Estudio de la expresión diferencial a nivel transcripcional de genes exclusivos de acidithiobacillus ferrooxidnas ATCC 53993 involucrados en la resistencia a meteales pesados

Pontificia Universidad Católica de Valparaíso
Facultad de Ciencias
Instituto de Química
Sección Bioquímica
“Estudio de la expresión diferencial a nivel transcripcional de genes exclusivos de Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 posiblemente involucrados en la resistencia a metales”
TESIS PARA OPTAR AL TÍTULO DE BIOQUÍMICO
CRISTÓBAL LUIS CÓRDOVA SÁNCHEZ
Agosto 2014
Director de Tesis
Dr. Carlos A. Jerez G.
Laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología
Universidad de Chile
Comisión Evaluadora
Dra. Leda Guzmán
Sección Bioquímica
Dr. James Robeson
Sección Biología

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Una conversación de dos amigos sentados en el metro. Uno se levanta y se empieza a despedir. Existe la duda en su entre ceja. Y aquél que está de pie, con la duda, despidiéndose, estrechando la mano de su amigo dice: “Debo confesarte que yo no lo veo como descontextualizarse, o sea, en el sentido de la propia experiencia, sí, obvio, de eso se trata... ¡Bah! ¡Qué tontería! No he dicho nada”. Las puertas empiezan a cerrar y el sonido del vagón borra la escena.
Y no sé muy bien por qué llegué a pensar esto, pero resultó que se me reveló el sentimiento de sentirte como mi hermano, de verdad mi hermano, pues comprendí y valoré que tu amistad y tu amor hacia mí son incondicionales.
Para mi familia,
para quienes me ayudaron,
y para mí.

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AGRADECIMIENTOS
Todo lo que uno hace en la vida se lo debe a alguien. Nadie puede jactarse de haberlo hecho solo y sin ayuda. Y dentro de este largo proceso de tesis de pre-grado hubo muchas personas que estuvieron junto a mí acompañándome y ayudándome en el desarrollo de una investigación científica que me permitiera madurar como hombre de ciencia. Tal oportunidad la encontré en el Laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Chile liderado por el Dr. Carlos A. Jerez G. Es a él y a su hombre de confianza y mano derecha, Dr. Claudio Navarro, a quienes entrego mi agradecimiento más profundo. Al Dr. Carlos Jerez le agradezco enormemente por recibirme en su laboratorio y por permitirme desarrollar un trabajo de investigación para finalizar mi formación de pre-grado como Bioquímico a pesar del tiempo y los recursos requeridos, y al Dr. Claudio Navarro por ser el principal artífice de que este trabajo de investigación haya llegado a buen término gracias al constante apoyo científico que me brindó, y aún más, gracias al apoyo extra-científico que me otorgó sin pedir nada a cambio, salvo una merecida chorrillana del puerto de Valparaíso. Importantes fueron también Luis Orellana y Simón Beard, ambos compañeros de laboratorio, pues en sus investigaciones previas fundé las bases para el desarrollo de esta tesis. En definitiva, siempre hubo y aún hay un gran grupo en este laboratorio que facilita el trabajo científico gracias a su insuperable calidad humana, promoviendo un ambiente de trabajo envidiable por muchos. Debo destacar la presencia de los técnicos Don Juan Araos, Ricardo Reyes y Alejandro Araneda; las compañeras Cecilia Mauriaca, Josefina Cornejo y Daniela Soto; los compañeros Rodrigo Almárcegui, Andrés Villa, Álvaro Orell, Matías Rivero, Juan Pablo Weber, Sebastián Aguilar, Sebastián Gallardo, Rodrigo Castillo, Cristóbal Martínez y Diego von Bernath; y también destacar la camaradería con los integrantes del laboratorio amigo: Valentina Abarca, Macarena Varas, Javiera Ortiz, Camilo Valdivieso, Matías Castro, Pablo Álviz, Andrés Marcoleta, Mauricio Díaz y Francisco Chávez.
Por supuesto, debo entregar los agradecimientos respectivos a Alejandra Aránguiz del Laboratorio Dr. Mario Galindo, Facultad de Medicina, ICBM, Universidad de Chile y a Leonardo Pavez y Verónica Cambiazo del Laboratorio de Bioinformática y Expresión Génica, INTA, por haberme facilitado material genético imprescindible y las dependencias del laboratorio para poder realizar parte de mis investigaciones.

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Finalmente los agradecimientos recaen sobre mi familia. Mamá (Anita), papá (Miguel), hermano (Miguel Ángel) y hermana (Mª Alejandra): sé que siempre han deseado lo mejor para mí, obvio que yo también para ustedes. Espero que con la finalización de este proceso sientan que la misión fue cumplida y mis deudas saldadas y se sientan orgullosos de mí, así como yo me siento orgulloso de cada uno de ustedes como personas, como profesionales y más aún como el grupo familiar que conformamos. Los amo.
Esta tesis de pre-grado se llevó a cabo gracias al financiamiento del Instituto de Dinámica Celular y Biotecnología (ICDB) con fondos ICM-FIC Proyecto P05-001-F y principalmente gracias al Proyecto FONDECYT 1070986 y Proyecto FONDECYT 1110214 del Dr. Carlos A. Jerez G.

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ÍNDICE DE CONTENIDO
ÍNDICE DE FIGURAS.................................................................................................................vii
ÍNDICE DE TABLAS................................................................................................................. viii
GLOSARIO DE ABREVIATURAS...............................................................................................ix
I. RESUMEN..........................................................................................................................1
II. PRESENTACIÓN DEL PROBLEMA.............................................................................2
III. INTRODUCCIÓN..............................................................................................................3
IV. HIPÓTESIS.......................................................................................................................11
V. OBJETIVOS .....................................................................................................................12
i. Objetivo General. ...............................................................................................................12
ii. Objetivos Específicos. ........................................................................................................12
VI. DISEÑO EXPERIMENTAL...........................................................................................13
VII. MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................................14
i. Análisis bioinformático y diseño de partidores. .................................................................14
ii. Crecimiento de A. ferrooxidans en condición control........................................................16
iii. Crecimiento de A. ferrooxidans en presencia de metales pesados. ....................................16
iv. Obtención del material genético.........................................................................................17
1. DNA de A. ferrooxidans. .............................................................................................17
a) Colección, Lavado y Lisis Celular. ..........................................................................17
b) Electroforesis de DNA en geles de Agarosa. ...........................................................18
c) Cuantificación de DNA............................................................................................18
2. RNA de A. ferrooxidans. .............................................................................................18
a) Colección, Lavado y Lisis Celular. ..........................................................................18
b) Extracción de RNA total. .........................................................................................19
c) Tratamiento con DNasa............................................................................................19
d) Electroforesis de RNA en geles de Agarosa. ...........................................................19
e) Cuantificación de RNA. ...........................................................................................19
3. mRNA de exp-1. ..........................................................................................................20
a) Extracción DNA plasmidial. ....................................................................................20
b) Digestión enzimática. ...............................................................................................20

vi
c) Purificación de fragmentos de DNA. .......................................................................21
d) Transcripción In vitro del gen exp-1. .......................................................................21
v. Macro-arreglos de DNA.....................................................................................................21
1. Productos de PCR. .......................................................................................................21
2. Sembrado de las membranas de nylon.........................................................................22
3. Marcaje de las sondas de cDNA. .................................................................................22
4. Hibridización, lavado y exposición de las membranas................................................23
5. Normalización y tratamiento de los datos....................................................................23
vi. Ensayo de co-transcripción.................................................................................................23
vii. Ensayo funcional. ...............................................................................................................24
1. Clonamiento.................................................................................................................24
2. Transformación de TOP10...........................................................................................24
3. Transformación de BL21. ............................................................................................25
4. Halos de Inhibición. .....................................................................................................25
VIII. RESULTADOS.................................................................................................................26
i. Características de la zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993. ............26
ii. Crecimiento de A. ferrooxidans ATCC 53993...................................................................30
iii. Obtención del material genético.........................................................................................31
1. Productos de PCR. .......................................................................................................31
2. RNA de A. ferrooxidans ATCC 53993........................................................................33
3. mRNA de exp-1. ..........................................................................................................34
iv. Macro-arreglos de DNA.....................................................................................................35
v. Ensayo de co-transcripción.................................................................................................37
vi. Ensayo funcional. ...............................................................................................................40
IX. DISCUSIÓN......................................................................................................................41
X. CONCLUSIONES............................................................................................................44
XI. BIBLIOGRAFÍA ..............................................................................................................45
XII. MATERIAL SUPLEMENTARIO..................................................................................48

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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de los mecanismos de resistencia a metales en microorganismos acidófilos...4
Figura 2. Interacción bacteria-mineral durante el ataque de A. ferrooxidans sobre la pirita……...5
Figura 3. Modelo propuesto para la resistencia al cobre en A. ferrooxidans ATCC 23270………6
Figura 4. Alineamiento entre los genomas de A. ferrooxidans………………………...…………7
Figura 5. Comparación esquemática entre ambas cepas de A. ferrooxidans……………………...8
Figura 6. Esquema resumen del análisis bioinformático donde se indican las propiedades básicas de la IG de A. ferrooxidans ATCC 53993………………………………………………………..27
Figura 7. Detalle de la Isla Genómica…………………………………………………………...28
Figura 8. Curva de crecimiento de A. ferrooxidans ATCC 53993 en presencia o ausencia de metales……………………………………………………………………………………………29
Figura 9. Productos de PCR……………………………………………………………………..30
Figura 10. RNA de A. ferrooxidans……………………………………………………………...32
Figura 11. mRNA de exp-1……………………………………………………………………...33
Figura 12. Diagrama de la disposición de los productos de PCR sembrados en una membrana de nylon……………………………………………………………………………………………...34
Figura 13. Imagen representativa del resultado de la hibridización de dos membranas de nylon…………………………………………………………………………………………...…34
Figura 14. Veces de expresión relativa…………………………………………………………..35
Figura 15. Esquema ensayo de co-transcripción……………………………………….…..……36
Figura 16. Ensayo de co-transcripción………………………………………………………..…38
Figura 17. Ensayo funcional…………………………………………………………………..…39
.

viii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Familias de proteínas importantes para el transporte de metales pesados…………….....4
Tabla 2. Concentración de metales pesados a la que existe actividad metabólica en distintos microorganismos y con especial énfasis en bacterias y arqueas acidófilas…………………..……5
Tabla 3. Secuencias de los partidores utilizados…………………………………………………13
Tabla 4. Partidores específicos utilizados en experimentos de co-transcripción……………..….15
Tabla 5. Diseño de partidores específicos utilizados en experimentos de funcionalidad……..…15

ix
GLOSARIO DE ABREVIATURAS
 ATCC: American Type Culture Collection - Colección Americana de Cultivos Tipo.
 BLAST: Basic Local Alignment Search Tool - Herramienta de Búsqueda por Alineamientos Básicos Locales.
 cDNA: DNA de copia o DNA complementario.
 dCTP: desoxicitosina trifosfato.
 DEPC: dietilpirocarbonato.
 DMSO: dimetilsulfóxido.
 DNA: ácido desoxirribonucleico.
 dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato.
 EDTA: ácido etilendiaminotetraacético.
 ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas.
 HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etano-sulfónico.
 IG: Isla Genómica.
 kb: kilo bases.
 LB: medio de crecimiento Luria-Bertani.
 NCBI: National Center for Biotechnology Information - Centro Nacional de Información en Biotecnología.
 OD: densidad óptica.
 ORF: Open Reading Frame - Marco Abierto de Lectura.
 pb: pares de bases.
 PCR: Polymerase Chain Reaction - Reacción en Cadena de la Polimerasa.
 PoliP: polifosfatos inorgánicos.
 RNA: ácido ribonucleico.
 RT: Transcripción Reversa.
 RT-PCR: Transcripción Reversa acoplada a la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
 SDS: Sodium Dodecyl Sulfate – Dodecil Sulfato de Sodio.
 SSC: Saline-Sodium Citrate – Citrato de Sodio Salino.
 SSPE: Saline-Sodium Phosphate-EDTA – Fosfato de Sodio Salino-EDTA.
 TAE: Tris-Acetato-EDTA.

x
 THG: Transferencia Horizontal de Genes.
 Tris: o THAM, tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetil-1,3- propanodiol.
 UV: ultra violeta.

