VACUNAS DE ARN

1. Intravenous Nanoparticle
Vaccination Generates Stem-Like
TCF1+ Neoantigen-Specific CD8+ T
Cells

2. INTRODUCCIÓN
Inmuno-terapia contra el cáncer (bloqueo de puntos de control y
la terapia adoptiva con células T)
Vacunas personalizadas contra el cáncer
Mejorar las respuestas de las células T CD8+ con PCV es la
plataforma de la vacuna
Nanopartículas autoensambladas

3. Vacunas ARNm
1990 – células musculares murinas.
Secuencia genómica de un antígeno diana
Menor costo – mayor producción
Traducción de proteínas del ARNm se
produce en el citoplasma
Traducción limitada de proteínas -
respuestas inmunitarias adaptativas débiles

4. ARNm de secuencia
optimizada químicamente
modificadas y no modificadas
ARNm autoamplificadoras (-
dosis)
Traducibilidad, estabilidad y
reactogenicidad
Nanopartículas de lípidos
ionizables biodegradables

7. RABIA: RNActive® con protamina. Modelo murino.
Cerdos. Monos Cynomolgus. LNP.
INFLUENZA: ARNm no modificado. ratones, hurones y
cerdos. ARN modificado en ratones, hurones y NHP.
ARN autoamplificador que expresaba la
hemaglutinina/ratones.
ZIKA: ARNm diferentes que codifican las
glicoproteínas de premembrana y envoltura del virus.
ratones y macacos rhesus
CMV: RNm/LNP que codifican las glicoproteínas gB
del CMV y el complejo pentamérico (PC) provocaron
potentes títulos de anticuerpos neutralizantes en
ratones y macaco

8. METODOLOGIA
• Ratones hembra B6 (C57Bl/6J)
• ratones transgénicos OT-I Rag2 de Taconic. CCR2DTR mice51 were bred inhouse
• 6 y 8 semanas de edad
• 8 semanas recibieron 13 Gy of γ-irradiation (2 doses of 6.5 Gy each) antes de la
reconstitución IV con médula ósea de CCR2DTR.
• Para los experimentos de agotamiento de células utilizando anticuerpos
neutralizantes, se inyectaron a los ratones 200 μg/ratón de anti-CD8β (clon 53–
5.8, BioXcell)
• Agotamiento celular: ratones knockout condicionales (Ccr2DTR), se inyectaron
intraperitonealmente 10 ng/g de peso corporal de toxina diftérica (DT) el día -1,
el día 1 y el día 3 en relación con el momento de la vacunación

9. a, Se recogió sangre completa el día 21 para medir la
frecuencia de células T CD8 tetrámero+ después del
refuerzo. Los gráficos de barras resumen la frecuencia
de células T CD8 tetrámero+ de la sangre (n = 10). b,
Los gráficos de barras resumen la frecuencia de
células T CD8 IFNγ+ de la sangre (n = 10) el día 21. c,
Los gráficos de barras resumen la frecuencia de
células T CD4 IFNγ+ de la sangre (n = 10). d, Los
gráficos de barras muestran las proporciones de las
subpoblaciones MPEC/SLEC en la sangre (n = 10). e, la
frecuencia de MPEC se correlaciona negativamente
con la frecuencia de células T CD8 tetrámero+. f,g, Los
gráficos de barras muestran las proporciones de las
subpoblaciones PD-1/Tim-3 en la sangre (n = 10) de
células tetrámeras+ (f) o células IFNγ+ (g). Los datos
son representativos de dos experimentos
independientes. Las barras representan la mediana.
Las estadísticas fueron evaluadas por Kruskal-Wallis
con la corrección de Dunn para comparaciones
múltiples (a,b,d,f,g) y correlación de Spearman (e)

