimática, lo que condujo a una mejor comprensión del proceso a nivel molecular. Además, las enzimas encapsuladas en partículas secadas por pulverización demostraron ser más efectivas para la sacarificación de biomasa que las enzimas líquidas, pos

1. Entendiendo la deconstrucción de
celulosa desde una perspectiva
molecular y de proceso
Monica Santa-Maria
Cultivo para
bioenergía
Célula vegetal
Pared celular vegetal
Lignina
Hemicelulos
aCelulosa
Microfibra
de Celulosa Monica Santa-Maria
Tina Jeoh
Biological and Agricultural Engineering
Department
aCelulosade Celulosa
Moléculas de
azúcar
Glucosa The evolutionary road to biofuels, JBEI
(http://www.lbl.gov/Publications/YOS/Feb/)

2. Biocombustibles
combustibles líquidos renovables
• Alternativa sostenible a
combustibles fósiles
• Biocombustibles de 1a
generación: cultivos de azúcar y
almidón
Energía solar
+ CO2
pre-procesamiento
cosecha
biomasa
• Biocombustibles de siguiente
generación: biomasa celulósica
(residuos agrícolas y forestales,
desechos municipales sólidos,
cultivos para energía)
– Materia prima más barata y
abundante
http://www.jgi.doe.gov/education/bioenergy/co2cycle.jpg
CO2
CO2
CO2Biocombustibles
azúcares
Microbios fermentan
azúcares hacia etanol
Enzymas rompen
celulosa hacia azúcares
celulosa
pre-procesamiento

3. Biocombustibles de biomasa celulósica
• COSTO
– Conversión de polisacáridos
estructurales a azúcares
fermentables
– Costo de la enzima
• Se requieren mejoras en:
La compleja y heterogénea estructura de las lignocelulosas
limita el acceso a enzimas y químicos
Limitante para su utilización masiva:
• Se requieren mejoras en:
– La enzima
– El proceso
Necesitamos entender la
deconstrucción de biomasa
a nivel molecular para
optimizar enzimas y
procesos
Pared cellular primaria tipo II (Carpita et al., 1993)

4. Hidrólisis enzimática de la celulosa
Reacción compleja y heterogénea con diferentes actividades enzimáticas que
actúan sinérgicamente

5. Mecanismo de hidrólisis enzimática de la
celulosa
E + S
k−1
k+1
↔ES
k2
→E + αP
d[E]
dt
= −k1 E[ ] S[ ]+ k−1 ES[ ]+ k2[ES]
d[S]
= −k E[ ] S[ ]+ k ES[ ]
Hidrólisis de PASC por T. reesei Cel7A
d[S]
dt
= −k1 E[ ] S[ ]+ k−1 ES[ ]
d[ES]
dt
= k1 E[ ] S[ ]− k−1 ES[ ]− k2[ES]
d[P]
dt
= k2[ES]
Reto: Definir “S” y medir [S]

6. Factores que impactan la actividad
enzimática
• Acceso a sitios reactivos
– Topografía de la superficie
La velocidad de reacción disminuye
prematuramente. ¿Posibles causas?
• Cristalinidad de la celulosa
• Grado de polimerización
• Sinergía enzimática
• Cambios en el sustrato
durante la reacción
Impedimento stérico entre enzima unida productiva y
no-productivamente como posible mecanismo de
disminución de la velocidad de reacción (Väljamäe et
al. 1998)

7. Estrategia: Monitorear cambios en el
sustrato durante las reacciones enzimáticas
Solución
tampón
Microfibras de celulosa
Microscopía de fuerza atómica (MFA)
Enzimas
Donde en la reacción se hicieron
Medimos
azúcares
liberados
50nm
25
0
Área =10x10μm
Microscopía confocal láser cuantitativa
Donde en la reacción se hicieron
las observaciones?
Cuantificamos
la enzima
unida vía
intensidad de
fluorescencia

8. Muestras de celulosa usadas en nuestros
experimentos
Microfibra de celulosa, Cladophora sp
0.5x0.5 μm scan
20
0
5
10
15
nm
Cladophora aegagrophila 0.5x0.5 μm scan
1x1 μm scanImáges FESEM de células de A.
xylinum incrustadas en y
produciendo fibras de celulosa
Cladophora aegagrophila
Microfibra de celulosa bacteriana, Acetobacter xylinum
6
10
14 nm
-2
2
T. reesei Cel7A se agregó
durante el scanning
Spectral Imaging Facility
(http://neat.ucdavis.edu/pages/affiliate/ccoafm_main.htm)