1
I. RESUMEN
Es sabido que los microorganismos que participan en los procesos de biolixiviación (lixiviación = solubilización de metales) poseen altos niveles de resistencia a distintos metales pesados. Entre estos microorganismos destaca Acidithiobacillus ferrooxidans, una γ- proteobacteria Gram-negativa quimiolitoautotrófica capaz de oxidar el ion ferroso, azufre elemental o compuestos reducidos del azufre (u oxidados parcialmente) como sustratos energéticos. Actualmente se encuentran disponibles para uso público las secuencias de los genomas de dos cepas de esta bacteria: A. ferrooxidans ATCC 23270 y A. ferrooxidans ATCC 53993. Experimentalmente se observa que la cepa ATCC 53993 es más resistente al crecimiento en presencia de metales que la cepa ATCC 23270. Entonces, se quiso responder a la interrogante del qué permite que ATCC 53993 presente esta mayor resistencia a metales. Para ello se adaptó esta cepa al crecimiento en distintos metales, cuales fueron cobre, cadmio, níquel y zinc, y se procedió a realizar ensayos de macro-arreglos con la utilización de cDNA marcado con fósforo 32 para cada condición de crecimiento. Con esto se analizó la expresión diferencial de genes exclusivos de esta cepa (genes que la cepa ATCC 23270 carece) entre cada condición de crecimiento versus el control. De estos genes, Lferr_0211 presentó una notable sobre-expresión de 5,2 veces en respuesta a cadmio. Lferr_0211 resultó ser parte de un operón que contempla a Lferr_0209, una ATPasa tipo P translocadora de metales pesados, por lo que se realizó su complementación heteróloga en E. coli y se midió su efecto fisiológico mediante halos de inhibición utilizando sensi-discos con cadmio. Se observó, entonces, una inhibición del crecimiento de E. coli no complementada alrededor del sensi-disco equivalente a 12,79 cm2 versus los 5,23 cm2 de inhibición del crecimiento de E.coli complementada con Lferr_0209. Por lo tanto, el operón que contempla a Lferr_0209 y Lferr_0211 le confiere a A. ferrooxidans ATCC 53993 mayor capacidad de resistencia al cadmio. Así, entonces, encontramos cepas de una misma especie con distintas capacidades adaptativas gracias a la adquisición de grupos de genes especializados en la respuesta a metales, los cuales permiten la supervivencia de ésta en ambientes altamente hostiles. Y más aún, la sola adquisición de un gen que permita el ordenamiento correcto para formar un operón le confiere a la cepa el poder evolutivo necesario para su supervivencia.

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II. PRESENTACIÓN DEL PROBLEMA
Acidithiobacillus ferrooxidans es una bacteria Gram negativa, quimiolitoautotrófica, capaz de utilizar el ion ferroso y una variedad de compuestos reducidos de azufre como fuentes de energía. Este microorganismo además puede crecer en concentraciones elevadas de metales pesados. En la cepa de A. ferrooxidans ATCC 23270 ya se han identificado varios marcos abiertos de lectura (ORFs) relacionados con la resistencia al Cu. Algunos corresponden a componentes ortólogos del sistema Cus de resistencia al Cu de E. coli, dos componentes del sistema de resistencia al Cu de P. syringae y 3 ATPasas de Cu.
Mediante un análisis preliminar del genoma de A. ferrooxidans ATCC 53993 se han identificado el mismo número y tipo de determinantes de resistencia al Cu encontrados en A. ferrooxidans ATCC 23270. Adicionalmente, existe una región de alrededor 200 kb que sólo está presente en A. ferrooxidans ATCC 53993. En esta región se encuentra un número extra de ORFs que posiblemente están relacionados con los determinantes de resistencia al Cu ya identificados en A. ferrooxidans ATCC 23270 y posibles determinantes de resistencia a otros metales.
La presente tesis de pregrado tiene como objetivo caracterizar los patrones de expresión de ORFs potencialmente relacionados con la resistencia a metales pesados presentes en una zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993.

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III. INTRODUCCIÓN
Un pre-requisito mínimo para la vida es la existencia de un gradiente químico redox para convertir energía. Esto permite el flujo de energía y su uso en las reacciones bioquímicas de la célula. La mayoría de las células usan compuestos orgánicos como azúcares a modo de combustibles (donadores de electrones). Su oxidación en la presencia de oxígeno o respiración provee carbón a la célula, generando CO2 y H2O como productos finales y energía en la forma de electrones. Esta energía es almacenada principalmente en forma de ATP para ser usado en el metabolismo celular.
Un grupo especial de microorganismos (Bacterias y Arqueas) conocidos como quimiolitoautotróficos son capaces de utilizar minerales como combustibles. Su oxidación genera electrones para obtener ATP y el carbón es obtenido mediante la fijación de CO2. Durante esta oxidación mineral aeróbica los metales son solubilizados.
La respiración anaeróbica también puede solubilizar metales. En este caso, el mineral actúa como aceptor de electrones y el metal es solubilizado bajo condiciones reductoras. Varios microorganismos son capaces de reducir metales pesados y acoplar su reducción con la oxidación de fuentes de energía tales como compuestos orgánicos.
Estas reacciones son parte del proceso biogeoquímico normal en la naturaleza, realizadas bajo condiciones principalmente ácidas (pH 1-3) por la mayoría de este tipo de microorganismos (Jerez, 2009) por lo que son caracterizados como acidófilos.
Los microorganismos acidófilos están dispersos en distintos ambientes naturales y artificiales, los que son extremadamente ácidos y con una alta concentración de metales pesados. En soluciones de la Montaña de Hierro en California, USA, alcanzan a medirse concentraciones de Fe correspondientes a 1.99 M (111 g/l) y las concentraciones de cobre, cadmio, arsénico y zinc cubren el rango de las decenas de gramos a unos cuantos gramos por litro. Otro claro ejemplo de este tipo de ambientes es el que se da en los procesos mineros de lixiviación bacteriana, en los que además de existir bajos valores de pH, también hay altas concentraciones de metales pesados (revisado en Dopson y cols., 2003). Este proceso se desarrolla por comunidades de microorganismos que participan en el depósito y solubilización de metales pesados, lo que permite la recuperación industrial de metales como el cobre, cobalto, níquel, zinc y uranio, entre otros, extrayéndolos en forma de sulfatos de metal a partir de súlfuros insolubles u óxidos (Rohwerder y cols., 2003).

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Los metales pesados abarcan todos aquellos metales con una densidad sobre los 5 g/cm3, exceptuando Escandio (Sc), Titanio (Ti) e Itrio (Y). De los 90 elementos que se dan en la naturaleza, 21 son no-metales, 16 son metales livianos y los 53 restantes son metales pesados. La mayoría son metales de transición, los cuales se presentan como cationes capaces de formar compuestos complejos con capacidad redox, siendo importantes entonces en algunas reacciones bioquímicas. De los 53 metales pesados solo 22 tienen cierto interés biológico debido a su concentración, considerando el agua de mar como un ambiente promedio. Se distinguen, entonces, 4 grupos de metales pesados como posibles elementos traza: elementos frecuentes cuyas concentraciones van de 100 nM a 1 μM (Fe, Zn, Mo); elementos que van de 10 nM a 100 nM (Ni, Cu, As, V, Mn, Sn, U); elementos raros (Co, Ce, Ag, Sb) y elementos justo bajo 1 nM (Cd, Cr, W, Ga, Zr, Th, Hg, Pb). De todos éstos, 17 son los elementos traza de importancia biológica en función de su solubilidad bajo condiciones fisiológicas y su toxicidad. Los más importantes y menos tóxicos son Fe, Mo y Mn; elementos tóxicos con importancia alta a moderada son Zn, Ni, Cu, V, Co, W y Cr; por último, los más tóxicos y que no poseen beneficio para la célula son As, Ag, Sb, Cd, Hg, Pb y U (revisado en Nies, 1999).
A pesar que los microorganismos requieren la presencia de una cierta cantidad de metales que cumplen un rol bioquímico esencial en el metabolismo, éstos se pueden acumular por encima de las concentraciones fisiológicas normales debido a la acción inespecífica de los sistemas de transporte expresados constitutivamente, volviéndose tóxicos. En el medio intracelular el efecto tóxico de los metales puede reflejarse en la formación de enlaces coordinados con aniones bloqueando los grupos funcionales de las enzimas, inhibiendo sistemas de transporte, desplazando metales esenciales de su sitio de unión natural y perturbando la integridad de la membrana celular.

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Existen 5 mecanismos básicos (Figura 1) que permiten generar la resistencia celular a metales: (1) eflujo del metal tóxico hacia el exterior de la célula; (2) secuestro intra/extracelular; (3) exclusión mediante barrera de permeabilidad; (4) reducción de la sensibilidad de blancos celulares y (5) conversión enzimática (revisado en Dopson y cols., 2003).
Figura 1. Esquema de los mecanismos de resistencia a metales en microorganismos acidófilos. Éstos son, (desde arriba y en el sentido de las agujas del reloj): eflujo del metal tóxico fuera de la célula; unión del metal intra/extracelular reduciendo su toxicidad; exclusión del metal mediante una barrera de permeabilidad; alteración de componentes celulares disminuyendo su sensibilidad al metal tóxico; y conversión enzimática del metal a una forma menos tóxica (Tomada de Dopson y cols., 2003).
El transporte de los metales pesados a través de la célula se logra mediante una variedad de proteínas caracterizadas en diversas familias (revisado en Nies, 1999) (Tabla 1).
Tabla 1. Familias de proteínas importantes para el transporte de metales pesados.
Familia
Dirección del transporte
Energía
Iones metálicos
ABC
Captura
Eflujo
ATP
ATP
Mn2+, Zn2+, Ni2+, Fe2+
---
Tipo-P
Ambas
ATP
Mg2+, Mn2+, Ca2+, K+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+, Ag+
Tipo-A
Eflujo
ATP
Arsenito
RND
Eflujo
Gradiente de protones
Co2+, Zn2+, Cd2+, Ni2+, Cu2+, Ag+
HoxN
Captura
Quimiosmótico
Co2+, Ni2+
MIT
Captura
Quimiosmótico
Mayoría de los cationes
CDF
Eflujo
Quimiosmótico
Zn2+, Cd2+, Co2+, Fe2+
ABC: ATP-binding cassette; RND: resistance, nodulation, cell division; MIT: metal inorganic transport; CDF: cation-diffusion facilitators (Modificada de Nies, 1999).
Es sabido que los microorganismos que participan en los procesos de biolixiviación poseen altos niveles de resistencia a distintos metales pesados (Johnson y Hallberg, 2003), entre los que destaca Acidithiobacillus ferrooxidans, una γ-proteobacteria Gram-negativa quimiolitoautotrófica capaz de oxidar el ion ferroso, azufre elemental o compuestos reducidos del azufre (u oxidados parcialmente) como sustratos energéticos (Valenzuela y cols., 2006; Jerez, 2009, 2011 y 2013). En el caso de la pirita (FeS2), la bacteria, al oxidar el ion ferroso (Fe2+) presente en la solución genera el ion férrico (Fe3+), fuerte oxidante que permite la oxidación química de los enlaces metal sulfuro de la pirita, liberando así Fe2+, que será re-oxidado a Fe3+

6
por acción de A. ferrooxidans, y tiosulfato (S2O32-) que puede ser mayormente oxidado a ácido sulfúrico, la fuente ácida del ambiente (Figura 2) (Jerez, 2009; Dopson y cols., 2003).
Figura 2. Representación de la interacción bacteria-mineral durante el ataque de A. ferrooxidans sobre la pirita generando ion férrico y tiosulfato, el cual es finalmente oxidado a ácido sulfúrico (Tomada de Jerez, 2009 y reproducido de Rohwerder, 2003).
Este microorganismo además puede ser adaptado al crecimiento en altas concentraciones de distintos metales pesados (Das y Modak, 1998; Navarro y cols., 2009). Es así como se reportó una adaptación al crecimiento de hasta 800 mM de Cu en su medio de desarrollo, de hasta 1 M de Zn, hasta 1 M de Ni, hasta 500 mM de Cd y hasta 84 mM de As (revisado en Dopson y cols., 2003) (Tabla 2). Es por este motivo que A. ferrooxidans resulta ser un modelo de estudio muy interesante en cuanto a su capacidad de resistencia a metales pesados.
Tabla 2. Concentración de metales pesados a la que existe actividad metabólica en distintos microorganismos y con especial énfasis en bacterias y arqueas acidófilas.
Basada en Dopson y cols., 2003, Remonsellez y cols., 2006 y Huber y Stetter, 1991. As (III)Cu(II)Zn(II)Cd(II)Ni(II) Bacteria NeutrófilaEscherichia coli4110,51Bacteria AcidófilaAcidiphilium cryptumND1512570020Acidiphilium multivorum30104020350"Acidiphilium symbioticum" KM2ND2015070020"Acidiphilium symbioticum" H8ND1515070030Acidiphilium angustumND58<0,210Acidiphilium cepa GS18hND15601030Acidocella aminolyticaND30500200150Acidocella facilisND<1100<11Acidocella strain GS19hND15900700150Acidithiobacillus ferrooxidans8480010715001000Sulfobacillus thermosulfidooxidansND643ND5Arquea acidófila "Ferroplasma acidarmanus"1316ND9NDMetallosphaera sedula1161501NDSulfolobus acidocaldariusND110101Sulfolobus solfataricusND110100,1Sulfolobus metallicus1,3200300317MicroorganismoConcentración de metal a la que hay actividad metabólica (mM)