10. a, Curvas de crecimiento tumoral de ratones no vacunados
(negro) o vacunados con SNP-SC (azul) o SNP-IV (rojo) con
(línea de puntos) o sin α-PD-L1 (línea continua) (n = 10). b,
Análisis de citometría de flujo de células individuales del
bazo (concatenadas, n = 6) después de SNP-SC (panel
superior) o SNP-IV (panel inferior). Las células se tiñeron
con tetrámero Reps1 y otros anticuerpos. Los números
indican el porcentaje de población celular dentro de la
puerta. c, Los ratones se vacunaron con SNP-7/8a que
contenía antígenos Reps1, E7, OVA o Trp1 (n = 5). Los bazos
se recogieron 7 días después del cebado. d, los
esplenocitos se tiñeron con tetrámeros específicos para los
respectivos antígenos. El gráfico de barras resume las
frecuencias de las células T CD8 específicas de antígeno
después de SNP-SC (azul) o SNP-IV (rojo). e, El gráfico de
barras resume las frecuencias de las subpoblaciones TCF1
en el bazo (n = 5) después de SNP-SC o SNP-IV. f, la
frecuencia de células TCF1+PD-1+ se correlaciona
negativamente con la frecuencia de células T CD8
tetrámero+. g, El gráfico de barras resume las frecuencias
de las células efectoras tempranas (EEC, gris), las células
efectoras precursoras de la memoria (MPEC, tostado), las
células efectoras positivas dobles (DPEC, lila) y las células
efectoras de corta duración (SLEC, carmesí) en el bazo ( n =
5) después de SNP-SC o SNP-IV. h, la frecuencia de MPEC se
correlaciona negativamente con la frecuencia de células T
CD8 tetrámero+. Las estadísticas se evaluaron mediante la
prueba de Mann Whitney (d, e, g) y la correlación de
Spearman (f, h).

11. a, los ratones C57BL/6 (n = 5) se vacunaron por vía
subcutánea o intravenosa a 8 nmol el día 0 y el día 14
con SNP-7/8a que contenía Reps1. Los bazos se
recogieron el día 28 y las células T CD8 tetrámeras+
se clasificaron mediante citometría de flujo. Los
diagramas de flujo muestran la estrategia de
activación para la clasificación de celdas. b, los
ratones se etiquetaron individualmente con distintos
anticuerpos marcados con hashtag de oligo y se
agruparon para secuenciación 10x y ARN. Los UMAP
individuales muestran la expresión génica de cada
ratón vacunado SC (panel izquierdo) o IV (panel
derecho). c, El gráfico de barras resume la frecuencia
de los doce grupos de Monocle 3 que están
representados por cada ruta de vacunación. d,
Gráficas de densidad para identificar estados de
estabilidad correspondientes a áreas de mayor
densidad en UMAP, según la estimación de densidad
de kernel 2D. e, la expresión de los genes
expresados ​​diferencialmente superiores (DEG) de
células vírgenes se presenta en gráficos de
significado. f, Heatmap resume el número de células
que comparten un clonotipo basado en secuencias
emparejadas de la región 3 determinante de la
complementariedad alfa y beta (CDR3) en cada
animal individual. g, El gráfico de barras muestra el
número de células similares a las madre (grupos 2 y
4) y células efectoras (grupos 1, 3, 5, 7 y 8) en cada
clonotipo de ratones vacunados SC o IV. En los
gráficos solo se representan los clonotipos
expresados ​​por más de 100 células. h, mapa de calor
de DEG expresado en cada grupo organizado a lo
largo de la trayectoria de pseudotiempo.

12. a, Crecimiento tumoral de ratones tratados con SNP-
7/8a con (rojo) o sin agonista (gris) (n = 10). b,
Crecimiento tumoral promedio de SNP-IV (rojo),
SNP-SC administrado dos veces (azul), una vez el día
7 (azul punteado) o dos veces a una dosis más baja
(azul claro) (n = 10). c, números totales de células T
CD8, células T CD4 y células NK y d, frecuencia de
células T CD8 tetrámero+ de la sangre en ratones
tratados con anticuerpo de control de isotipo (rojo)
o anticuerpos bloqueadores contra CD8β (negro),
CD4 (azul) o NK1.1 (púrpura) evaluado por
citometría de flujo (n = 10). Los bazos y los tumores
se recolectaron el día 14 (n = 10) y el día 21 (n = 3–
5). e, células de tipo madre (TCF1+PD-1+; azul
oscuro), f, células efectoras (Granzyme B+TCF1−;
naranja) o g, células agotadas (PD-1+Tim-3+) de
células tetrámeras+. identificado por citometría de
flujo. Los gráficos de barras resumen la frecuencia
de las células en el bazo el día 14 (barra llena) o el
día 21 (barra marcada) (n = 3–10). h, Los gráficos de
barras resumen la frecuencia de células Ki-67+ en
diferentes tejidos el día 14 (barra roja) o el día 21
(barra marcada) después de SNP-IV (n = 3–10). Los
datos son representativos de cuatro experimentos
independientes. Las barras representan la mediana.
Las estadísticas se evaluaron mediante ANOVA de
dos vías con corrección de Bonferroni (a,b) y prueba
de Mann Whitney (e,f,g,h).

