Diferentes formas de inmovilización Celular

1. Inmovilización celular

2. El empleo de células enteras inmovilizadas presenta una
serie de ventajas frente a las enzimas aisladas:
•Se evita los procesos de aislamiento y purificación
enzimática.
•Las enzimas de interés se hallan en su ambiente celular
natural con lo que aumenta su estabilidad y consecuentemente
la vida útil del sistema permitiendo la reutilización del material
catalítico.
•El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores,
coenzimas y demás compuestos necesarios para asegurar una
óptima actividad, además de brindar buenas condiciones de
temperatura y pH.
•Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones
multienzimáticas.

3. Inmovilización celular
•Condiciones básicas que debe reunir un método
• Sencillez de preparación
• Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de
preparación
• Bajo costo
• Alta resistencia mecánica
• Baja o nula interferencia en los procesos de
purificación de productos
• Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos
de producción y/o biotransformación

4. Inmovilización celular
Por adsorción Por entrampamiento
•Adsorción a
soportes inertes
•Entrampamiento en matrices
poliméricas
•Inclusión en estructuras
preformadas

5. Inmovilización celular
•Adsorción a soportes inertes
•Inclusión en estructuras preformadas
•Bolillas de vidrio
• Virutas de madera, etc
•Biorreactores de fibra hueca
• Espumas de poliuretano
•Membranas de nylon

6. Inmovilización celular: en esferas alginato
O
O
O
O
OH
O
OH
n
Alginato (Acido manurónico β 1,4)
O
O
CaCl2+
O
O
O
O-
O
O-
O
O
O
O
O
O
O-
O
O-
O
O
O
O
O
O-
O
O-
O
O
O
O
O
O
O-
O
O-
O
O
CaCa
CaCa
Ca Ca

7. Inmovilización celular: Metodología de trabajo
Mezcla de solución de alginato
Y cultivo celular en medio libre
De agentes complejantes de Ca++
Solución de Ca++

9. Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
producidos en sistemas de células vegetales
inmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Catharanthus roseus Agarosa Catelamina Suministro de
ajmalicina
Catharanthus roseus Alginato Alcaloides
indólicos
Prolonga capacidad
biosintética
Catharanthus roseus Alginato Ajmalicina Prolonga estabilidad y
capacidad biosintética
(220 dias con cambio
de medio)
Catharanthus roseus Xantanos/po
liacrilamida
Serpentina Prolonga estabilidad y
capacidad biosintética
(180 dias con cambio
de medio)

10. Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
producidos en sistemas de células vegetales
inmovilizadas
Daucus carota Alginato 5-β-hidroxidigi-
toxigenina
Técnica: Suministro de
precursor
(digitoxigenina)
Daucus carota Alginato fenoles No hay variaciones con
respecto a cultivos
no inmovilizados
Especie Matriz Producto Comentarios

11. Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
producidos en sistemas de células vegetales
inmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Digitalis lanata Alginato β-metildigoxina Suministro de precursor:
β-metildi-gitoxina
Digitalis lanata Alginato digoxina Suministro de precursor:
digitoxina

12. Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
producidos en sistemas de células vegetales
inmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Beta vulgaris Nylon Betacianina Incrementa
acumulación
Capsicum frutescen Espuma de
poliuretano
Capsaicina Incrementa
rendimiento

13. Algunos ejemplos de metabolitos de interés comercial
producidos en sistemas de células vegetales
inmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Morinda citrifolia Alginato Antraquinonas Incrementa acumulación
intracelular
Talictrum minus Alginato Berberina Incrementa liberación
Solanum surretense Alginato Solasodina Incrementa liberación
Lithospermun
erithrorhysum
Fibra
hueca
fenoles Incrementa rendimiento.
Solanum

14. El empleo de células inmovilizadas ofrece una serie de ventajas
vinculadas al estado fisiológico y al diseño y modo de operación del
proceso fermentativo.
•El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto
intercelular y la generación de gradientes físicos y químicos que
conducen a un mayor grado de diferenciación.
•Al estar minimizada la tasa de reproducción celular la inestabilidad
génica se disminuye notablemente.
•Se alcanzan fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante
cuando la producción esta asociada a la idiofase o al final de la etapa
exponencial

15. •Estos sistemas permiten desacoplar las fases de crecimiento y
producción facilitando el empleo de estrategias como la elicitación
biótica y abiótica o la permeabilización para incrementar la
producción
• Es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimiento
para mantener la viabilidad y capacidad biosintética.
•las células inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a
altas velocidades de disolución sin riesgo de lavado de los cultivos
•Es posible controlar el tamaño de los agregados celulares en caso de
ser importante esa variable para la acumulación y/o producción de
metabolitos.

