Tema 1. Generalidades de Microbiologia Universidad de Oriente

UNIVERSIDAD DE ORIENTE
NÚCLEO ANZOÁTEGUI
COMPLEJO UNIVERSITARIO “DR. LUIS RAZETTI”
FACULTAD DE MEDICINA
POSTGRADO DE MEDICINA INTERNA
CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA
Generalidades
de
Microbiología
M. Sc. Valmore Rodríguez.
Bioanalista. Especialista en Microbiología
Residentes de Segundo Año.
Medicina Interna

GENERALIDADES PART 01 Reseña Histórica.
Conceptos e importancia.
PART 02 Taxonomía-Bases
PART 03
Sobre las bacterias:
- Concepto.
- Fisiología bacteriana: nutrición y respiración.
- Relación con las patologías.
- Clasificación de las bacterias según requerimientos nutricionales y
de la respiración.
PROGRAMA DE ESTUDIO MICROBIOLOGIA, POST GRADO DE MEDICINA INTERNA

GENERALIDADES PART 04
PART 05
- Coloración Gram.
- Gram: fluidos esteriles, respuesta inmune intra y extracelular,
fluidos con recuentos leucocitaria, en flora normal.
- Coloraciones para catéteres y superficies inertes.
- Tinciones en fluidos diluidos (sangre y orina)
- Gram y el poder de resolución de los microscopios ópticos.
- Especificidad y sensibilidad de la coloración.
- Enmascaramiento.
- Gram y condición clínica del paciente.
- Medios de cultivo: conceptos, clasificación (básicos,
enriquecidos, selectivos, diferenciales, de transporte)
PROGRAMA DE ESTUDIO MICROBIOLOGIA, POST GRADO DE MEDICINA INTERNA

M I C R O B I O L O G I A
La Microbiología, considerada como una ciencia
especializada, no aparece hasta finales del siglo XIX,
como consecuencia de la confluencia de una serie de
progresos metodológicos que se habían empezado a
incubar lentamente en los siglos anteriores, y que
obligaron a una revisión de ideas y prejuicios seculares
s o b r e l a d i n á m i c a d e l m u n d o .
Ciencia que trata de los seres vivos pequeños, aquellos cuyo tamaño se
encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano.
(del griego: mikros "pequeño", bios "vida“ y logía ciencia)
Historia de la microbiología. Microbiología general 22-23

Idea one
Zacharias Jansen
Creador del primer
microscopio en 1590
Robert Hooke
1655 Crea otro microscopio, observo
en una lámina de corcho que estaba
formada por pequeñas cavidades,
similares a las celdas de un panal de
abejas y la llamo célula.
1683: Observa por primera vez una
bacteria.
Anton Van Leeuwenhoek
Considerado Padre de la
Microbiología. En 1675, mediante un
microscopio simple observó que en
una gota de agua habían muchas
criaturas, invisibles al ojo humano, a
las que llamo animáculos.
H I S T O R I A D E L A M I C R O B I O L O G I A
Esquema Collard 1976
Primer Período:
especulativo, se
extiende desde la
antigüedad hasta
llegar a los primeros
microscopistas.
Segundo periodo
PART 01

John Needham Louis Pasteur
Johann Van Helmontz
Idea one
En el siglo XVII, dejó ropa
sucia y trigo en un lugar
determinado. Tras un
período de tiempo, vio como
la ropa y el trigo
desaparecen y aparecen
ratones..
En el siglo XVIII, calentó
caldo de carne, pensando
que todos los
microorganismos morían
con la ebullición.
En 1861, Realizó un
experimento para demostrar
la función del algodón para
retener microorganismos:.
Segundo periodo: Era
observacional, o
generación espontánea,
en el cual se plantea que
los seres vivos se
forman a partir de
materia inerte.
Desde 1675 hasta la
mitad del siglo XIX

Robert Koch
Luis Pasteur
(1822- 1895)
Joseph Lester
(1827-1912)
Tercer período o periodo
de las fermentaciones:
Marca el comienzo del
cultivo de los
microorganismos,
transcurre hasta finales
del siglo XIX. Abarca el
comportamiento de las
bacterias en la
enfermedad.
Demostró que los mohos y las
bacterias no se generan de forma
espontánea y que no llegan a
proliferar en un medio estéril,
desarrollo de la técnica de
calentamiento controlado que
actualmente se conoce como la
pasteurización.
Enfocó la mayor parte de su
trabajo al estudio de los métodos
antisépticos, ya que conocía a
cabalidad el trabajo de Pasteur
acerca de la presencia de
bacterias y microorganismos
presentes en el aire y sobre los
efectos bioquímicos que estas
seguían.
fue el primero en demostrar la
relación entre Bacillus
anthracis y el carbunco. En
1876 enunció los conocidos
como Postulados de Koch.