9. Observaciones estructurales en microfibras
de celulosa
0
10
20
30
40
50nm
Control sin digerir
Periodicidades topográficas observadas
en microfibras de celulosa bacteriana
0
20
40
60
80nm
Agregados esféricos de celulosa observados en
muestras de celulosa dispersada por sonicación
Celulosa de Cladophora sp
0
5x5 μm scan
20
0
5
10
15
nm
13.44% conversión con TrCel7A
1x1 μm scan
0
Celulosa de A. xylinum
1x1 μm scan 1x1 μm scan
1x1 μm scan 1x1 μm scan
0
20
40
60
80nm
20
0
5
10
15
nm
M Santa-Maria and T Jeoh (2010) Biomacromolecules.11(8): 2000 - 2007

10. Cambios en la microestructura de la celulosa
observados durante reacciones enzimáticas
20
0
5
10
15
nm
0
5
10
15
20
25nm
Reacciones
en el MFA
Reacciones en lote
Cel7Aunida(pmoles)
0
5
10
15
20
25nm
5.4
5.8
6.2
nm
Conversióndecellulosa(%)
Tiempo (h)
Tiempo (h)
M Santa-Maria and T Jeoh (2010) Biomacromolecules.11(8): 2000 - 2007

11. Cambios en la microestructura de la celulosa
observados durante reacciones enzimáticas
Reacciones
en lote 20 min después de añadir TrCel7AReaccione
s en el
MFA
Se necesita incorporar estas observaciones en
modelos de mecanismo de reacción actuales
Cel7Aunida(pmoles)
0
5
10
15
20
25nm
13 h después de añadir TrCel7A
M Santa-Maria and T Jeoh (2010) Biomacromolecules.11(8): 2000 - 2007
Conversióndecellulosa(%)
Tiempo (h)
Tiempo (h)

12. Hidrólisis de la celulosa en la naturaleza vs
en un reactor
• En la naturaleza:
– Mínima humedad
– Las enzimas son secretadas por
hongos o bacterias en el punto de
crecimiento
– Las mezclas sinérgicas de enzimas son
secretadas en proporciones óptimas
Pila de compostaje
secretadas en proporciones óptimas
• En un reactor:
– Las enzimas son adicionadas en
formulaciones líquidas
– Limitaciones de transferencia de masa
– Las enzimas tienen diferente afinidad
y estabilidad
– Las mezclas no son óptimas en el lugar
de reacción
SEM, superficie de una pila de compostaje
http://www.organicmattersmag.com/features/313-an-introduction-to-soil-biology-
part-2-compost-and-compost-tea

13. Estrategia: Encapsular mezclas sinérgicas
de enzimas
Secado por pulverización.
Formulación de solución de enzimas: Patente pendiente
Enzimas (Novozymes Corp.):
Celluclast ®, Novo 188 ®, NS 5003
Proporción: 2:1:1.8 (v/v)

14. Propiedades de las partículas secadas por
pulverización
Partículas secadas por
pulverización conteniendo
mezclas sinérgicas de
enzimas
Enzima encapsulada Enzima líquida
Alginatos sin entrecruzar
Alginatos entrecruzados en la tobera
Alginatos entrecruzados en la tobera, con enzima
Alginatos entrecruzados antes de la tobera
Volumen(%)
Tamaño de partícula (µm)

15. La enzima encapsulada supera a la enzima
líquida en sacarificaciones de biomasa
SDE: Enzima encapsulada (rojo), LE: Enzima líquida (azul)
4% sólidos 15% sólidos
‘Switchgrass’ pre-tratado:
Incubación, 50°C

16. Comentarios Finales
• Nivel molecular:
– La plataforma desarrollada permite investigar cambios en la
microestructura de la celulosa durante la hidrólisis enzimática
– Las observaciones hechas se correlacionan con el grado de
conversión de la celulosa
– Las observaciones hechas conducen a un mayor entendimiento– Las observaciones hechas conducen a un mayor entendimiento
del proceso de deconstrucción de la celulosa
• Nivel de proceso:
– Sacarificación a escala de laboratorio
– Las enzimas encapsuladas superan a las enzimas líquidas
– Posibles causas: mejor distribución en el reactor, efecto
protector

17. Jeoh Laboratory, Biological & Agricultural Engineering,
UC Davis (October 2010)
Gracias por su atención
¿Preguntas?