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Actualmente se encuentran disponibles para uso público las secuencias de los genomas de dos cepas de esta bacteria: A. ferrooxidans ATCC 23270 y A. ferrooxidans ATCC 53993. Se identificaron ORFs relacionados con la resistencia al Cu en A. ferrooxidans ATCC 23270 y se propuso un modelo de resistencia al Cu en esta bacteria (Figura 3). Se identificaron componentes análogos al sistema Cus de E. coli que le confieren resistencia al Cu. Además se describieron dos componentes del sistema de resistencia y homeostasis al Cu similares a los de P. syringae (CopC y CopD) y un mecanismo de resistencia al Cu en A. ferrooxidans correspondiente a ATPasas de Cu, encontrándose tres de estas proteínas codificadas en el genoma de esta bacteria (AfcopA1, AfcopA2 y AfcopB). Mediante experimentos de PCR en tiempo real se constató un aumento en la expresión de estos genes cuando A. ferrooxidans ATCC 23270 crece en distintas concentraciones de Cu en el medio (Navarro y cols., 2009).
Figura 3. Modelo propuesto para la resistencia al cobre en A. ferrooxidans ATCC 23270. El Cu es sacado desde el espacio intracelular a través de ATPasas de Cu, un sistema de eflujo tipo Cus y por un transportador metal-fosfato asociado al metabolismo de los PoliP. En el espacio periplásmico el Cu también puede ser secuestrado por distintas chaperonas de este metal (afcusF y afcopC) (Tomada de Navarro y cols., 2009).
Además se propuso un mecanismo de resistencia al Cu basado en el metabolismo de los polifosfatos (PoliP) (Álvarez y Jerez, 2004). Se demostró que cuando este acidófilo crece en presencia de Cu existe degradación de PoliP y eflujo de fosfato. Los monómeros de fosfato generados se unirían al Cu dentro del citoplasma de la bacteria. Posteriormente, este metal- fosfato sería bombeado al exterior de la célula por transportadores de fosfato inorgánico, de manera muy similar al sistema propuesto en E. coli (Keasling, 1997; van Veen, 1997).

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Una observación experimental muy interesante es que la cepa ATCC 53993 es más resistente al crecimiento en presencia de cobre que la cepa ATCC 23270. Cuando se exponen a CuSO4 sin previa adaptación, la primera tolera concentraciones de CuSO4 sobre 100 mM mientras la segunda tolera concentraciones menores a 25 mM (Orellana y Jerez, 2011).
Mediante análisis bioinformáticos preliminares de la secuencia del genoma de A. ferrooxidans ATCC 53993 se identificaron el mismo número y tipo de determinantes de resistencia al Cu encontrados en A. ferrooxidans ATCC 23270 y además una zona genómica de aproximadamente 200 kb presente sólo en A. ferrooxidans ATCC 53993 (Figuras 4 y 5), pudiendo contener posibles determinantes de resistencia a cobre y otros metales pesados. A. ferrooxidans ATCC 23270 también posee una zona genómica exclusiva y de mayor tamaño, pero no contiene ORFs relacionados con la resistencia a metales.
Figura 4. Alineamiento entre los genomas de A. ferrooxidans ATCC 23270 (superior) y A. ferrooxidans ATCC 53993 (inferior). El rectángulo azul enmarca la región que sólo está presente en el genoma de A. ferrooxidans ATCC 23270 y el cuadro negro, la región que sólo está presente en ATCC 53993, de longitud y composición diferentes (Valdés, 2008). Alineamiento realizado con el Software Mauve (http://genome.cshlp.org/content/14/7/1394.abstract, Darling y cols., 2004).

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Figura 5. Comparación esquemática entre ambas cepas de A. ferrooxidans indicando genes idénticos relacionados con la resistencia al cobre y la zona genómica exclusiva de la cepa ATCC 53993 (rectángulo verde).
Es en el contexto de las diferencias, en términos de crecimiento y genéticas, encontradas entre ambas cepas que resulta interesante estudiar la expresión diferencial de los posibles determinantes de resistencia a metales pesados exclusivos de A. ferrooxidans ATCC 53993 cuando crece en presencia de diversos metales.
En procariontes, y a diferencia de organismos eucariontes, gran parte de la variabilidad genética se logra a través de mutaciones puntuales, re-arreglos en el genoma y por transferencia horizontal de genes (THG). La THG se produce por transducción, transformación o conjugación entre bacterias y ha resultado clave para la evolución de los microorganismos. Esto se debe a que esta información genética externa puede codificar para nuevas características que pueden resultar en una ventaja adaptativa para el microorganismo receptor.
En general, los fragmentos de DNA que se han transferido desde una bacteria dadora a una receptora y que además poseen los genes que codifican para los mecanismos necesarios para su propia conjugación, se engloban en una definición más amplia denominada “integrative and conjugative elements” (ICE) (Frost y cols., 2005). Bajo ciertas condiciones, estos elementos pueden escindirse del cromosoma, replicarse e integrarse en un huésped. A diferencia de los

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plásmidos, estas estructuras no se mantienen extracromosomalmente. Bajo la categoría de ICE, también están las llamadas Islas Genómicas (IG).
En la actualidad se sabe muy poco del origen de las IG, pero se cree que derivan de plasmidios integrativos o fagos que perdieron los genes necesarios para su propia replicación o transferencia, a cambio de una asociación más estable y heredabilidad al residir en el cromosoma bacteriano (Dobrindt y cols., 2004). Las IG corresponden a regiones del cromosoma que varían entre los 10 y 200 kb (Juhas y cols., 2008) y que son una fuente flexible de genes en el cromosoma bacteriano. Entre otras características, las IG tienen un contenido G:C menor al resto del genoma y generalmente están insertas río abajo de genes de tRNA. Además, en esta región del DNA es posible encontrar genes homólogos a enzimas recombinasas. Estas proteínas pueden ser de las familias de la tirosina o serina recombinasas (Smith y Thorpe, 2002). Sin embargo, la mayor parte de las recombinasas encontradas en IG (o ICEs en general) corresponden a la familia de las tirosina recombinasas (Wozniak y Waldor, 2010). También es posible encontrar una serie de elementos de inserción (IS) y transposones junto a genes relacionados con los mecanismos de conjugación, que son necesarios para la integración y escisión del cromosoma bacteriano. Estos elementos dan la posibilidad de transferencia de genes a otros microorganismos. Por norma general, en esta región es posible encontrar genes que aumentan la adaptabilidad y versatilidad del microorganismo, pudiendo clasificarlas como islas de patogenicidad, cuando causan enfermedad en los huéspedes; islas metabólicas, cuando otorgan la capacidad de usar fuentes alternativas de carbono o nitrógeno; o islas de resistencia, cuando otorgan resistencia a metales o antibióticos; entre otras (Boyd y cols., 2008).

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IV. HIPÓTESIS
Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 posee genes no caracterizados relacionados a la resistencia a metales pesados en una isla genómica, otorgándole a esta bacteria un sistema adicional de resistencia a este tipo de metales.

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V. OBJETIVOS
i. Objetivo General.
Estudiar la expresión diferencial de los posibles determinantes de resistencia a metales pesados que se encuentren en la zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993 cuando es crecida en presencia de metales como cobre, níquel, zinc o cadmio.
ii. Objetivos Específicos.
1. Realizar un análisis bioinformático de la zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993 para identificar posibles genes determinantes de resistencia a metales pesados y diseñar partidores para amplificar fragmentos de los ORFs seleccionados.
2. Obtener cultivos de A. ferrooxidans ATCC 53993 en condición control y adaptados al crecimiento en presencia de cobre, níquel, zinc o cadmio.
3. Determinar los niveles relativos de mRNA de los ORFs relacionados a la resistencia a metales pesados utilizando macro-arreglos de DNA.
4. Realizar un ensayo funcional para medir la capacidad intrínseca de los ORFs que resulten positivos en los experimentos de macro-arreglos.

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VI. DISEÑO EXPERIMENTAL
Realizando múltiples BLAST, gen por gen, con la ayuda preliminar del software MAUVE, se determinó específicamente el inicio y el fin de la zona genómica exclusiva de la bacteria A. ferrooxidans ATCC 53993, puesto que la identidad entre los genes de las cepas ATCC 53993 y ATCC 23270 dejará de ser del 100% en un determinado ORF y volverá a ser 100% idéntico luego de aproximadamente 200 kb, encontrando así los extremos de la región exclusiva. Al resultado aquí obtenido se le hará un posterior análisis de funcionalidad según lo anotado en la base de datos para poder filtrar los ORFs de interés para este estudio, o sea, genes únicos de A. ferrooxidans ATCC 53993 dentro de esta zona genómica que posiblemente estén implicados -o estén en un contexto genómico particular- en la resistencia a metales. Estos serán los genes seleccionados para desarrollar los experimentos en el macro-arreglo.
La bacteria se hará crecer en sulfato de hierro bajo condiciones de agitación y temperatura controladas, manteniendo un stock para los experimentos con los metales y para el experimento control. De este último se extraerá el DNA para la aplicación de la técnica de PCR y así obtener los fragmentos a fijar en las membranas de nylon. Una vez que se logre la adaptación de los cultivos al crecimiento en los distintos metales (Cu, Ni, Zn, Cd y control) se extraerá su RNA para la posterior síntesis de cDNA (sondas) mediante la técnica de la transcripción reversa, incorporando nucleótidos de citosina marcados con fósforo radiactivo, obteniendo así sondas marcadas radiactivamente. En última instancia, la hibridación de estas sondas con los fragmentos fijados en las membranas de nylon permitirá cuantificar la respuesta a nivel transcripcional de cada ORF frente a la presencia de metales pesados.
Los ORFs que resulten tener una expresión significativa en los análisis de macro-arreglos, se sometieron a ensayos de funcionalidad mediante complementación heteróloga en Escherichia coli (E. coli) para obtener, a modo de confirmación, el efecto mismo de la expresión que experimente el gen en presencia de metales. Para esto se requerirá la síntesis de partidores específicos para cada gen que será clonado en un vector de expresión y posteriormente transformado en una cepa competente de E. coli, en la cual se inducirá la expresión del gen en cuestión.