3
4
1
2 Hay que aislar y desarrollar en cultivo puro al
mismo organismo sospechoso
Al inocular el microorganismo aislado en un
huésped sano, se debe desarrollar la misma
enfermedad.
El mismo microorganismo debe aislarse de nuevo
a partir del huésped enfermo.
El microorganismo causal debe estar presente en
cada caso de enfermedad, pero ausente en los
organismos sanos
HISTORIA DE LA MICROBIOLOGIA
Postulados de Koch

Cuarto periodo:
desde principios del siglo XX hasta nuestros días),
en el que los microorganismos se estudian en toda
su complejidad fisiológica, bioquímica, genética,
ecológica, etc., y que supone un extraordinario
crecimiento de la Microbiología, el surgimiento de
disciplinas microbiológicas especializadas (Virología,
Inmunología, etc), y la estrecha imbricación de las
ciencias microbiológicas en el marco general de las
Ciencias Biológicas.

3
5
6
1
2
Comensalismo: Es cuando un agenté
infeccioso y su huésped coexisten y ninguno
de ellos se beneficia o se perjudica.
Bacterias: Son organismos unicelulares y
contienen DNA y RNA , pero no está
diferenciadas en núcleo y citoplasma; se
reproducen por fisión binaria.
Colonización: es el establecimiento de un
microorganismo en el interior o el exterior de
un huésped; puede tener mía duración breve,
como en nuestros encuentros con pasajeros.
4
Patógeno: Microorganismo capaz de
general infecciones denominapatógeno
oportunista : microbio produce enfermedad
en forma ocasional
Parásitos: viven y se nutren de otro organismo.
Entre ellos se incluyen los animales
unicelulares, como los protozoos, y los
organismos multicelulares muy complejos que
tienen órganos y tejidos bien definidos.
CONCEPTOS BÁSICOS
Hongos: agentes unicelulares o multicelulares
que presentan un núcleo y un citoplasma
definidos.

3
1
2
Virulencia: ofrece una medida cuantitativa de la
patogenicidad o de la probabilidad de que un
microorganismo cause enfermedad.
Saprófito: Si el agente infeccioso obtiene
beneficio de su huésped sin dañarlo.
virus: comprenden un gran número de agentes
infecciosos que, hablando estrictamente no son
microbios porque carecen del equipamiento
genético completo
CONCEPTOS BÁSICOS
5
Parasitismo: es cuando el huésped es dañado
por el agente infeccioso con beneficio de este
último
4
Simbiosis o mutualismo: Si el agente
infeccioso y el huésped obtienen un
beneficio Del encuentro

Clasificación de los
microorganismos en un sistema
ordenado que indica una relación
natural
Taxonomía
Del griego taxon = organización
Carroll KC, Morse SA, Mietzner T, Miller S. Microbiología Médica. Jawetz,Melnick y Adelberg. 27º ed. México DF. Mcgraw-Hill/Interamericana Editores,2016

Fuente: https://herbolaria.fandom.com/wiki/Nomenclatura_(biolog%C3%ADa). 25 de febrero 2024

Taxonomía
Pumarola A y col: Microbiología y Parasitología Médica. 2ª ED.Barcelona. Editorial Panamericana, 1999.
Carlos Linneo en el siglo XVIII fué primer
investigador que impulsó la clasificación y
nomenclatura binaria y lo plasma en su
Sistema Naturae (1758)

Identificación Clasificación
Uso práctico de un
esquema de
clasificación
Categorización de
microorganismos en
grupos taxonómicos
Nominación
Taxonomía Áreas de la Taxonomía
Denominación de un
microorganismo por
un grupo establecido

Taxonomía
Categorías Taxonómicas
Esquema taxonómico de complejidad creciente constituido por taxas

Taxonomía
Criterios para clasificación
1. Morfológicos: forma, tamaño, tinción, flagelos, pared celular, cápsula.
2. Fisiológicos: tipo respiratario, temperatura de crecimiento.
3. Nutricionales: requerimientos nutritivos, capacidad de crecer en medios simples o
complejos
4. De cultivo: morfología de las colonias
5. Bioquímicos: caracteristicas enzimáticas, fermentativas, metabolismo y metabolitos
6. Constitución quimica de la pared, capsula, proteínas.
7. Sensibilidad a diversos antibacterianos y desinfectantes
8. Sensibilidad a fagos y bacteriocinas.
9. Antigénicos: determinar categorias infrasubespecíficas
10.Genéticos

Taxonomía Nomenclatura
Código Internacional de Nomenclatura de las bacterias
(International Code on Nomenclature of Bacteria)
• Emplear el latin ó palabras latinizadas.
• Las categorias incluidas entre orden y subtribu, ambas inclusive, tienen que
terminar en los sufijos
• El nombre de especie: nombre del género seguido de un epíteto específico
• Siempre el nombre genérico se escribe con mayúscula inicial y singular, y el epiteto
específico y su inicial, siempre en minúscula.
• Deben expresarse graficamente en cursiva ó subrayados (Nocardia asteroides)
• La subespecie (variedad) es una combinacion ternaria, con un tercer epíteto
subespecífico en minúsculas, precedido de la abreviatura subsp.,ejemplo,
Bacteroides ruminicola subsp. brevis.

Bacterias
• Microorganismos procariotas, es decir, unicelulares sencillos, sin membrana
nuclear, mitocondrias, aparato de Golgi ni retículo endoplasmático que se
reproducen por división asexual.
• Existen dos formas básicas de pared: una pared celular grampositiva con una
gruesa capa de peptidoglucano y una pared celular gramnegativa con una
delgada capa de peptidoglucano, así como una membrana externa.
• Algunas carecen de pared celular y compensan su ausencia sobreviviendo tan
sólo en el interior de células del hospedador o en un ambiente hipertónico.
Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Microbiología Médica. 9° Ed. Barcelona. Elsevier, 2021.