16. •Con la biomasa entrampada es más sencillo trabajar con procesos en
dos fases, lo más común es realizar una de crecimiento previo a la
inmovilización y la segunda de producción inmovilizando cuando el
cultivo ha llegado a su etapa estacionaria.
•En cultivos inmovilizados se facilita la remoción de inhibidores
metabólicos
•se protege a las paredes celulares de las fuerzas de corte

17. Con inmovilización es posible lograr: sistemas de producción de
metabolitos de una vida útil prolongada puesto que se puede
reutilizar la biomasa y realizar una recuperación continua de los
productos.
Es posible inducir la liberación al medio extracelular los metabolitos de
interés que naturalmente no son excretados mediante el empleo de
agentes permeantes, especialmente DMSO
El empleo de estos sistemas se encuentra limitado a la producción de
compuestos secundarios y la realización de procesos de
bioconversión dónde los productos de interés se liberen al medio de
cultivo.

18. Raíces transformadas

19. Metabolito Género vegetal Aplicación
Atropina Hyoscyamus Anticolinérgico
Berberina Hydratis
canadensis
Antihemorrágico
uterino
Esteres de
bornilo
Valeriana Sedante
Ginsenósidos Panax ginseng Tónico,
estimulante
Rotenona Derris elliptica Insecticida
Vincristina,
vinblastina
Catharantus
roseus
Antileucémico
Quinina,
quinidina
Cinchona Antimalárico,
antirreumático
Reserpina Rauwolfia Antihipertensivo
Algunos metabolitos secundarios sintetizados en raíces

21. Metabolitos acumulados en cultivos de raíces NO transformadas

22. Agrobacterium rhizogenes …….
Bacteria del suelo gram negativa
causa la enfermedad de las raíces en cabellera

23. Agrobacterium tumefaciens

24. La infección de muchas especies in-vitro con el
microorganismo patógeno Agrobacterium rhizogenes
permite obtener clones de raíces estables y en condiciones
axénicas
Mayoritariamente, los clones preservan la capacidad
biosintética de las raíces de las plantas que les dieron
origen

25. Las raíces neoplásicas producidas por A. rhizogenes
se caracterizan por :
su alto índice de crecimiento
y su estabilidad genética
Estos cultivos producen niveles de metabolitos
secundarios comparables a las plantas intactas

26. Biología de la interación
Agrobacterium-planta
El único ejemplo conocido de
transferencia natural de AND inter-
reino

29. Genes Rol A, B, C y D
catabolismo de opinas
Auxinas
Opinas
Región Vir
Origen de
Replicación
TLTR

30. El T-ADN es el sector del plásmido que se transfiere a las células huésped
Esta flanqueado por las secuencias bordes de aproximadamente 25 pb esenciales
para la transferencia
En el T-ADN existen dos regiones, la derecha (TR) y la izquierda (TL)
Ambas codifican para funciones rizogénicas una vez integradas a la célula
huésped
La región TR especifica la síntesis de agropinas y auxinas
Región TL porta cuatro loci que contienen los genes rol (A,B,C y D) implicados
en el desarrollo morfológico de las raíces mediante la sensibilización de las células
al efecto auxínico
El gen rol D induce la formación de tejido de callos mientras que los genes rol A,
B y C regulan el tamaño, grado de ramificación, alteraciones de tropismo y demás
características de las raíces en cabellera

33. Hairy roots are fast growing and plagiotropic
•They require no external supply of growth hormones
•The plagiotropic characteristic is advantageous as it
increases the aeration in liquid mediumand roots grown in air
have an elevated accumulation of biomass.

34. Una vez establecidos los cultivos de raíces transformadas se pueden
desarrollar a partir de pequeños inóculos y obtener buenos índices de
crecimiento.
El principal problema es el cambio de escala a niveles industriales ya
que la agitación mecánica causa injurias que conducen a la formación
de callos.

35. Debido a las ramificaciones las raíces forman una matriz que
ofrece resistencia al flujo, siendo el principal problema
nuevamente el suministro de oxígeno.
En los medios líquidos se forman
esferas de raíces con las raicillas
jóvenes en crecimiento sobre la
periferia y un corazón de tejido
viejo en el interior
La restricción nutricional que soporta esta parte interna,
principalmente en lo referido al oxígeno da origen a un
“bolsillo” de tejido senescente

36. Producción de metabolitos en cultivos de raíces TRANSFORMADAS

37. Las principales ventajas de utilizar cultivos de raíces transformadas, en
cabellera o hairy roots para producir metabolitos secundarios en lugar de
cultivos dediferenciados son:
•Con estos sistemas no son necesarios medios suplementados con
fitorreguladores para desarrollar biomasa
•Las raíces transformadas crecen rápidamente, son robustas y vigorosas
•Sintetizan metabolitos secundarios característicos de las raíces de las plantas
de las cuales provienen
•La síntesis de estos metabolitos se realiza a niveles reproducibles puesto que,
a diferencia de los cultivos de células indiferenciadas, son genéticamente
estables por períodos prolongados de cultivo
•El cultivo masivo de raíces transformadas es sencillo y tiene potencialidad
para desarrollarse en biorreactores, ampliando la posibilidad de aplicación
industrial de estos procedimientos