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VII. MATERIALES Y MÉTODOS
i. Análisis bioinformático y diseño de partidores.
Utilizando los genomas secuenciados para A. ferrooxidans ATCC 53993 de la base de datos del Doe Joint Genome Institute (http://www.jgi.doe.gov/) y para A. ferrooxidans ATCC 23270 de la base de datos TIGR (http://cmr.jcvi.org/) se procedió a su comparación y búsqueda minuciosa de la zona genómica exclusiva presente en la cepa ATCC 53993 mediante el uso del software Mauve v.2.3.1 (Darling y cols., 2004) y la herramienta BLAST para nucleótidos del National Center for Biotechnology Information-NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Los criterios de selección de ORFs para este estudio se basaron en que 1) el ORF estuviese dentro de la región genómica en cuestión, 2) los ORFs de ATCC 53993 tuviesen un porcentaje de identidad bajo (< 60%) respecto a los ORFs de ATCC 23270, 3) los ORFs tuviesen relación con la resistencia a metales y 4) los ORFs estuviesen en un contexto genómico relevante para el estudio.
El diseño de partidores para los ORFs seleccionados se realizó con el software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), considerando un largo mínimo de 18 pb para cada partidor (forward y reverse), un contenido de G+C entre 50-60%, Tm entre 55-65 ºC, extremo 3` con terminación de G ó C y un tamaño de 650 pb como máximo para los productos de amplificación (Tabla 3).
Tabla 3. Secuencias de los partidores utilizados.
Nombre de la secuencia
Secuencia 5' a 3'
Secuencia 5' a 3'
225 RV
CGGATCTGGCTGCATACG
217 RV
GCTTCGGCAGTGGATTTG
225 FW
GGCCGGACGGTAACATTG
217 FW
GTGCCTGGAATACGGAAG
224 RV
AGAATCCGGCCAAAGCAG
215 RV
ATGCTGGATCGCATTCTC
224 FW
GGCGTTACTTGCCAATCG
215 FW
CTCGACCCGTCAAATTCC
223 RV
TCAACCCAGAAGGCGTAG
214 RV
CATAACGCAGGGCGAGAG
223 FW
GATCACAGGCCATTGGAG
214 FW
GACAAGTGTGGCCGATGC
220 RV
TACTTGTGCGGGAAGTGC
211 RV
TTCAAGTCGTCGCGTTTC
220 FW
TGGCGATCACCGTCAATC
211 FW
AATACGGAATGGGTTGGG
219 RV
CCCGCGAATCAGAAACAG
204 RV
GACATAACGCATGGCCTC
219 FW
AGCATGGGTGCATCACAG
204 FW
TGGAGTCGGGCTTGTACG
218 RV
TATGGATGGGGCGGATAG
198 RV
ATGATCCAACCCGTGCGA
218 FW
CAGTCCTGAGCGGTTGTG
198 FW
ACCCAATGCAGAAAGGGC

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Secuencia 5' a 3'
Secuencia 5' a 3'
197 RV
GCGCGAATACTTTGGTTTG
146 RV
TGCCAACATGCGATAGAC
197 FW
GAAACTACTCGACGTTGTAGCG
146 FW
CTGGATTTGGGATTGAGC
194 RV
TCTCTACGATTCCCGCAC
142 RV
TCGGATTCGCTCTGTTTG
194 FW
ATGGCGATGATGCAGAAG
142 FW
AATGTGGCTTCATCACCC
193 RV
AGTTCGACCACGCGATCC
141 RV
AGTGGTTGGCTTGCAGAC
193 FW
GGGCCTTGGGTGTCAAGC
141 FW
CGCTTGATGAGCACACAG
192 RV
TGGTATTCTTCGCGGGTG
129 RV
AGTGCGGTGCAATAGGTG
192 FW
GGATAAATAGCGGGTGGG
129 FW
GAGAGCCGACATCAAACG
190 RV
TACGCATTCAACTCCGGC
128 RV
TGCCACAATAGCCACACC
190 FW
CGATTGGCATTGGGATAC
128 FW
CATCAACGCCGGGATTAC
184 RV
TTGCAGATAGACCCAGGC
Sp RV
ACAGCATTGCTGGTCACAG
184 FW
GCTTCTGGTATTGCGTGC
Sp FW
GAGGTGCTTGTGGATATGGAA
182 RV
GCATCCAAGCCGAACAAG
RunX2 RV
CGCTCCGGCCCACAAATCTC
182 FW
CCGTTTGACAGCGTATGG
RunX2 FW
CCGCACGACAACCGCACCAT
179 RV
CGCTTCAGGTTTCCTGGG
DnaK RV
GCACTTCAAACTGGTGTT
179 FW
TGAATAAGCTCCTCGTCGC
DnaK FW
ATGGCTAAAGTGATCGGA
158 RV
GAATCAATGTGTTGCGCC
GroEL RV
TAGGGATTCTCCAGTTCG
158 FW
ACTGTCCAAGCCTCGCTG
GroEL FW
ATGCCAGCCAAACAAGTA
155 RV
TGCATTTCCGTTTCGCTC
Rus RV
CTTGACAACGATCTTACCGAACATA
155 FW
AGGTGCCCAACCTCATTC
Rus FW
ATGTATACACAGAACACGATGAAAA
153 RV
TCTGGCAATCTGCGTGTG
RibS RV
CCCAGCGTTCCAGATAGC
153 FW
ACGCTTTCTGCCGCTATG
RibS FW
CTCGCAGATGTCGGGTTG
152 RV
CTTCATGGGCCGGTACAC
CopA RV
TCTCCGCCTTTTGTCCAGGG
152 FW
CCGCTATTTCGCCAGTTC
CopA FW
TCAGCATGAGCGGATCGCG
151 RV
AGCGAAGGCAGTGAGGAG
CusC RV
CGCTGACCGTGACTTCCG
151 FW
GCGTCCATAAGGCCCAAC
CusC FW
CGCAAATCGCGCAGATCC
148 RV
ATGGCCCTGCTTATGGAC
CusF RV
GCGTGACCCTGGTGATGAC
148 FW
GGTATCTGACCGTTTCGC
CusF FW
TGGACAATATGGGCACCGT
147 RV
TGCATTGCCGTAGAAAGC
147 FW
CAGCACCCGATAAGCAAG
Desde 225 hasta 128 corresponden a ORFs de la zona genómica de A. ferrooxidans ATCC 53993 que se diseñaron para este estudio. Sp y RunX2 corresponden a genes exógenos. Desde DnaK hasta CusF corresponden a genes control.

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También se diseñaron partidores específicos para los ensayos de co-transcripción como lo indica la siguiente tabla (Tabla 4):
Tabla 4. Partidores específicos utilizados en experimentos de co-transcripción.
Secuencia 5' a 3'
Lferr_0211_FW
TGGGTTGGGGATGGGGGTGG
Lferr_0211_RV
ACGCTTCAAGTCGTCGCGTT
Lferr_0210_FW
GGCAAGGCGGTCGCGTCTAC
Lferr_0210_RV
GCCGAACCTCACTGGCCAACC
Lferr_0209_FW
TCGGCAAACGCTACAGCCCG
Lferr_0209_RV
AAAACTCCCGTCCGCCCACC
Lferr_0208_FW
TCAGGCCCTTGCCGATCCGA
Lferr_0208_RV
GCCAGTTCGGGCGTCTGGATG
Por último, se diseñó un par de partidores para realizar los ensayos de funcionalidad según lo muestra la siguiente tabla (Tabla 5):
Tabla 5. Diseño de partidores específicos utilizados en experimentos de funcionalidad.
Secuencia 5' a 3'
Lferr_0209_FW_EF
AAGGAGAATATACATATGGCGTGCTCGTGCTCCCC
Lferr_0209_RV_EF
TTACGTCCTGAGCATGCGCAGCCC
En negrita se destaca la secuencia Shine-Dalgarno.
ii. Crecimiento de A. ferrooxidans en condición control.
Para el crecimiento de A. ferrooxidans ATCC 53993 se utilizó el medio de cultivo 9K modificado (en g/L: 0,1 (NH4)2SO4; 0,4 MgSO4*7H2O; 0,04 K2HPO4*3H2O) con ion ferroso como fuente de energía (33,3 g/L FeSO4*7H2O). Se ajustó el pH con H2SO4 a un valor de 1,45 y se esterilizó en autoclave a 121 ºC durante 20 min. A partir de un cultivo stock se inoculó A. ferrooxidans al 10% v/v en matraces de 2 L en un volumen total de 600 mL de cultivo y se mantuvo con agitación constante a 150 rpm a una temperatura de 30 ºC.
iii. Crecimiento de A. ferrooxidans en presencia de metales pesados.
Para incorporar los metales pesados al medio de cultivo se usaron soluciones stock 1 M de MSO4 (sulfato del metal: CuSO4*5H2O, 3CdSO4*8H2O, NiSO4*6H2O o ZnSO4*7H2O) preparadas en medio 9K modificado y filtradas bajo condiciones de esterilidad (Millex GV 0,22 μm, Durapore PVDF).

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Por medio de sucesivos sub-cultivos a partir de la condición control y utilizando incrementos graduales de la concentración del MSO4 se obtuvieron cultivos de A. ferrooxidans ATCC 53993 adaptados al crecimiento con el metal en concentraciones de 200 mM para el caso de Cu, Ni o Zn y de 100 mM para el caso de Cd.
Se realizaron curvas de crecimiento para cada una de las condiciones del metal ensayadas y para la condición control. El crecimiento se determinó mediante el recuento celular utilizando una cámara Petroff-Hausser y el microscopio óptico Olympus BX50 según la ecuación:
푁ú푚푒푟표 푑푒 푐é푙푢푙푎푠×1000 푠푢푝푒푟푓푖푐푖푒 푟푒푐표푛푡푎푑푎 (푚푚2)×푝푟표푓푢푛푑푖푑푎푑 푑푒 푙푎 푐á푚푎푟푎 (푚푚)×푑푖푙푢푐푖ó푛 =푐é푙/푚퐿
iv. Obtención del material genético.
1. DNA de A. ferrooxidans.
Se obtuvo DNA genómico de A. ferrooxidans ATCC 53993 a partir de 100 mL de un cultivo de células en condición control crecidas hasta la fase de crecimiento exponencial tardía (~108 cél/mL) utilizando el kit de extracción de DNA genómico Wizard® (Promega). Este kit se basa en la lisis celular seguido de una digestión enzimática del RNA con una posterior precipitación del DNA genómico con isopropanol y solubilización final en agua.
a) Colección, Lavado y Lisis Celular.
Las células se colectaron por centrifugación a 5500 x g por 30 min y por cada 200 mL de cultivo se lavaron 2 veces con 1 mL de agua ácida (agua bidestilada con H2SO4c hasta pH = 1,45 y autoclavada) y 2 veces con 1 mL de citrato de sodio 10 mM pH 7 (agua bidestilada con ácido acético glacial hasta pH = 7 y filtrada bajo mechero). Luego de cada lavado se centrifugó durante 1 min a 10000 x g para colectar las células. Una vez lavadas, las células se resuspendieron pipeteando en 400 μL de Solución de Lisis (acetato de sodio 0,02 M; EDTA 1 mM; pH 5,5 ajustado con ácido acético glacial; SDS 0,5 % p/v y agua bidestilada para completar el volumen final), se incubaron a 70 ºC durante 10 min y se enfriaron a Temperatura ambiente. Luego de este pre-tratamiento se procedió a la extracción del DNA genómico según las instrucciones del fabricante y finalmente se resuspendió en 100 μL de agua libre de nucleasas.

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b) Electroforesis de DNA en geles de Agarosa.
La integridad del DNA se chequeó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en TAE 0,5X (20 mM Tris-acetato pH 8,0; 0,5 mM EDTA) en condiciones no desnaturalizantes. Todas las muestras se mezclaron con amortiguador de carga 6X (0,25 % de bromofenol; 40 % sacarosa) y se separaron a 100 V por 20 min. Finalmente, los geles se tiñeron por 10 min en una solución de bromuro de etidio (0,2 μg/mL) y se visualizaron por la fluorescencia emitida bajo luz ultravioleta a 320 nm.
c) Cuantificación de DNA.
La cuantificación del DNA genómico se realizó por su absorbancia a 260 nm (A260) de una dilución de 50 veces en el espectrofotómetro de multi-volúmenes Epoch (Biotek, USA). Se utilizó una preparación de DNA genómico con una razón A260/A280 > 1,8, lo que se considera con una baja cantidad de proteínas. El DNA se almacenó en alícuotas a -20 ºC hasta su uso. Este DNA se usó como templado para las reacciones de PCR.
2. RNA de A. ferrooxidans.
Se extrajo el RNA total de A. ferrooxidans ATCC 53993 para cada condición de este estudio utilizando una versión modificada del método de TRIzol (Invitrogen). Este reactivo es una solución de fenol ácido e isotiocianato de guanidinio propuesto como una mejora del método original de Chomczynski y Sacchi (1987). El fenol ácido permite la partición del RNA en la fase acuosa y el isotiocianato de guanidinio la desnaturalización de proteínas como las RNasas. Para la extracción del RNA se usaron células en fase exponencial tardía de crecimiento.
a) Colección, Lavado y Lisis Celular.
Las células se colectaron por centrifugación a 5500 x g por 30 min y por cada 150 mL de cultivo se lavaron 2 veces con 1 mL de agua ácida y 2 veces con 1 mL de citrato de sodio 10 mM pH 7. Luego de cada lavado se centrifugó durante 1 min a 10000 x g para colectar las células. Una vez lavadas, las células se resuspendieron pipeteando en 400 μL de Solución de Lisis en tubos Eppendorf de 2 mL libres de RNasa y se incubaron a 70 ºC durante 10 min.