Bacterias

Fisiología Bacteriana
Metabolismo
Es el conjunto de reacciones químicas que se producen en las celulas vivas
Anabolismo
Catabolismo
Empleo de la energía
obtenida para
síntesis de los
componentes
celulares
Degradación de los
sustratos y de su
conversión en energía
utilizable

Metabolismo
4.Oxidación 1.Digestión
3.Preparación 2.Absorción
Todas las fases producen
reacciones exergónicas,
pero solo en la última se
libera la energia utilizable

Reacciones de Oxidación
• Fosforilación a nivel de sustrato
• Combustión de un sustrato
orgánico, en ausencia de oxigeno
Fermentación
• Fosforilación oxidativa
Respiración
Ambos llevan consigo oxidaciones, con liberación de electrones e hidrógeno
• Respiración Aerobia: aceptor final
es el oxigeno
• Respiración Anaerobia: aceptor
final es otro compuesto distinto
• Tanto el dador como el aceptor de
electrones son un compuesto
orgánico.

Alcohólica Homoláctica Heteroláctica
Ácido
propiónico
Etanol a partir de
glucosa
Glucosa a ácido láctico
Mitad de glucosa: ácido láctico
Mitad mezcla: anhídrido
carbónico, ácido fórmico, etc
Bacterias anaerobias
Propionibacterium
Ácido mixta Butanodiol
Ácido
butírico
Hexosas a ácido láctico,
ácido acético, ácido succínico
y ácido fórmico
Producción 2,3-butanodiol
desde glucosa
Género Clostridium
Varela G, Grotiuz G. Fisiologia y metabolismo bacteriano. Uruguay, Editor Cefa [Internet]. 2002;43-58
Tipos de Fermentanción CHO

Para que una bacteria pueda vivir y
reproducirse, es decir, ser capaz de
llevar a cabo sus procesos de biosintesis
Disposición de los nutrientes
necesarios
Elementos
energéticos y
constitutivos
Elementos
específicos
Condiciones
físico-
químicas
adecuadas
Nutrición

• Agua : Representa el 80-90% del peso de la bacteria
• lones minerales: P04--, S04-' Ca++, Na+ y Cl-, otros
oligoelementos, tales como manganeso, zinc, cobre,
cobalto, niquel, boro.
• Carbohidratos: alimentos energéticos más importantes
y pueden proceder de diversas fuentes
• Proteínas: Su principal forma de utilización es a partir
de iones amonio
• Lípidos: también ser utilizados como fuentes de
energía.
Elementos
energéticos y
constitutivos
Nutrición

Fisiología Bacteriana Tipos tróficos en las bacterias
Según fuente de energía
• Fototrofas
• Fotolitotrofas
• Fotoorganotrofas
• Quimiotrofas
• Quimiolitotrofas
• Quimioorganotrofas
Según fuente de carbono
• Autotrofas
• Heterotrofas
Según el aceptor final de electrones
• Oxígeno
• Otros compuestos inorgánicos

Elementos
específicos
• Vitaminas: actuan como coenzimas ó precursores de
coenzimas (vitamina B1, B2, B6 y B12, ácido nicotinico.
etc.)
• Aminoácidos, precursores de las proteínas
• Bases púricas y pirimidínicas, precursoras de los
ácidos nucleicos
• Otros: como factores X y V, presentes en la sangre
Nutrición

Condiciones
físico-
químicas
adecuadas
• Concentración de iones hidrógeno
• Temperatura
• Presión osmótica
• Presencia de oxígeno
• Presencia de CO2
• Influencia de humedad ó desecación
• Influencia de la luz y otras radiaciones
Nutrición

Aplicación práctica del estudio de las vías
del metabolismo energético
• Bacterias aerobias estrictas (a). Solo hay crecimiento en la parte superior del
tubo, cerca del oxígeno atmosférico, y, por el contrario no aparece en el fondo
• Bacterias aerobias-anaerobias facultativas y bacterias anaerobias-aerobias
tolerantes (b). Crecen a 1o largo de todo el tuo, tanto en presencia como en
ausencia de oxígeno.
• Bacterias anaerobias estrictas (c). El crecimiento se observa sólo en la parte
inferior, ya que el oxígeno de la superficie es tóxico.
Relación de las bacterias con el oxígeno

• Bacterias fermentativas: crecimiento abundante en ambos tubos, con formación
de gran cantidad de ácidos como productos terminales, y el consiguiente cambio
de color debido al viraje del indicador como consecuencia del cambio del pH
• Bacterias oxidativas: sólo crecimiento en la parte superior del tubo abierto, con
poca cantidad de ácido y poco gas. En el medio cerrado no hay crecimiento.
Prueba de oxidación-fermentación de Hugh-Leifson
Las bacterias aerobias estrictas son oxidativas
Bacterias anaerobias-aerobias tolerantes y anaerobias
estrictas son siempre fermentativas

Prueba de oxidación-fermentación de Hugh-Leifson

La citocromo-oxidasa es capaz de actuar sobre un compuesto, el dimetil-
parafenilendiamina,con producción de color rojo oscuro.
• Bacterias oxidasa-positivas: tienen una cadena de citocromos completa, en
contacto con dicho compuesto, capaces de provocar dicho cambio de color
• Bacterias oxidasa-negativas: una cadena de citocromos imcompleta
Reacción de las oxidasas
Todas las bacterias anaerobias patógenas para el hombre son oxidasa-negativas y
algunas aerobias, sobre todo las estrictas, son oxidasa-positivas.