13. a, Imágenes de cuerpo entero de ratones
después de SNP-SC o SNP-IV con vacunas
marcadas. b, Imágenes confocales de LN o
secciones de bazo de un ratón no vacunado. c,
Imagen confocal de la sección LN poplítea
posterior a SNP-SC. Superposición detallada de
marcadores adicionales. Blanco, vacuna; rojo,
ERTR7 (estroma); naranja, CD11b (monocitos,
macrófagos o cDC2); CD11c (moDC o cDC).
Barra de escala, 200 μm o 50 μm (recuadro). Las
flechas muestran la colocalización de la vacuna
y las células CD11b+CD11c+. d, estrategia de
selección para identificar varias poblaciones de
LN poplíteo y bazo después de SNP-SC y SNP-IV:
MoDC (rojo), monocitos (rosa), macrófagos del
seno subcapsular, SCS (gris), macrófagos de
pulpa roja, RPM (gris oscuro) , cDC1 (granate),
cDC2 (coral). Cinética de los MNP que son
vacuna+ en e, LN poplíteo o f, bazos después de
SNP-SC o SNP-IV respectivamente (n = 3). g, los
histogramas muestran MFI de CD80, CD86,
CCR7 y vacuna marcada en cDC1 o moDC
migratorias o residentes en LN poplítea de
ratones vírgenes (grises) o SNP-SC después de la
vacunación (concatenados, n = 3). h, i, análisis
de citometría de flujo de células individuales
teñidas con XCR1 y CD86 después de activar
cDC1 en bazos o LN poplíteos de ratones
después de SNP-IV o SNP-SC respectivamente (n
= 3). Los datos son representativos de dos
experimentos independientes

14. a, ratones WT, Batf3-/- o CCR2-/- (n = 10) fueron
vacunados SC o IV a 8 nmol el día 0 y el día 14
con SNP-7/8a (Reps1) (n = 3). b, Se midió el
número total de cDC1 en LN poplíteo y bazo, o
monocitos en LN poplíteo (panel derecho) de WT,
Batf3-/- o CCR2-/-. c, las quimeras de BM se
realizaron irradiando ratones WT CD45.1 y
transfiriendo BM de ratones CCR2DTR o WT
CD45.2. Después de 8 semanas de reconstitución
adecuada, los ratones se trataron con DT (n = 3).
d, se midió el número total de monocitos, cDC1 y
cDC2 en el bazo de ratones CCR2DTR 24 h
después del tratamiento con DT. e, la cinética de
las respuestas de células T CD8 específicas de
neoAg en la sangre de CCR2DTR vacunado por vía
IV sin tratamiento con DT, o la quimera WT
CD45.2 BM vacunada por vía IV con o sin
tratamiento previo con DT mostró respuestas
similares (n = 8–10). f, los sueros se recolectaron
después de SNP-SC (azul) o SNP-IV (rojo). IL-12
(panel izquierdo) o IFN-α (panel derecho) se
midieron por ELISA (n = 3). g, Se midió el número
total de monocitos y cDC1 en LN poplíteo de WT,
IFNAR-/- o TLR-/- mediante citometría de flujo. h,
histogramas de EOMES activados en células
tetrámeras+ después de SNP-SC en ratones WT o
IL-12-/- (n = 4). Los datos son representativos de
dos experimentos independientes. Las
estadísticas se evaluaron mediante la prueba de
Mann Whitney (d) o Kruskal-Wallis con la
corrección de Dunn para comparaciones
múltiples (g).

15. CONCLUSIÓN
• Este estudio muestra que la vía de administración de la vacuna SNP-7/8a afectó
sustancialmente la magnitud y la calidad transcripcional de los CD8 específicos de
neoAg.+Respuestas de células T
• Tuvieron un impacto correspondiente en la funcionalidad y los resultados
terapéuticos.
• Estos hallazgos tienen implicaciones en el desarrollo clínico de vacunas
terapéuticas para pacientes con cáncer.