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b) Extracción de RNA total.
A cada resuspensión celular se le agregó 1 mL de solución de TRIzol y se mezcló pipeteando. Esta mezcla se incubó durante 10 min a 70 ºC y posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 5 min. Se agregaron 200 μL de cloroformo y se agitó con la mano durante 20 seg. Se incubó por 2 min a temperatura ambiente y a continuación se centrifugó a 12000 x g durante 15 min a 4 ºC y se recuperó la fase acuosa superior contenedora del RNA. Luego se procedió a la precipitación del RNA añadiendo 1/10 volumen de acetato de sodio 3 M pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Se mezcló vigorosamente y se dejó precipitar el RNA a -20 ºC toda la noche. Luego de la precipitación, se recuperó el RNA por centrifugación a 15700 x g durante 30 min a 4 °C y se lavó 2 veces con 1 mL de etanol al 70%, centrifugando 10 min a 15700 x g a 4 ºC después de cada lavado. Finalmente, el RNA se resuspendió en 15 μL de agua DEPC (agua bidestilada con DEPC al 0,1 % v/v con agitación constante toda una noche bajo campana y autoclavada al día siguiente).
c) Tratamiento con DNasa.
Para eliminar la posible contaminación por DNA, el RNA se trató con 4U de la enzima DNasa libre de RNasa “TURBO DNA-free” (Ambion) durante 1 hr a 37 ºC. Se usó un volumen final de 100 μl y se siguió el protocolo sugerido por el fabricante. Finalmente se precipitó, recuperó y lavó el RNA tal cual fue descrito en el apartado anterior.
d) Electroforesis de RNA en geles de Agarosa.
La integridad del RNA se chequeó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en TAE 0,5X (20 mM Tris-acetato pH 8,0; 0,5 mM EDTA) en condiciones no desnaturalizantes. Todas las muestras se mezclaron con amortiguador de carga 6X (0,25 % de bromofenol; 40 % sacarosa) y se separaron a 100 V por 20 min. Finalmente, los geles se tiñeron por 10 min en una solución de bromuro de etidio (0,2 μg/mL) y se visualizaron por la fluorescencia emitida bajo luz ultravioleta a 320 nm.
e) Cuantificación de RNA.
La cuantificación del RNA total se realizó por la medición de su absorbancia a 260 nm (A260) en el espectrofotómetro de multi-volúmenes Epoch (Biotek, USA). Se utilizó una

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preparación de RNA total con una razón A260/A280 > 1,8, lo que se considera con una baja cantidad de proteínas. El RNA se almacenó en alícuotas a -20 ºC hasta su uso. Este RNA se usó como templado para las reacciones de síntesis de cDNA.
3. mRNA de exp-1.
Se obtuvo el mRNA de exp-1 (expansina de Prunus persica) mediante transcripción in vitro para luego usar su respectivo cDNA como “spiked” (Sp), a modo de control de marcaje e hibridación, en los macro-arreglos de DNA. Para esto se utilizó el sistema de transcripción in vitro Riboprobe de Promega tomando como templado el plasmidio resistente a ampicilina pGEMTeasy/exp-1 gentilmente donado por V. Cambiazo (Laboratorio de Bioinformática y Expresión Génica, INTA). A la fecha de inicio de esta tesis, este plasmidio ya había sido transformado en células DH5α quimiocompetentes.
a) Extracción DNA plasmidial.
Células de E. coli DH5α transformadas con el plasmidio pGEMTeasy/exp-1 se inocularon en 20 mL de medio LB a una dilución 1/200 y se crecieron durante 14-16 h a 37 ºC y con agitación de 300 rpm. A las 3 h de crecimiento se añadieron 20 μL de ampicilina (100 mg/mL). Se colectaron 6 mL de cultivo celular repartidos en 4 tubos Eppendorf de 1,5 mL por centrifugación a 10000 x g durante 2 min. Se procedió a la purificación de los plasmidios con la utilización del kit “E.Z.N.A. plasmid kit II” según las indicaciones del fabricante. Este kit se basa en el método de la lisis alcalina y además usa una mini columna que permite separar el DNA de otras macromoléculas. Finalmente se mezclaron todos los eluatos de DNA en un volumen final de 400 μL.
b) Digestión enzimática.
Con el fin de linealizar el plasmidio pGEMTeasy/exp-1, éste se digirió con la enzima de restricción SalI, que corta específicamente en un sitio de este vector. Para esto, en un volumen final de 20 μL se añadieron 2 μL de Buffer O 10X, 1 μL de SalI y 1,75 μg de DNA plasmidial. La mezcla se incubó durante 2 h a 37 ºC para la digestión. Luego se incubó durante 20 min a 65 ºC para inactivar la enzima y el volumen total se aplicó en un gel de agarosa al 0,7% para la separación de los fragmentos por electroforesis seguida de su visualización por tinción con bromuro de etidio.

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c) Purificación de fragmentos de DNA.
Se procedió a la extracción del plasmidio lineal utilizando el kit “E.Z.N.A. Gel Extraction Kit” (Omega Bio Tek) según las instrucciones del fabricante. Básicamente, se corta desde el gel de agarosa la región que contiene la banda de interés. Posteriormente, la agarosa se disuelve a temperatura elevada y se transfiere la mezcla a una columna donde el DNA queda retenido. Posteriormente, el DNA se lava con etanol y se eluye con agua nano pura. Finalmente, se conserva esta fracción a -20 ºC para futuros usos.
d) Transcripción In vitro del gen exp-1.
Utilizando el sistema de transcripción in vitro Riboprobe de Promega y en un volumen final de 100 μL se usaron: 600 ng de DNA plasmidial lineal; 40 U de T7 RNA polimerasa; 0,5 mM de cada uno de los oligonucleótidos; amortiguador de transcripción in vitro 1X; DTT 10 mM y 100 U de inhibidor de ribonucleasas recombinante (RNasin de Promega). El volumen final se alcanzó con agua libre de nucleasas y la mezcla de reacción se incubó por 2 h a 37 ºC. Finalmente se trató el RNA con 1 U de DNasa RQ1 libre de RNasa (Promega) incubando durante 15 min a 37 ºC y se extrajo según las instrucciones del fabricante. Se chequeó la integridad física del RNA en gel de agarosa y se cuantificó su concentración en el espectrofotómetro Nano (IMPLEN).
v. Macro-arreglos de DNA.
Se emplearon protocolos ya utilizados en nuestro laboratorio (Acosta y cols., 2005; Valenzuela y cols., 2006; Beard, 2008).
1. Productos de PCR.
Los productos de PCR que se sembraron en las membranas de nylon se obtuvieron mediante la amplificación de los fragmentos correspondientes a cada uno de los 39 pares de partidores usando como templado el DNA genómico de A. ferrooxidans ATCC 53993 previamente extraído más los fragmentos correspondientes a los 2 pares de partidores de genes exógenos Spike y RunX2 usando como templados el plasmidio pGEMTeasy/exp-1 y cDNA de líneas celulares pre-osteoblásticas, respectivamente. Este último material fue gentilmente donado por A. Aránguiz (Laboratorio Dr. Mario Galindo, Facultad de Medicina, ICBM, Universidad de Chile). En general, se usó el siguiente formato para las reacciones de PCR: 20 ng de templado; 200 μM de dNTPs; 5% v/v DMSO; 0,2 μM de cada partidor; 2,5 mM de MgCl2; Buffer GoTaq

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1X; 1,25 U de GoTaq DNA Polimerasa en un volumen final de 50 μL. Se utilizó un protocolo de PCR tipo “Hot-Start” consistente en una desnaturalización inicial de 3 min a 95 ºC, treinta ciclos de desnaturalización a 95 ºC por 30 s, anillamiento por 30s a “T” ºC y extensión por 45 s a 72 ºC, seguidos de una extensión final de 3 min a 72 ºC. Se revisaron todos los amplicones después de separarlos por electroforesis en gel de agarosa al 1% en 0,5X TAE. Desde el gel se purificaron los fragmentos de interés utilizando el kit “E.Z.N.A. Gel Extraction Kit” (Omega Bio Tek) según las instrucciones del fabricante. Su concentración se cuantificó por su absorbancia a 260 nm y se diluyeron a 5 ng/μL en un 40% v/v de DMSO.
2. Sembrado de las membranas de nylon.
80 μL de cada dilución de los fragmentos de DNA se colocaron en una placa para cultivos celulares de 96 pocillos, incluyendo DMSO al 40% v/v. Se sembró manualmente en membranas de nylon Inmobilon-Ny+ desde la placa ELISA utilizando el Multi-blot Replicator (V&P Scientific). Cada dilución se sembró 3 veces (0,1 μL de cada amplicón ~ 1,5 ng de DNA total) y en cuadruplicado. Las membranas se secaron al aire y se trataron con solución de desnaturalización (0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl) por 7 min sin agitación y posteriormente se incubaron 2 veces por 3 min en solución de neutralización (0,5 M Tris-HCl pH 8,0; 1,5 M NaCl; 1 mM EDTA) con agitación suave, secándolas al aire. El DNA se entrecruzó a la membrana por irradiación con luz UV (254 nm) a 0,12 J/cm2 durante 2,5 min en un Hibrilinker HL-200 (UVP Laboratory Products).
3. Marcaje de las sondas de cDNA.
A partir del RNA total de A. ferrooxidans se sintetizó el cDNA incorporando [α-32P]dCTP utilizando los partidores reversos específicos para cada fragmento de DNA obtenido por PCR impreso en la membrana y la enzima transcriptasa reversa ImPromII (Promega) en un volumen final de reacción de 100 μL (5 μg de RNA total; 1,5 ng de RNA exp-1; 10 pmol de cada oligonucleótido específico; 800 μM de dNTPs sin dCTP; 30 μCi [α-32P]dCTP; 3,5 mM de MgCl2; 40 U de RNasin; 4 μL de ImPromII). Previo a la transcripción reversa, la mezcla de RNA total y de exp-1 se hibridó con los oligonucleótidos específicos durante 5 min a 70 ºC. Se procedió a la transcripción reversa por 1 h a 42 ºC y luego de esto se inactivó la enzima a 65 ºC por 15 min y el RNA se degradó mediante tratamiento con 0,2 M NaOH a 37 ºC por 15 min y se

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neutralizó con 0,25 M de buffer HEPES. Las sondas de cDNA marcado se purificaron usando las columnas S-200 HR (Amersham) según las instrucciones del fabricante.
4. Hibridización, lavado y exposición de las membranas.
Se hibridizó una membrana en duplicado por cada sonda obtenida. Las membranas se humedecieron previamente en 2X SSPE (10X SSPE: 1,8 M NaCl; 100 mM Na2HPO4 pH 7,7; 10 mM EDTA) durante 5 min a temperatura ambiente. Luego se pre-hibridizaron en 5 mL de solución de hibridización (5X SSPE; 2% p/v SDS; 1X solución de Denhardt; 100 μg/mL de DNA de esperma de salmón) a 65 ºC por 2 a 4 h. Posteriormente, las membranas se hibridizaron durante toda la noche a 65 ºC en los 5 mL de solución de hibridización junto con la sonda de cDNA obtenida previamente desnaturalizada en agua hirviendo durante 5 min e inmediatamente enfriada en hielo. A la mañana siguiente se procedió al lavado de las membranas con 25 mL de solución de lavado (0,5X SSC; 0,2% p/v SDS) 2 veces a temperatura ambiente durante 5 min, seguidos de 2 lavados a 65 ºC durante 20 min. Finalmente se remojaron las membranas 2 veces en 0,5X SSC para remover el SDS. Las membranas se envolvieron en película plástica y se expusieron en una pantalla K-Screen (Kodak) por 2 días para finalmente escanearlas en un PhosphorImager (Molecular Imager FX system, Bio-Rad) utilizando el programa Quantity One v.1.0 (Bio-Rad). La cuantificación y análisis de las manchas obtenidas se realizó con el programa VersArray (Bio-Rad) y Excel (Microsoft Office).
5. Normalización y tratamiento de los datos.
La intensidad neta (IN), correspondiente a la intensidad cruda promedio de la señal (IC) menos el valor de intensidad de su ruido de fondo local promedio (IFX), que se obtuvo para cada mancha, se normalizó mediante la intensidad neta promedio de las manchas de exp-1 presentes en cada membrana, obteniendo así la intensidad neta relativa (INR). Siendo la relación señal-ruido Qsr > 0,51, donde Qsr = [IC/(IC+IFX)] (Wang y cols., 2001), la INR de las diferentes réplicas biológicas (x3) de RNA y técnicas (x2) de hibridación para cada mancha y en cada condición se promediaron. Así se obtuvo la intensidad neta relativa promedio (INRX).
vi. Ensayo de co-transcripción.
A partir de la síntesis de cDNA descrita en el punto 3 de la sección anterior, pero sin la incorporación de [α-32P] a dCTP, en general, se usó el siguiente formato para las reacciones de PCR, usando los componentes de la enzima GoTaq: 4 μL de cDNA 1/20; 200 μM de dNTPs; 5%