La catalasa es una enzima típica de las bacterias aerobias que tienen un
metabolismo oxidativo, capaz de descomponer el agua oxigenada, en agua y
oxígeno. Si la bacteria posee catalasa, esta escindirá dicho compuesto, formando
una serie de burbujas visibles, debidas al oxígeno liberado
Reacción de la catalasa

Tipos de fermentación de interes son
• La ácido-mixta: los ácidos formados comunican al medio una acidez elevada (pH
< 4,5 donde el rojo metilo vira de color)
• La butilenglicólica: se produce una acidez menor (reacción de rojo de metilo
negativo), pero, además, se forma el butilenglicol, que pasa a acetoína (en
presencia de α-naftol y potasa) fácilmente identificable: reaccion de Voges-
Proskauer.
Reacciones del rojo metilo y de Voges-Proskauer.
Se puede diferenciar el genero Escherichia (rojo de metilo + y reacción de Voges-Proskauer -)
de los géneros Enterobacter. Klebsiella y Serratia (rojo de metilo -, reaccion de Voges-Proskauer +)

Reducción de los nitratos
Las bacterias pueden reducir los nitratos a nitritos, amonio, nitrogeno molecular
e incluso óxidos de nitrógeno.
Se utiliza un medio elemental con nitrato potásico y se detecta la presencia de
nitritos, mediante un reactivo específico.
Si también los nitritos han sido reducidos, la reacción es negativa, y entonces se
investiga la presencia de nitratos no reducidos, añadiendo polvo de zinc. Este
actua como reductor, por lo que, si ahora aparece la reacción como positiva, es
señal de que el microorganismo habia reducido los nitratos del medio.

Reducción de los nitratos

• Catabolismo proteico (proteasas, gelatinasa, ADNasa, descarboxilasas,
deshidrolasas y desaminasas de diferentes aminoácidos, ureasa, etc.)
• Metabolismo glúcidico (actuación sobre el glucógeno, almidón, disacáridos a
monosacáridos)
• Metabolismo lípidico (determinación de lipasas, lecitinasa, etc.)
Reacciones basadas en el catabolismo

Anaerobios estrictos: crecen solo en
condiciones de intensidad reductora
elevada y para las cuales el oxigeno es
toxico
Anaerobios aerotolerantes: no se
mueren por exposición a oxigeno
Anaerobios facultativos: capaces de
crecer bajo ambas condiciones,
aerobia y anaerobia.
Microaerófilos: crecen mejor con
concentraciones bajas de oxígeno; las
concentraciones altas de oxígeno pueden
ser inhibitorias
Clasificación según los requerimientos de
oxígeno

Koneman. Diagnóstico Microbiológico. 2012 . Editorial Medica Panamericana. Nafees Ahmad et. Cols. Sherris Microbiología Medica. Quinta Edición. Mexico: Mc Graw
Hill; 2010.
CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS SEGÚN REQUERIMIENTOS DE OXIGENO
• Todas las bacterias aerobias obligadas necesitan oxigeno como aceptar de
electrones.
• En los medias de cultivo liquidos de grosor considerable las bacterias aerobias
solo crecen en la superficie y cada vez las condiciones se hacen mas
anaerobias, a medida que se desciende de dicha superficie.
Las bacterias anaerobias estrictas, repelen el oxigeno atmosférico.
Para el crecimiento de las mismas:
• Se puede recurrir a soluciones en las que se ha hecho el vacio.
• Frascos cerrados sin burbujas de aire
• Bombas de vacío
• Medias que absorban el oxigeno (piroga 101)
• Medios reductores (tioglicolato, cisteina).

En 1884. Hans Christian Gram, desarrollo un método de tinción
bacteriana que coloreaba algunas células de color azul violeta y otras que
se decoloraban, se teñían con el color de la solución colorante empleada
como contraste.
Cristal violeta
Tiñe todas las
células de color
azul violeta
Solucion de
Lugol (Yodo-
yoduro de
potasio)
Decolorante
acetona y
etanol
Safrananina
Tiñe de rojo a
las Gram-
Llop, Valdez, Lapena. Microbiologia y Parasitología, coloraciones compuestas o diferenciales, Tomo 1, 2001
T i n c i ó n G r a m
Fundamentos

Tinción de Gram
Fundamentos
El principio de la tinción de Gram se basa en las diferencias en la
estructura y composición de la pared celular de algunas
bacterias.
No todas las bacterias se pueden teñir con esta técnica ya sea
porque carecen de pared celular o que esta tenga una
composición diferente
Rev. Colegio de Microb. Quím. Clín. de Costa Rica, vol. 27, N.°2, mayo-agosto 2022

