TCR ab aislado restringido por HLA-A.

1. Un TCR ab aislado restringido por HLAA*02:01/CT37
Péptido que redirige las células T CD8+ para matar y
secretar IFN-g en respuesta a líneas celulares de
adenocarcinoma de pulmón
Alumnos: Johnny Aguilar Montalván
José Marino Gonzales Vásquez

2. El cáncer de pulmón es una de las principales causas d
e muerte relacionada con el
cáncer
entre hombres y mujeres en los Estados Unidos, donde
el
cáncer de pulmón de células no pequeñas representa a
proximadamente el 85% de los cánceres de pulmón.
En este estudio, informamos el aislamiento de as cad
enas de TCR a y b específicas del péptido HLAA*
02:01/CT37 de un clon de
INTRODUCCIÓN

3. La primera opción es
el tratamiento con estos Abs a demostrado que estos
tumores expresan Ags inmunogénicos . Algunas de
las moléculas inmunogénicas más expresadas (aberr
antemente) en varios tumores, incluido el
adenocarcinoma de pulmón (ADC), son los Ags cán
cer/testículo (CT).
Además, desarrollamos una cadena CD3z modificad
a capaz de mejorar
INTRODUCCIÓN

4. Selección del CT Ag
• El estudio seleccionó aquellos Ag CT con proteína expresada solo en células
cancerosas, además seleccionaron aquellos CT Ag que se expresan en NSCLC (7–
11). Un CT Ag ideal tendrá péptidos restringidos por las moléculas MHC de clase I
más frecuentes en varias poblaciones, incluidas HLA-A*02:01, HLA-A*24. :02.
Pacientes
• Se reclutó un total de 43 pacientes, incluidos 20 pacientes con ADC de pulmón, en
2010-2012. El resto fue reclutado en 2013.
• Seleccionamos nueve pacientes positivos para HLA-A*02:01, cuyos tumores
expresaban ARNm de CT37. Cuatro estaban dispuestos a donar leucocitos para el
análisis FACS y el aislamiento y clonación de las cadenas a y b de TCR.

5. Ensayo de PCR en tiempo real
Para la evaluación de la expresión de CT37 (FMR1NB/NY-SAR-35), utilizamos el sistema de PCR en tiempo real
rápido 7500 y cebadores de ensayo bajo demanda para CT37
El ARN total se extrajo de los tejidos tumorales utilizando el RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit RNA o de las células
utilizando el kit de aislamiento de ARN de Qiagen. El ADNc se obtuvo a partir de 3 mg de ARN total utilizando el
kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad
Análisis IHC de tejidos pulmonares
Se utilizaron las muestras de tejido pulmonar de 10 pacientes con ADC pulmonar que se sometieron a cirugía, se
fijaron en paraformaldehído y se incluyeron en parafinas.
Se utilizó la recuperación de epítopos inducida por calor en tampón citrato (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA), Ab policlonal CT37 antihumano de conejo HPA011284 y un sistema de detección de polímeros.

6. Aislamiento de células T CD8+ específicas del péptido HLA-A*02:01/CT37
Los leucocitos se obtuvieron del donante NSCLC_7 mediante leucoféresis. La mitad dela bolsase utilizó para aislar
PBMC mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Luego, se seleccionaron células T CD8+ utilizando el kit de
aislamiento de células T CD8+ de Miltenyi Biotec para aislar células péptido-Ag específicas mediante selección
positiva utilizando pentámeros biotinilados.
Se añadió IL-2 humana recombinante 72 h después de la estimulación con péptidos y los cultivos se dejaron
durante 10 días (para dejar reposar las células). Luego, 48 h después de la estimulación con IL-2 y cada 48 h
posteriormente, se recuperaron100 ml de medio de cultivo gastado de cada pocillo y se reemplazaron por 100 ml
de medio completo nuevo por pocillo. Después de dos ciclos de estimulación, se recogieron las células; Las células
vivas se obtuvieron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll y se analizaron mediante FACS para control de
calidad.
Los cultivos se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada a 37ºC y 5% de CO2
Clonación de células T CD8+ específicas del péptido HLA-A*02:01/CT37
Se clonaron células T CD8+ específicas del péptido HLA-A*02:01/CT37 utilizando la técnica de dilución
limitante.
72 h después de la estimulación con péptidos. Los cultivos se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos
humidificada durante 10 días (para dejar reposar las células), a 37 ° C y 5 % de CO2