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v/v DMSO; 0,2 μM de cada partidor; 2,5 mM de MgCl2; Buffer GoTaq 1X; 1,25 U de GoTaq DNA Polimerasa en un volumen final de 25 μL. Se utilizó un protocolo de PCR tipo “Hot-Start” consistente en una desnaturalización inicial de 5 min a 95 ºC, 35 ciclos de desnaturalización a 95 ºC por 30 s, anillamiento por 30 s a “T” ºC y extensión por 1 min a 72 ºC, seguidos de una extensión final de 3 min a 72 ºC. Se revisaron todos los amplicones por electroforesis en gel de agarosa al 1% en 0,5X TAE.
vii. Ensayo funcional.
Para el gen de interés se sintetizó un partidor “forward” especial, con una cabeza Shine- Dalgarno en el extremo 5`, como lo indica la Tabla 5. Se purificó su producto de PCR, se clonó en el vector pGEMTeasy y se transformó en E. coli TOP10 con el fin de seleccionar los clones correctamente orientados. Estos últimos se transformaron finalmente en células BL21 para llevar a cabo los ensayos de funcionalidad.
1. Clonamiento.
Una vez obtenido el fragmento de DNA correspondiente al gen de interés, se clonó en el vector pGEMTeasy. Para esto se tomaron 0,5 μL del vector (5 ng de DNA plasmidial); 1 μL del producto de PCR purificado (10-20 ng de DNA aproximadamente); Buffer 1X; 1 μL de ligasa y agua nano pura hasta completar los 6 μL. La reacción se dejó incubar por 1 hr a 16 ºC.
2. Transformación de TOP10.
El producto de la reacción de clonamiento entre el vector pGEMTeasy y el gen de interés se utilizó para la transformación por “shock” térmico de la cepa “One Shot TOP10” (Invitrogen) de E. coli. Para esto se incubaron 50 μL de células y 3 μL del producto de ligación en hielo por 30 min. Luego, esta mezcla se incubó a 42 ºC por 45 s y después 5 min en hielo. Posteriormente, a esta reacción se le agregó 250 μL de medio S.O.C (2% triptona, 0,5% extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucosa) y se incubó por 1 h a 37 ºC con agitación suave. Finalmente, alícuotas de 30 μL de esta mezcla se esparcieron en medios sólidos de LB suplementados con ampicilina (100 mg/L), 40 μL de X-gal y 1 mM IPTG y se dejaron incubando a 37 ºC toda la noche.

25
3. Transformación de BL21.
De la transformación de TOP10 se seleccionaron las colonias blancas, se procedió a la extracción y purificación del plasmidio con la utilización del kit “E.Z.N.A. plasmid kit II” según las indicaciones del fabricante y se chequeó la correcta orientación del inserto mediante el corte con enzimas de restricción. Posteriormente se realizó la transformación de la cepa de E. coli “One Shot BL21(DE3)” (Invitrogen) mediante “shock” térmico, tal cual fue descrito anteriormente.
4. Halos de Inhibición.
Para el desarrollo de estos experimentos, los clones que contenían los determinantes de resistencia se crecieron por toda la noche en medio LB-ampicilina-IPTG. Este cultivo se diluyó 100 veces y se incubó con agitación a 37 ºC hasta que alcanzó una OD600 de 0,6, momento en que se diluyó 10 veces. De esta dilución se sembraron 100 μL sobre placas LB-ampicilna-IPTG, las que se dejaron secar durante 20 min a temperatura ambiente y se colocó un disco de papel filtro en el centro de la placa. Sobre este disco se aplicaron 15 μL de una solución 1 M de CdSO4 estéril. Las placas se incubaron durante 18 h a 37 ºC y se determinó al área de inhibición del crecimiento alrededor del disco que contenía cadmio (Bauer y cols., 1966).

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VIII. RESULTADOS
i. Características de la zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993.
El análisis bioinformático realizado muestra que la zona genómica exclusiva de la cepa ATCC 53393 (Figura 6) se inserta después del ORF Lferr_0127 (AFE2898 en la cepa ATCC 23270), anotado como una enzima relacionada con el metabolismo de los t-RNA (tipo MiaB) y antes del ORF Lferr_0299 (AFE2897 en la cepa ATCC 23270), anotado como un gen relacionado con la fijación de nitrógeno (Nif-U). Tiene una elongación de 163.564 pb, representando un 5,67% del total del genoma y conteniendo un total de 169 genes desde el ORF Lferr_0128 al Lferr_0298, inclusive. Por otra parte, en esta región de DNA exclusiva de la cepa ATCC 53993 es posible encontrar diversos elementos característicos de una isla genómica (IG). Entre ellos están: estar inserta a continuación de un gen relacionado con el metabolismo de los tRNA y contiguo a un gen que codifica para una recombinasa (dominio serina resolvasa). Otro elemento característico de IG es la diferencia del porcentaje G:C puesto que la región exclusiva de la cepa ATCC 53993 tiene un porcentaje G:C de 57,2% mientras que el porcentaje G:C del genoma sin la IG es de 58,9%. Adicionalmente, es posible encontrar varios ORFs anotados como recombinasas del tipo integrasas y transposasas. Los ORFs Lferr_0180 y Lferr_0181 están anotados como transposasas, el primero asociado al elemento de inserción ISPsy14 y el segundo, a una integrasa, como también lo está el ORF Lferr_0215. Además, se encuentran una serie de ORFs anotados como transposasas de la familia IS4 (Lferr_0150, Lferr_0196 y Lferr_0201). También es posible encontrar elementos de transposición del tipo Tn-7. Los ORF Lferr_0144 y Lferr_0221 codifican para las proteínas C y B de este elemento, respectivamente, y el ORF Lferr_0145 para una recombinasa tal vez relacionada con este elemento de inserción. En total, encontramos 10 de estos elementos representativos de la movilidad genética.
En esta región también se encuentran una serie de componentes relacionados con la conjugación y que pertenecen al sistema de secreción tipo cuatro (SST4), cuales son Lferr_0242, Lferr_0244, Lferr_0245, Lferr_0246, Lferr_0247, Lferr_0249, Lferr_0251, Lferr_0256, Lferr_0257, Lferr_0258, Lferr_0259, Lferr_0261, Lferr_0262, Lferr_0264, Lferr_0272, Lferr_0273, Lferr_0276, Lferr_0279, Lferr_0283 y Lferr_0293 (un gen de transcriptasa reversa), sumando un total de 20 genes relacionados al SST4. Por otra parte, es posible encontrar una serie de ORFs relacionados con la resistencia a metales como el mercurio, arsénico, cadmio, cobre y otros. Existen 10 elementos relacionados a la regulación transcripcional de los cuales dos

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pertenecen a la familia MerR (Lferr_0159 y Lferr_0164) y tres a la familia ArsR (Lferr_0187, Lferr_0191 y Lferr_0208). Hay otros 18 genes implicados en la resistencia, como lo son Lferr_0160 y Lferr_0163 de la familia MerC. En el caso del Cu es posible encontrar un gen que codifica para una ATPasa de Cu (Lferr_0167), un sistema de eflujo tipo Cus (Lferr_0170, Lferr_0171, Lferr_0172 y Lferr_0174), una chaperona de Cu tipo CusF (Lferr_0199) y una ATPasa de eflujo de metales (Lferr_0186) (Orellana y Jerez, 2011). También es posible encontrar una ATPasa tipo P (Lferr_0209) que posiblemente está relacionada con Cd/Zn/Pb/Hg pues su sitio de traslocación CPCALVIS ha sido descrito para el transporte de Cd2+, Zn2+, Pb2+ y Hg2+.
Dadas estas propiedades donde se ve claramente la sobre-representación de elementos móviles y otros relacionados a la resistencia a metales, sumado a 77 ORFs cuya función no se ha podido definir con certeza y solo alcanzan la denominación de “Proteínas Hipotéticas” y el gran tamaño de esta zona genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993 (160 kb) es posible referirse entonces a ella como una Isla Genómica propiamente tal.

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Figura 6. Esquema resumen del análisis bioinformático donde se indican las propiedades básicas de la IG de A. ferrooxidans ATCC 53993. Entre ellas, una longitud de 163.564 pb, conteniendo 169 genes, de inicio en el ORF 128 (ORF 127 es 100% idéntico a AFE_2898 de la cepa ATCC 23270 correspondiente al gen rimo) y de término en el ORF 298 (ORF 299 es 100% idéntico a AFE_2897 de la cepa ATCC 23270 correspondiente al gen nifU). Se indican, también, los genes de resistencia a cobre descritos para A. ferrooxidans ATCC 23270 que se encuentran en el genoma (Navarro y cols., 2009) y en la IG de ATCC 53993 (Orellana y Jerez, 2011). Pequeñas flechas verdes corresponden a elementos de transposición a lo largo de todo el genoma.

29
Figura 7. Detalle de la Isla Genómica. Flechas en azul indican los ORFs que flanquean la IG. Flechas blancas indican los 32 ORFs seleccionados para estudiar resistencia a metales.

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ii. Crecimiento de A. ferrooxidans ATCC 53993.
Según da cuenta la Figura 8, el crecimiento de la bacteria en estudio y bajo las condiciones descritas previamente en Materiales y Métodos llegó a un nivel máximo del orden de 108 cél/mL a partir del orden de 106 cél/mL con una tasa media de crecimiento generacional de 10,17 hrs.
Figura 8. Curva de crecimiento de A. ferrooxidans ATCC 53993 en presencia o ausencia de metales.
Queda claro el efecto del cadmio sobre el crecimiento bacteriano, puesto que su máximo apenas llegó a 1,05*108 cél/mL a pesar de haber sido adaptada a la concentración de 100 mM durante sucesivos sub-cultivos y su tasa media de crecimiento generacional fue de 20,71 hrs. No obstante, se logró obtener cultivos con la suficiente cantidad de bacterias y en un mismo lapso de tiempo para poder realizar las extracciones de RNA necesarias.
Contrario a lo observado en presencia de cadmio, todos los otros metales ensayados y doblemente concentrados tuvieron un efecto positivo sobre el crecimiento bacteriano. Todos los recuentos celulares fueron mayores que la condición control desde un principio y se mantuvieron así hasta el final. Mientras el máximo alcanzado para la condición control fue de 2,35*108

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cél/mL, para níquel fue de 4,05*108 cél/mL, para zinc fue de 3,05*108 cél/mL y para cobre fue de 3,28*108 cél/mL.
La tasa promedio de crecimiento generacional para las células control fue de 8,73 hrs mientras que para las células en presencia de níquel fue de 8,04 hrs. Tanto la condición en zinc como en cobre presentan tasas de crecimiento menores, correspondientes a 13,47 hrs y 11,83 hrs, respectivamente.
iii. Obtención del material genético.
1. Productos de PCR.
Tras definir los parámetros de selección para escoger los genes a estudiar se procedió a su amplificación, separación por electroforesis, visualización y purificación desde el gel de agarosa a partir de un cultivo control de A. ferrooxidans ATCC 53993. La Figura 9 muestra los 41 productos de PCR analizados en este trabajo.
Figura 9. Productos de PCR. A. Imagen de un gel de agarosa al 1% que muestra 38 productos de PCR purificados. Los carriles corresponden, del 1 al 32, a los siguientes ORFs: 1, ORF_225 (611 pb); 2, ORF_224 (201 pb); 3, ORF_223 (257 pb); 4, ORF_220 (295 pb); 5, ORF_219 (294 pb); 6, ORF_218 (214 pb); 7, ORF_217 (271 pb); 8, ORF_215 (610 pb); 9, ORF_214 (283 pb); 10, ORF_211 (220 pb); 11, ORF_204 (254 pb); 12, ORF_198 (276 pb); 13, ORF_197 (201 pb); 14, ORF_194 (349 pb); 15, ORF_193 (469 pb); 16, ORF_192 (217 pb); 17, ORF_190 (563 pb); 18, ORF_184 (604 pb); 19, ORF_182 (206 pb); 20, ORF_179 (200 pb); 21, ORF_158 (241 pb); 22, ORF_155 (580 pb); 23, ORF_153 (608 pb); 24, ORF_152 (592 pb); 25, ORF_151 (529 pb); 26, ORF_148 (232 pb); 27, ORF_147 (598 pb); 28, ORF_146 (300 pb); 29, ORF_142 (606 pb); 30, ORF_141 (596 pb); 31, ORF_129 (237 pb); 32, ORF_128 (605 pb). Entre los carriles 33 y 38 están los productos de PCR correspondientes a los siguientes
A
B