Acción formadora de
complejos morados
insolubles
Proteínas ribo
nucleares dentro de
la célula
Diferencia en
permeabilidad en la
pared celular
Al tratarse con
mezclas de solventes
de alcohol y acetona
Bacterias Gram
positivas retienen
complejos
Bacterias Gram
negativas no retienen
complejos al
decolorarlas.
Fondo
adecuadamente
decolorado es rojo
Casasola Maria, Importance of a correct Gram Stain in Identifying Bacteria La Rev. Colegio de Microb. Quím. Clín. de Costa Rica, Agaosto 2022; 27(2): 89-98
Tinción de Gram
Principios

Según la American Society for Microbiology:
Examine el frotis teñido bajo el objetivo de 100 ×(de inmersión) de un microscopio. Las bacterias Gram
positivas se tiñen de azul oscuro; las bacterias Gram negativas aparecen de color rosa o rojo.
El frotis se cubre completamente con la solución de cristal violeta y se deja actuar durante 30 segundos. Se decanta el
cristal violeta, se enjuaga con agua y se escurre el exceso de agua
La preparación se cubre con la solución de yodo y se deja actuar durante 30 segundos. Se enjuaga la preparación con
agua y se escurre el exceso de agua.
Se realiza la decoloración agregando el alcohol-acetona gota a gota hasta que no se arrastre más cristal violeta. Se
enjuaga el exceso de alcohol acetona con agua y se escurre su exceso.
Se cubre la preparación con el colorante de contratinción safranina y se deja actuar por 30 segundos. Se enjuaga la
preparación con agua y se escurre el exceso de agua. La preparación se seca al aire o se puede utilizar una placa
calefactora.
01
02
03
04
05
Método de la tinción Gram

Tinción de Gram
Procedimiento y recomendaciones
• Las tinciones de Gram se realizan a partir de cultivos bacterianos jóvenes (18-24 horas)
cuya pared celular bacteriana se encuentre intacta.
• Las bacterias presentes en los cultivos más viejos pueden presentar rupturas en la pared
celular por lo que las bacterias gram positivas pueden teñirse como gram negativas o gram
variables.
• Además, aquellas muestras que puedan tener conteos muy bajos de microorganismos, como
los líquidos corporales, lavados bronco-alveolares y líquidos cefalorraquídeos, se aconseja
centrifugar para aumentar la sensibilidad de la tinción.

Las bacterias GRAM POSITIVAS
• Tiñen de azul-violeta
• Poseen grandes cantidades de
Acido Teicoico
Las bacterias GRAM NEGATIVAS
• Se tiñen de rojo.
• Contienen lipopolisacaridos en
su pared
Se ha demostrado que la estructura de la pared bacteriana es la base de la reacción
diferencial frente a la coloración Gram.
Llop, Valdez, Lapena. Microbiologia y Parasitología, coloraciones compuestas o diferenciales, Tomo 1, 2001
Clasificación

Clasificación: pared bacteriana
Gram Positivos Gram Negativos
Lucía Constanza Corrales Ramírez 1, Liliana Caycedo Lozano. Principios físicoquímicos de los colorantes utilizados en microbiología. NOVA. 2020; 18 (33): 73-100

Clasificación: pared bacteriana

Forma:
• Cocos
• Bacilos (bastones, cilindros)
• Cocobacilos (bastones cortos, ovoidales)
• Vibrios (bacilo en forma de coma)
• Espirilos (bacilos en forma de tirabuzón)
Agrupamiento:
• Aislado (individual)
• Diplos
• Parejas
• Tetradas
• Cadenas
• Racimos
• Empalizadas.
Para el reporte, se tiene en cuenta:

 Cuando se trata de una persona sana, la sangre, los líquidos corporales y los tejidos son estériles.
 Algunos organismos pueden desplazarse a través de las barreras epiteliales como resultado de traumatismos o
durante el parto.
 Fuente de infecciones cuando algunas estructuras como válvulas cardiacas dañadas y cuerpos extraños
(prótesis) se encuentran en el torrente sanguíneo
Fluidos Estériles
• Órgano (pulmón, hígado)
• Fluidos sangre o LCR.
Tejidos o fluidos corporales
• Hallazgo positivo es diagnostico.
• Hallazgo negativo excluye infección.
Aspiración –punción
• Localiza el patógeno en un sitio por demás
estéril
Mayor grado de calidad
Muestras directas
Nafees Ahmad et. Cols. Sherris Microbiología Medica. Quinta Edición. Mexico: Mc Graw Hill; 2010.

Especímenes de
exudados inflamatorios
Orina por micción
Atraviesan zonas con flora
normal
Sitio inicial es estéril en
personas saludables
Contaminación con flora
normal durante
recolección
Evaluación exhaustiva para
reconocer patógenos
diversos a flora normal
Fluidos Estériles
Muestras indirectas

Fluidos Estériles
Fluidos Estériles

 Presencia de microbios sobre o dentro de las personas no constituye en si misma una anormalidad.
 Flora normal: microorganismos que con frecuencia se encuentran en diversos sitios del cuerpo en los individuos
normales y saludables.
Fluidos Estériles
Líquidos cefalorraquídeo, peritoneal, pleural, sinovial y pericárdico
Recolectar cantidad adecuada
Tinción Gram y cultivo de
rutina (1-2ml)
Cultivo anaerobios y
aerobios, pruebas antigénicas
y de amplificación de ácidos
nucleicos

Tinción de Gram de la punta completa del catéter y examen al microscopio
convencional de luz
Julio García-Rodríguez et Cols. El microbiólogo y la infección asociada a catéter. Rev Esp Quimioter. 2010; 23(2):53-62
COLORACIONES PARA CATÉTERES Y SUPERFICIES INERTES
Tinción de punta catéter con naranja de acridina y examen con microscopio de
fluorescencia
Tinción de Gram de improntas (impression smears) de la superficie externa de la
punta catéter sobre portaobjetos.
Catéteres venosos periféricos. Siempre que haya sospecha de infección se recomienda la retirada y envío
del catéter para cultivo.

RESPUESTA INMUNE INTRACELULAR Y EXTRACELULAR
La inmunidad innata y la inmunidad adquirida son los das brazos principales de la respuesta inmunitaria.
Koneman. Diagnóstico Microbiológico. 2012 . Editorial Medica Panamericana
Una vez que un individuo a sido
infectado, se producen diversas:
respuestas en el huésped, localizada o
sistémica.
La defensa
puede ser
celular o
no celular
(Humoral)

Defensa Humoral Innata
Muco reviste toda las
superficies mucosas (ej.
Muco gastrico)
Líquidos que barren los
potenciales patógenos
hacia afuera (Ej
lagrimas)
Ciertos compuestos
antibacterianos como la
lisozima
Reactantes de fase
aguda

Citocina: Sistema de comunicación para la defensa. Efectores moleculares de linfocitos
citotoxicos
Sistema de Complemento: sistema de ataque (C7, C8, C9). Rama clasifa, rama alternativa y
sistema de unión a las lectinas
Defensa no Celular Inmunitaria. Adaptativa (Humoral)
Son conducidas y producidas por células inmunitarias especificas

Linfocitos B: producir anticuerpos
inrnunologicamente específicos y
componen el sistema mundano
humoral.
Linfocitos T: conforma la inmunidad celular, se
dividen: Linfocitos Helper (fenotipo CD4):
memoria inmunitaria y secreción de las citocinas
que modulan la respuesta inmunitaria (células de
tipo 1 (Th I ) y de tipo 2 (Th2 ) y linfocitos
supresores (fenotipo CD8), cilotoxicos y
responsables de la eliminación del material
celular extraño
Defensa Celular Inmunitaria Adaptativa

TINICIONES EN FLUIDOS DILUIDOS : SANGRE
Diferenciales :
• Gram
• Tinciones de Giemsa
• Tinciones ácido-alcohol resistentes.
• Tinción hierro-hematoxilina
Fluorescentes
• Tinción de naranja de acridina.
• Tinción de auramina-rodamina
• Anticuerpos fluorescentes directos
Tinciones utilizadas para detectar bacterias, hongos y parásitos
Mandell, Gerald L., John Eugene Bennett, y Raphael Dolin. Enfermedades Infecciosas: Principios Y Práctica. 8ʹ ed. Barcelona: Elsevier, 2016.

Gram
Detecta bacterias diferenciando entre
grampositivas y gramnegativas.Permite clasificar
microorganismos según su morfología y
disposición
Tinciones de Giemsa
Principalmente para detectar bacterias
(Borrelia) o inclusiones bacterianas
(Anaplasma, Ehrlichia), así como hongos y
parásitos (Aspergillus, Plasmodium)}
Tinciones ácido-alcohol resistentes:
Identifica bacterias con ácidos micólicos en su
pared celular. Géneros como Mycobacterium,
Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella y
Gordonia retienen esta tinción.
Tinción hierro-hematoxilina
Tinción diferencial para la detección de
microfilarias en sangre
Tinciones Diferenciales :

• Tinción de naranja de acridina.
Utilizada para hemocultivos con Tinción
Gram negativo (ej., Campylobacter,
Helicobacter)
• Anticuerpos fluorescentes directos (DFA).
Se utilizan principalmente para la detección e
identificación de virus, pero también se emplean
en algunas bacterias seleccionadas (S. pyogenes,
T. pallidum, Legionella y B. pertussis
• Tinción de auramina-rodamina.
Utilizada para detectar bacterias ácido-alcohol
resistentes y parcialmente resistentes
(Micobacterias)
Tinciones fluorescentes:

TINICIONES EN FLUIDOS DILUIDOS : ORINA
• Tinciones Gram:
• Se lee con lente de aceite de inmersión; la presencia de
microorganismos sugiere infección urinaria.
• Los patógenos comunes del tracto urinario incluyen
Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas,
Enterococcus y Staphylococcus.
• Los contaminantes comunes son lactobacilos, difteroides,
estreptococos alfa-hemolíticos no enterococos y estafilococos
coagulasa-negativos.
• Las levaduras, especialmente Candida, pueden aislarse en los
cultivos de orina, pero su cuantificación no siempre indica
infección urinaria.