32
genes: 33, Spike (600 pb); 34, Rus (561 pb); 35, GroEL (656 pb); 36, DnaK (655 pb); 37, RibS (484 pb); 38, RunX2 (289 pb). B. Gel de agarosa al 1% que muestra los productos de PCR correspondientes a CopA (300 pb), CusC (400 pb) y CusF (200 pb).
Del total de los 41 genes, 39 correspondían a A. ferrooxidans ATCC 53993. El gen runx2 cumplió la función de gen exógeno usado como control negativo de hibridación y el gen exp-1 cumplió con la función de gen normalizador en los ensayos de macro-arreglos. Otros 7 genes se amplificaron y purificaron con el fin de ser utilizados a modo referencial en estos ensayos. En esta categoría se encuentran Rus, GroEL, DnaK, RibS, CopA, CusC y CusF. De ahí que sean exclusivamente 32 los genes de la isla genómica seleccionados para medir su expresión relativa. Para su selección, se procedió a la comparación gen por gen entre ambas cepas de A. ferrooxidans, de modo tal que los genes seleccionados sólo correspondieran a ATCC 53993 y que además cada gen no tuviera repeticiones fuera de la IG. Es así como el criterio que marcó la diferencia fue que el grado de identidad entre los genes de ambas cepas no superara el 60%, considerando además un “E value” > e-10 y un “score” < 1000. De los genes seleccionados, 21 correspondieron a proteínas hipotéticas o de función desconocida según la anotación de la base de datos del Doe Joint Genome Institute (Lferr_0129, Lferr_0141, Lferr_0142, Lferr_0146, Lferr_0148, Lferr_0151, Lferr_0158, Lferr_0179, Lferr_0184, Lferr_0192, Lferr_0194, Lferr_0197, Lferr_0198, Lferr_0211, Lferr_0217, Lferr_0218, Lferr_0219, Lferr_0220, Lferr_0223, Lferr_0224, Lferr_0225). El primer ORF de la IG, Lferr_0128, también respondió a la categoría de proteína hipotética, pero fue anotado como una proteína con dominio serina resolvasa. Lferr_0147 fue caracterizado como un regulador transcripcional de la familia TetR, mientras que Lferr_0152 como una amino-oxidasa; Lferr_0153 fue anotada como una epimerasa/dehidratasa dependiente de NAD mientras que Lferr_0155 como una proteína de la familia MgtC. Lferr_0182 resultó ser otro regulador transcripcional, pero de la familia XRE, descrito como una proteína pequeña conservada no caracterizada. Lferr_0190 fue anotada como una proteína tipo Glutarredoxina 2, con implicancia en modificaciones post-traduccionales. De las 3 metiltrasnferasas presentes en la IG sólo una, Lferr_0193, cumplió con los criterios para ser tomada en cuenta en este estudio. Se anotó a Lferr_0204 como una proteína con función desconocida relacionada a la familia de las permeasas tipo FtsX, las cuales transportan lípidos hacia la membrana externa a través de la membrana interna. La anotación correspondiente a Lferr_0214 se relacionó con una posible actividad oxidasa de piridoxina mientras que Lferr_0215 fue anotada como un péptido con región catalítica integrasa con características de transposasa.

33
2. RNA de A. ferrooxidans ATCC 53993.
En la Figura 10 se muestra un claro ejemplo del estándar de RNA extraído y tratado en cada una de las muestras biológicas que fueron necesarias para la realización de esta tesis. Por lo general, la concentración de RNA alcanzada en cada extracción post-DNasa no superó los 500 ng/μL a partir de 150 mL de cultivo y la relación Abs260/Abs280 siempre fue mayor a 1,6.
1
2
3
4
[RNA] (ng/μL)
285,9
289,5
504,1
381,7
Abs 260 nm
0,357
0,362
0,63
0,477
Abs 280 nm
0,164
0,169
0,291
0,22
Abs260/Abs280
2,18
2,146
2,168
2,165
Figura 10. RNA de A. ferrooxidans. A. Electroforesis en gel de agarosa 1% de 4 muestras de RNA post-tratamiento con DNasa. B. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de PCRs a las 4 muestras de RNA post-tratamiento con DNasa.
Entonces, mientras la Figura 10.A indica la integridad del RNA dada la nítida separación de sus sub-unidades, la Figura 10.B indica la calidad de las muestras de RNA utilizadas en los estudios de transcripción. Esto último, ya que en la Figura 10.B se evidencia la ausencia de DNA contaminando el RNA post-DNasa.
A
B
1 2 3 4
23S
16S
5S
1 2 3 4

34
3. mRNA de exp-1.
Se obtuvo el mRNA de exp-1 a partir del plasmidio pGEM-Teasy/exp-1 y del proceso de transcripción in vitro según se indicó en Materiales y Métodos. Del procedimiento de extracción y purificación del plasmidio se logró obtener una concentración de 103 ng/μL, la cual se redujo a 20,0 ng/μL luego de linealizarlo con la enzima de restricción SalI (Figura 11.A). Utilizando 600 ng de este templado, se procedió a la transcripción in vitro obteniendo como resultado 20 μL de mRNA a una concentración de 48,0 ng/μL (Figura 11.B) que posteriormente fue alicuotado en tubos Eppendorff a 6 ng/μL para su posterior utilización.
Figura 11. mRNA de exp-1. A. Separación electroforética en gel de agarosa al 0,7% del fragmento que contiene clonado el gen exp-1 en el plasmidio pGEM-T easy tanto en su forma digerida con la enzima de restricción SalI como en su forma no digerida. B. Separación electroforética del transcrito del gen exp-1 obtenido in-vitro.
A
B

35
iv. Macro-arreglos de DNA.
La Figura 12 muestra la disposición utilizada para la siembra de los 41 productos de PCR amplificados más la siembra de DMSO, mientras la Figura 13 muestra un par de membranas, Control y Níquel, post-exposición y revelado, siguiendo la disposición descrita.
Figura 12. Diagrama de la disposición de los productos de PCR sembrados en una membrana de nylon. Entre las filas 1 y 8 y entre las filas 9 y 16 se hibridó, como duplicado técnico, las mismas muestras biológicas.
Figura 13. Imagen representativa del resultado de la hibridización de dos membranas de nylon. A la izquierda se ve el resultado de una muestra Control y a la derecha, de una muestra en presencia de Níquel.
Las imágenes de la Figura 13 se sometieron a cuantificación utilizando el programa VersArray (Bio-Rad) en las instalaciones del INTA. Luego del tratamiento de datos descrito en Materiales y Métodos se logró obtener la gráfica de la Figura 14, donde se plasma la cantidad de veces de expresión de cada gen seleccionado en cada condición de crecimiento ensayada, relativa

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a la condición de crecimiento control y normalizada para la expresión del gen exógeno exp-1 (Sp).
Figura 14. Veces de expresión relativa. Gráfico representativo del resultado de la expresión relativa de cada gen en cada condición de estudio versus la condición control obtenida a partir de los ensayos de macro-arreglos.
Como era de esperarse, ni RX7 ni DMSO presentan algún tipo de expresión, validando la técnica propiamente tal. Así también, es interesante notar que Rus es el gen que presenta mayor expresión de sus niveles relativos en presencia de cobre (73 veces) haciendo que la escala se distorsione y más aún, que sea el único gen que presente niveles de expresión importantes frente a la presencia de todos los metales aquí ensayados.
Salvo CopA que sí fue detectado en cada una de las condiciones ensayadas, tanto CusC como CusF no se detectaron en la condición control así como cada uno de los spots que no presentan barras de magnitud de veces de expresión relativa, haciendo imposible cuantificar la variación de su expresión. Por otra parte, tanto RibS, GroEL y DnaK presentan sobre-expresión en presencia de cobre alrededor de 10 veces, mientras que solo estos dos últimos también se sobre-expresan en presencia de zinc (26,6 y 12,3 veces, respectivamente) y de níquel (5 y 1,1

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veces, respectivamente). En cadmio GroEL también se ve favorecido, esta vez en 1,8 veces, siendo entonces junto a Rus los únicos genes que responden a los 4 metales estudiados.
De los genes seleccionados de la isla genómica, solo 5 presentan algún tipo de sobre- expresión, ya sea frente a la acción de uno o dos metales, preferentemente cobre y zinc. Así es el caso de los genes correspondientes a Lferr_0192, Lferr_0194, Lferr_0198 y Lferr_0219, donde se dan niveles relativos de expresión entre 2 y 10 veces para uno u otro metal, mientras que el gen correspondiente a Lferr_0211 sólo se ve sobre-expresado frente al cadmio en 5,2 veces y con un nivel de expresión relativo cercano a 0,3 veces frente a níquel, pero sin poder ser detectado tanto en cobre como en zinc. Cabe destacar que estos 5 genes han sido anotados como “Proteínas Hipotéticas” en la base de datos aquí utilizada.
v. Ensayo de co-transcripción.
Para complementar los resultados de los macro-arreglos resultó interesante estudiar un poco más detalladamente el comportamiento concreto de Lferr_0211, puesto que presentó la respuesta más específica en su nivel de expresión al verse ésta aumentada sólo en presencia de cadmio y al percatarnos de su pertenencia a un contexto genómico interesante, tal como lo muestra la Figura 15.A.
Figura 15. Esquema ensayo de co-transcripción. A. Esquema que grafica los ORFs 208 a 211, su disposición y los partidores específicos diseñados para los ensayos de co-transcripción. B. Separación electroforética en gel de agarosa al 1% de los productos de PCR empleando los 4 pares de partidores a 3 temperaturas de anillamiento diferentes: 59 ºC, 63 ºC y 65 ºC.
A
B

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En detalle, el contexto genómico en cuestión comprende desde Lferr_0208 a Lferr_0211, pudiendo corresponder a una única unidad transcripcional. Lferr_0208 fue anotado como una proteína de unión a DNA con un dominio tipo HTH (del inglés helix-turn-helix) ArsR presente en los reguladores transcripcionales de la familia arsR/smtB. Los represores de operones de resistencia a metales que actúan sobre ArsR/smtB se unen específicamente al promotor y en presencia del ión metálico se disociarían del DNA, permitiendo la transcripción de las proteínas involucradas en el eflujo del metal y/o su destoxificación. Se sabe además que este tipo de proteínas pueden contener uno o dos sitios de unión a metales; uno de ellos permitiría la unión a cadmio, plomo y bismuto, mientras el otro interaccionaría preferentemente con metales más esenciales como níquel, zinc y cobalto. Lferr_0209 correspondería a una ATPasa tipo P translocadora de metales pesados como Cd/Co/Zn/Pb/Hg, mientras que Lferr_0210 se anotó como una proteína conservada pero de función desconocida al igual que Lferr_0211, pero posiblemente de membrana.
Entonces, establecido el contexto y visualizada la expresión de Lferr_0211, se procedió a la realización de ensayos de co-transcripción para determinar si Lferr_0208-Lferr_0211 correspondía a un posible operón. Se sintetizaron partidores específicos tal como muestra la Tabla 4 y se verificaron sus productos de PCR como se muestra en la Figura 15.B, ensayando 3 temperaturas de anillamiento diferentes, obteniendo resultados positivos para cada una de ellas. Posteriormente se realizó la síntesis de cDNA a partir del RNA extraído de cada una de las condiciones de crecimiento y se verificó la presencia y calidad del cDNA mediante PCR utilizando el par de partidores pertenecientes a Lferr_0209, obteniendo resultados positivos para cada una de las muestras ensayadas (Figura 16.A).
Luego se llevó a cabo la reacción de PCR al cDNA utilizando el par de partidores Lferr_0211_RV/Lferr_0210_FW y el par de partidores Lferr_0211_RV/Lferr_0208_FW obteniendo resultados dispares (Figuras 16.B y 16.C). El producto de PCR 211/210 de 661 pb dio positivo tanto en la condición control como en la condición con cadmio, sugiriendo que sí hay co- transcripción de estos dos genes contiguos, pero la pareja formada por 211/208 de 2994 pb dio como resultado un bandeo inespecífico de amplificación, inclusive en la reacción correspondiente al control positivo (DNA +), lo cual da cuenta de la dificultad para generar un amplicón de tan largas dimensiones bajo las condiciones experimentales utilizadas.