TINICIONES EN FLUIDOS DILUIDOS :
ORINA

Luis Esaú López-Jácome y Cols.*. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Medigraphic. 2014; Vol. 3, Núm. 1 pp 10-18
En microbiología el microscopio se utiliza de forma
rutinaria, ya que proporciona importante información para
la identificación temprana y definitiva de los
microorganismos.
Resolución del microscopio: capacidad que posee un
objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos
puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos
puntos separados.
GRAM Y EL PODER DE RESOLUCIÓN DE LOS MICROSCOPIOS ÓPTICOS

Luis Esaú López-Jácome y Cols.*. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Medigraphic. 2014; Vol. 3, Núm. 1 pp 10-18
GRAM Y EL PODER DE RESOLUCIÓN DE LOS MICROSCOPIOS ÓPTICOS
• El poder de resolución de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la
imagen, y depende de la longitud de onda (λ) del haz de luz utilizado y de la apertura numérica del objetivo
empleado.
• Es posible visualizar aun a las bacterias más pequeñas (1-2
μm), aunque todas requieren de tinción y algunas precisan de
técnicas especiales de iluminación.
• El máximo poder de resolución en un microscopio de luz emitida
es de 0.2 μm, por lo que se requiere de una ampliﬁcación entre
1000-1400x, mientras que el poder de resolución del ojo humano
es de aproximadamente 0.2 mm.

El gram de orina ha mostrado una alta sensibilidad y especificidad en múltiples estudios:
• Mostró una sensibilidad del 95% y una especificidad del 80%
• La desventaja del urocultivo es el largo tiempo de obtención del resultado, siendo útil en este caso
el seguimiento con gram de orina, por su bajo costo y rapidez.
De las tinciones de Gram sin centrifugar se concluyó:
• Tienen una sensibilidad 98%, una especificidad del 73%, un valor predictivo positivo del 82%,
Urol Colomb. 2014;23(1):30-34
ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LA COLORACIÓN

Entre 136 ASPIRADOS TRAQUEALES estudiados, en 50 (37%) creció S. aureus.
La tinción de Gram se leyó como positiva para organismos compatibles con S. aureus en 34 de ellos.
Entre 86 muestras en las que no creció S. aureus, la tinción de Gram se leyó como negativa en 62.
Por lo tanto, la tinción de Gram tuvo una sensibilidad del 68%, una especificidad del 72%, un valor
predictivo negativo del 80% y un valor predictivo positivo valor del 59% para el cultivo de S. aureus.
Las tinciones de Gram falsamente negativas fueron más probables cuando el cultivo reveló sólo un
crecimiento pequeño o raro de S. aureus
Tetenta S, et al. Respirología. 2011. PMID: 20920138

Tinción de Gram
en líquido cefalorraquídeo fue el predictor más preciso para diferenciar
1. Sensibilidad 91,%,
2. Especificidad 98,9%
Tomohiro Taniguchi et al. Ann Clin Microbiol Antimicrobios . 2020/ Kasmera. 2002; 30(2): 137-144
Tinta China
• Sensibilidad: 25-50 %
• Especificidad: 100%
Neisseria meningitidis
Cryptoccocus neoformans

La tinción de Giemsa. Este colorante sirve tanto para la gota
gruesa como para el frotis. Esta tinción tiene buena sensibilidad
(92-98%) y especificidad (85-99%).
La tinción con naranja de acridina se utiliza para el frotis, ya que
precisa una fijación previa con metanol antes de teñir y observar
en un microscopio de fluorescencia. La sensibilidad es del 77-
96% y la especificidad del 81-98%.
Unidad de Medicina Tropical y Parasitología Clínica. Hospital Ramón y Cajal. Madrid. 1-5

Sensibilidad
• Liquido cefalorraquídeo: 40%
• Liquido pericárdico: 50%
• Liquido peritoneal: 20 - 30%
• Liquido sinovial: 20%
• Liquido pleural: 10 - 15%
Kasmera. 2002; 30(2): 137-144
Ziehl-Neelsen
Las micobacterias son microorganismos difíciles de teñir con los colores habituales
Tinción de Ziehl-Neelsen (Mycobacterium leprae)

¿Por qué algunos patógenos causan
enfermedad con mayor facilidad que otros?
• Capacidad para superar las barreras del huésped
• Capacidad para alterar la homeostasis
• Alterar la microbiota normal
• Un sistema defensivo intacto ofrece protección contra la mayoría de agresores.
Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases, 8th Edition
Sistema
inmune
humoral y
celular
Función
orgánica
normal
Estado
nutricional

Métodos de defensa del huésped
Receptores de reconocimiento del patrón (PRR)

SITUACIONES ESPECIALES
• Piel: La piel inflamada es más permeable al agua y más hospitalaria
frente a la colonización
• Vías respiratorias: Contaminantes aéreos, respiradores mecánicos,
infección concomitante, defectos genéticos.
• Vía enteral: Alteraciones en el peristaltismo, microbioma, pérdida de
células epiteliales.
• Vía genitourinaria: Cambios en el pH, estado hipotónico de la
médula renal, pérdida del pH protector de la vagina.

GRAM Y CONDICIÓN CLÍNICA DEL PACIENTE

Transporte de muestras
El clínico y el microbiólogo deben trabajar juntos.
Tendencia actual: Consolidar los servicios de laboratorio y de trasladarlos fuera.
Esto ha hecho que sea más difícil la comunicación oportuna. Aumentan tiempo de recogida de muestra y procesamiento en el
laboratorio.
Compromete la integridad de las pruebas
Retrasa la disponibilidad de los resultados.
Estos cambios realzan la importancia del trabajo en conjunto entre el médico y el microbiólogo.
Si se desvía la realización de pruebas infrecuentes, caras o sofisticadas a un laboratorio externo, se debe asegurar el transporte de estas
pruebas:
Forma apropiada
Rapidez

Transporte de muestras
Dónde consultar?
• Comprobación inicial
• Validación continua de los procedimientos que usa el
laboratorio

Absceso
• Se prefiere un aspirado de pus o líquido en vial de transporte anaeróbico.
• También es aceptable, una muestra de una jeringa con tapón después de haber
eliminado el aire.
• Especificar localización del absceso e información extra pertinente.
• Bacterias aerobias y anaerobias de rutina:
• Desinfectar tapones con alcohol 70% y el sitio de la flebotomía
• Esperar a que sequen los antisépticos
• Extraer 10-20 ml, en cada frasco.
• Recoger 2-3 cultivos / 24 horas.
• Remitir al laboratorio inmediatamente
Sangre para cultivo
Normas para la recogida y traslado de muestras remitidas
para tinciones y cultivos bacterianos y fúngicos

Sangre para examen microscópico
• Anaplasma, Ehrlichia, borrelia:
• Preparar extensiones gruesas y finas de un pinchazo en el pulpejo de un dedo o sangre con EDTA.
Catéter intravascular
• Retirar asépticamente, cortar un segmento (5,5 cm) desde la punta.
• Colocar segmento en un recipiente estéril.
• Trasladar rapidamente para prevenir que se seque.

Catéter Foley
• No aceptable para cultivo
• El crecimiento presenta microbios de la uretra distal.
• Recoger la muestra en un recipiente estéril
• Remitir inmediatamente al laboratorio
• Medio de transporte Cary-Blair si retraso en traslado.
• No procesar: hospitalización mayor de 3 días
• Notificar si se sospecha un patógeno específico.
Heces

Líquidos orgánicos
Pericárdico, peritoneal, pleural, sinovial:
• Al menos 2-5 ml para bacterias
• Más de 10 ml para hongos y/o micobacterias
• Transportar en un sistema de recogida anaerobio
• Neisseria es inhibida por anticoagulante de frascos
• 1-2 ml para bacterias
• 5-10 ml óptimo para micobacterias u hongos
Líquido cefaloraquídeo

Es aquel que contiene una serie de nutrientes y condiciones fisicoquímicas adecuadas para el crecimiento y
diferenciación de los microorganismos
Componentes de un medio de cultivo
Fuente de carbono
Fuente de nitrógeno
Amortiguadores de pH (soluciones tampón o
buffer)
Laura Barrero Cuevas. Microbiología clínica. España: Editorial Sintesis; 2016
MEDIO DE CULTIVO

Tipos de medios de cultivo
Líquidos (caldos)
• No contiene ningún agente
gelificante
• Microorganismos crecen por
todo el medio.
• Es más rápido
Sólidos
• Proporción de agar, aprox el
1,5%.
• El crecimiento se desarrolla en
la superficie del medio
Semisólidos
• Contienen una proporción de
agar inferior al 0,5%.
• Se utilizan para pruebas
bioquímicas y de movilidad.
 Según la proporción de agar, existen tres tipos:
MEDIO DE CULTIVO

 Según su utilidad:
Nutritivos
Permiten el crecimiento de
la mayoría de los
microorganismos
Ejemplo: el agua de
peptona y el caldo de
tripticasa-soja.
De
enriquecimiento
Contienen componentes
adicionales (además de los
básicos) para permitir el
desarrollo de
microorganismos exigentes,
que no crecerían en un
medio general
Selectivos
Presentan algún
componente que impide el
desarrollo de
microorganismos no
deseados.
Ejemplo, el agar
MacConkey contiene cristal
violeta, que inhibe el
crecimiento de bacterias
gram+ y hongos, facilitando
el desarrollo de bacterias
gram-.
Diferenciales
Contienen sustancias que
ponen de manifiesto alguna
característica de la especie o
grupo de microorganismos
MEDIO DE CULTIVO

 De transporte:
 Soluciones amortiguadoras (buffer)
 Utilizado como almacenamiento temporal a especímenes
transportados.
 Permite la viabilidad de estos microorganismos sin alterar
la concentración de estos.
Características
Son medios líquidos o semisólidos tamponados que
contienen un mínimo de nutrientes y que están diseñados
para evitar el secado, para mantener un pH neutro y para
minimizar el crecimiento de contaminantes bacterianos.
MEDIO DE CULTIVO

Stuart : útil para mantener la viabilidad de gonococos y de otros
microorganismos de difícil desarrollo.
Cary-Blair de Puritan-. indicado para la conservación de muestras fecales y
rectales que contienen bacterias entéricas
Amies-carbón: se utiliza para secreciones de heridas y urogenital, para el
cultivo y aislamiento de gérmenes tratados o en tto con antimicrobianos
y/o expuestos a metabolitos tóxicos
Venkat-Ramakrishnan (VR) medio para el V. cholerae.
Ejemplos de medios de transporte

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