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Figura 16. Ensayo de co-transcripción. A. Electroforesis en gel de agarosa al 1% que muestra la separación de los productos de PCR realizado a muestras de cDNA sintetizadas para evaluar su integridad e idoneidad para los ensayos de co-transcripción. Se utiliza DNA de la condición control a modo de control positivo y RNA no retro transcrito a modo de control negativo. Cada PCR se realizó para muestras conteniendo cDNA (+) de cada condición como para muestras que no contuvieran cDNA (-) utilizando el par de partidores correspondientes a Lferr_0209 y Tm de 63 ºC. B. Electroforesis en gel de agarosa al 0,9% que muestra el resultado de un PCR de co-transcripción realizado a la condición control (C) y cadmio (Cd) utilizando los partidores Lferr_0211Rv y Lferr_0210Fw con DNA como control positivo y RNA no retro transcrito como control negativo. Se realizaron 35 ciclos, se utilizó DMSO, 1 mM Mg, Tm de 65 ºC y 40 s de extensión. C. Gel agarosa 0,7% que muestra el resultado de un PCR de co-transcripción utilizando los partidores Lferr_0211Rv y Lferr_0208Fw. Se realizaron 35 ciclos, se utilizó DMSO, 2,5 mM Mg, Tm 60 ºC y 3 min de extensión.
A
B
C

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vi. Ensayo funcional.
Ya que Lferr_0209 representaba la mayor fuerza de este operón putativo, se decidió medir su funcionalidad predicha mediante su complementación heteróloga en cepas de E. coli quimiocompetentes y mediante la utilización de sensi-discos que permitieron realizar ensayos de halos de inhibición en placas de crecimiento. El resultado esperado se correspondió con el resultado obtenido (Figura 17), puesto que el área de inhibición de crecimiento en la cepa Control una vez sometida a los 15 μL de una solución de cadmio 1 M tuvo un valor de 12,79 ± 0,97 cm2 mientras que la inhibición del crecimiento de la cepa complementada con Lferr_0209 alrededor del sensi-disco solo alcanzó un valor de 5,23 ± 0,25 cm2, demostrando que la complementación fue exitosa así como también que el gen complementado le otorgó a E. coli la capacidad de resistir una elevada concentración de cadmio en su medio de crecimiento.
Figura 17. Ensayo funcional. Gráfico del Halo de Inhibición sobre E. coli producido por el efecto del cadmio en una cepa Control versus una cepa clonada con Lferr_0209.

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IX. DISCUSIÓN
La presente tesis de pregrado tuvo como objetivo principal caracterizar los patrones de expresión de ORFs encontrados en una región genómica exclusiva de A. ferrooxidans ATCC 53993 y potencialmente relacionados con la resistencia a metales pesados. Específicamente se trabajó con cobre, níquel, zinc y cadmio puesto que resultaba interesante medir sus efectos sobre el crecimiento bacteriano dado que algunos de estos son elementos considerados de importancia biológica y otros como el cadmio son altamente tóxicos y contaminan el ambiente. En las pilas, botaderos y tanques de tratamiento biomineros se alcanzan concentraciones entre 2-19 g/L Cu, entre 2-25 g/L Ni, hasta 65 g/L Zn, hasta 14 g/L As y entre 20-40 g/L Fe (Watkin y cols., 2009).
En A. ferrooxidans ATCC 53993 fue posible evidenciar que la zona genómica exclusiva de esta cepa corresponde a una Isla Genómica propiamente tal pues posee las características necesarias para ser así definida. Entre ellas, un tamaño de 160 Kb, una recombinasa al inicio y contigua a un gen relacionado con el metabolismo de los tRNA, un menor porcentaje G:C respecto al genoma completo, la presencia de múltiples elementos de inserción (secuencias de inserción, transposones y elementos externos), componentes de un sistema de secreción tipo 4, la existencia de una serie de genes relacionados con la resistencia a metales pesados y la presencia de 77 genes codificantes de proteínas con función desconocida (Langille y cols., 2010), pudiendo entonces englobarla dentro de la definición de IG de Resistencia.
Se estableció un filtro de selección de genes (< 60% ID) para este estudio que resultó ser inclusive más estricto que lo reportado en otros estudios (< 75% ID, Liu y cols., 2003) y que se basó principalmente en la presencia única de los genes dentro de la IG de A. ferrooxidans ATCC 53993, de tal manera de poder atribuirles a ellos un alto nivel de importancia en la resistencia frente a metales pesados y gracias a esto poder diferenciarse cuantitativamente de la cepa ATCC 23270.
Interesante resultó el inesperado comportamiento del crecimiento bacteriano de A. ferrooxidans ATCC 53993 expuesto a elevadas concentraciones de metal. Por una parte se aprecia el crecimiento primero pausado y después potenciado de la condición control libre de metales pesados, un crecimiento típico bacteriano, un crecimiento esperado, mientras que por otro lado apreciamos el efecto negativo del cadmio sobre el cultivo bacteriano. A pesar de que la condición con 100 mM de cadmio fue inoculada con una mayor cantidad de células en comparación a la condición control, en su fase exponencial tardía el número de células alcanzado

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llegó por debajo de la condición control, esto es: 1,05*108 cél/mL versus 2,35*108 cél/mL, respectivamente. Se refuerza esta afirmación mediante la comparación de la tasa media de crecimiento generacional, siendo este valor, para cadmio, 2,37 veces superior a la tasa media de crecimiento generacional de las células control. Dicho de otra forma, a las células en cadmio le cuesta 2,37 veces más realizar un aumento de su duplicación bacteriana respecto al control. Contrariamente a la situación del cadmio, el níquel se aprecia que provoca en las células un potenciamiento del crecimiento. Níquel 200 mM y Control se inocularon en el orden 1*106 cél/mL. Mientras Níquel llegó a un nivel máximo de 4,05*108 cél/mL, las células control, como ya se mencionó, llegaron a 2,35*108 cél/mL e inclusive si comparamos su tasa promedio de crecimiento generacional de 8,73 hrs que es mayor a la de níquel (8,04 hrs) podemos dar respuesta al comportamiento del gráfico otorgándole al níquel una propiedad importante para el crecimiento de esta bacteria. Con propiedad se puede afirmar que el níquel, entonces, sirve como un elemento traza a considerar para optimizar el crecimiento celular de A. ferrooxidans ATCC 53993. Por último, señalar que las células crecidas tanto en cobre como en zinc 200 mM, a pesar de alcanzar un mayor número de células que la condición control, también fueron inoculadas inicialmente a una mayor concentración y además presentan valores de crecimiento generacional mayores a la condición control. Esto, sumado al comportamiento sigmoídeo de las curvas que describen el crecimiento en estas condiciones de metales pesados, crecimiento regular similar a la curva de la condición control, se desprende que tanto cobre como zinc no estarían afectando notoriamente el crecimiento bacteriano.
Si bien el resultado de los macro-arreglos no pudo entregar resultados decidores debido a la naturaleza hipotética de los genes sobre-expresados, sí nos dijo que existen genes no caracterizados que cumplen algún tipo de función en los mecanismos de resistencia (cobre, zinc y cadmio, en este caso, específicamente) y por lo tanto no es ilógico suponer que la sobrevivencia en un medio inhóspito como al que son expuestos estos microorganismos se debe a una suma de factores desde la ya conocida especificidad de proteínas por ciertos metales; la suma de repeticiones presentes en un genoma para codificar mayor cantidad de proteínas que cumplan una misma función (ATPasas y chaperonas presentes en la IG y en el genoma); el mecanismo por el cual estas proteínas destoxifiquen la célula, siendo unos más eficientes que otros y actuando en distintos tiempos y concentraciones de toxicidad; y, como se sugiere aquí, debido a la variedad de proteínas que actúen en el proceso. O sea, tanto Lferr_0192, Lferr_0194, Lferr_0198 como

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Lferr_0219 estarían ayudando de cierta forma a que A. ferrooxidans ATCC 53993 resistiera mayores concentraciones de cobre y de zinc en comparación a otros microorganismo que carecen de estos genes, como es el caso de A. ferrooxidans ATCC 23270. Así mismo, Lferr_0211 tendría un papel importante para proteger al microorganismo del efecto dañino del cadmio. Por lo tanto, nuestros resultados permitirían que estos ORFs anotados como “Proteínas Hipotéticas” sean re- anotados como “Proteínas que responden a metales”.
Por otra parte, se vio que Lferr_0211 podría formar parte de un operón y a pesar de no visualizar la co-transcripción completa, pero sí parcial entre Lferr_0210/Lferr_0211 y no existiendo un promotor en Lferr_0209, ni Lferr_0210, ni Lferr_0211 y dada la disposición espacial de estos 3 elementos más la presencia de Lferr_0208 como regulador transcripcional adyacente a ellos, se sugiere fuertemente que estos 4 elementos sí estén formando una única unidad transcripcional que responde a la presencia de cadmio. Importante es señalar que en esta etapa de la experimentación se trabajó mediante la complementación heteróloga en E. coli, un microorganismo neutrófilo, con la ATPasa Lferr_0209 de A. ferrooxidans ATCC 53993, un microorganismo acidófilo. El resultado de tal complementación sustenta la funcionalidad resistente a cadmio de este gen, y por añadidura sustenta la funcionalidad del aquí fuertemente sugerido operón del cual forma parte. A pesar de las diferencias de pH de los ambientes en los que se desenvuelven estos microorganismos, siendo el microorganismo neutrófilo un organismo que habita en ambientes con valores de pH cercano a 7,5 y el acidófilo en pH 1,5, la funcionalidad de la proteína en cuestión no se ve afectada, puesto que al localizarse en la membrana interna, transversal a ella, su cara citoplasmática, intracelular, se expone a valores similares de pH en estas células, siendo 7,5 y 6,5 para neutrófilas y acidófilas, respectivamente. Como se ha reportado en estudios anteriores (Chi y cols., 2007), hay un alto porcentaje de proteínas básicas en el periplasma de las bacterias acidófilas: un 16,8% de las proteínas con un punto isoeléctrico (pI) mayor a 10, entre ellas, proteínas ATPasas de cobre; en el global, un 75% con pI > 7 y un 25% con pI < 7. Por tanto, a pesar de registrar en el periplasma valores de pH alrededor de 2,5 a 3, dada esta alta población de proteínas con punto isoeléctrico alcalino, el flujo de protones a través del periplasma puede verse dificultado y más aún, detalladamente regulado junto con la maquinaria de homeostasis involucrando la fuerza protón motriz, notablemente exacerbada en los microorganismos acidófilos (Krulwich y cols., 2011).

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X. CONCLUSIONES
 Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 presenta una Isla Genómica de Resistencia de 160 Kb entre los ORFs 128 y 298, inclusive.
 Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993 posee genes no caracterizados como resistentes a metales pesados en la Isla Genómica de Resistencia (ORFs 192, 194, 198, 211, 219).
 Este microorganismo es capaz de crecer a concentraciones elevadas de metal de hasta 200 mM de cobre, níquel o zinc, o 100 mM de cadmio.
 Rusticianina es una proteína con especificidad por cobre, que lo une para su función biológica, pero muestra cambios notables de su expresión transcripcional en células crecidas en cadmio, níquel y zinc, sugiriendo que su expresión se regula por la presencia de varios metales en A. ferrooxidans.
 Lferr_209 (operón 208-211) le confiere a E. coli mayor capacidad de resistencia al cadmio y, por consiguiente, también a A. ferrooxidans ATCC 53993.

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Estudio de la expresión diferencial a nivel transcripcional de genes exclusivos de acidithiobacillus ferrooxidnas ATCC 53993 involucrados en la resistencia a meteales pesados

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