7. Aislamiento y clonación molecular de los ADNc de las cadenas a y b de
TCRespecíficos del péptido CT37
A continuación, se lisaron T CD8+ específicas del péptido utilizando tampón RLT y
se extrajo el ARN total utilizando el kit de aislamiento de ARN de Qiagen. Se
agregaron ARN en inhibidor de RNasa al ARN total extraído.
El ADNc de la primera cadena se preparó a partir del ARN total transcrito de forma
inversa utilizando el kit SMARTer RACE
Aislamiento de proteínas de la superficie celular y análisis Western Blot
Las proteínas de la superficie celular de células T CD8+ transducidas con retrovirales
estables se biotinilaron y aislaron para inmunoprecipitación y análisis Western Blot
utilizando el kit de aislamiento de proteínas de superficie celular Thermo Fisher
Scientific Pierce, anti-TCRb Ab.

8. Análisis FACS
FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter) es un tipo especializado de
citometría de flujo, que ordena una población de células en subpoblación
utilizando etiquetado fluorescente.
Producción de IFN-g y ensayos ELISPOT de IFN-g
Se realizaron experimentos en frío similares. Los sobrenadantes se
recogieron de cocultivos E:T que se dejaron durante 4 h y se analizaron
para determinar la secreción de IFN-g utilizando kits ELISA de alta
sensibilidad (Thermo Fisher Scientific)
•

9. RESULTADOS
• Se seleccionaron 3 antígenos Cáncer/Testículo (CT Ag) por tener expresión de proteínas
restringida a testículo/ovario y expresada en NSCLC con secuencias peptídicas restringidas por
3 de los alelos del MHC clase I más frecuentes en todas las poblaciones de diferentes etnias.
• Único con péptidos de unión fuerte restringido por la mayoría de las moléculas del MHC de clase I más
frecuentes en varias poblaciones incluidas: HLA-A*02:01 , HLA-A*24:02, HLA-B*07:02
CT 37
VCX3a
XAGE1b
Seleccionamos péptidos con un límite de tasa de unión porcentual (tasa porcentual) <0,1 para
aumentar la probabilidad de que un péptido se una a las moléculas MHC de clase I seleccionadas in
vivo.

10. Seleccionamos el péptido
YLCSGSSYFV restringido a
HLA-A*02:01 porque tiene
una secuencia de
aminoácidos central como la
del péptido YYLCSGSSYF.
Este último péptido
YYLCSGSSYF tiene una tasa
porcentual <0,1 para HLA-
A*24:02, pero no para HLA-
A*02:01
Por lo tanto, utilizaron esos
péptidos para el estudio
porque uno es un control
excelente para el otro.

11. • Los pacientes reclutados eran de ascendencia hispana. De la revisión de casos, 43 casos
cumplieron con los criterios y 9 eran portadores de alelos HLA-A*02:01 y expresaron CT37 a
nivel de ARNm.
• Cuatro de esos nueve casos expresaron CT37 por IHC (~44%) en los niveles indicados.
• En total, 34 fueron HLA-A*02:01 negativos; de ellos, 12 expresaron CT37 a nivel de ARNm y
proteína mediante IHC (35,29%).
• Por lo tanto, 21 de 43 casos expresaron ARNm de CT37 y fueron positivos mediante IHC
(aproximadamente 48,83% de 43 casos) .
• De esos 21, solo 5 expresaron niveles moderados (23,8%) y 16 niveles bajos (76,2%) de
CT37 por IHQ. Sin embargo, entendemos que se necesita un tamaño de muestra mayor para
abordar el tema con mayor claridad.
• Se identificó un paciente portador de un alto porcentaje de células T CD8+ específicas del péptido HLA-
A*02:01/CT37.

13.  El paciente NSCLC_7, que estaba dispuesto a donar
leucocitos, tenía células tumorales que expresaban
niveles moderados de CT37 Ag mediante IHC.
 La expresión de CT37 se observó claramente en el
citoplasma y la membrana celular de células
malignas, además, aproximadamente el 8% de sus
células T CD8 + circulantes portaban un TCR
específico para el péptido HLA-A*02:01/CT37
YLCSGSSYFV, según lo determinado mediante
análisis FACS.
 Este paciente tenía un ADC de pulmón portador de
una mutación conductora de EGFR en el exón 21

14. • Dado que el paciente NSCLC_7 estaba dispuesto a donar leucocitos, se decidió aislar sus células T
CD8 + específicas de Ag .
• Después de dos estimulaciones in vitro, se obtuvo una población pura del 98% de células T
CD8 + policlonales que expresaban un TCR restringido por complejos HLA-A*02:01 MHC clase
I/péptido CT37 YLCSGSSYFV, Aislándose luego dos clones celulares de 300 células T CD8+
policlonales específicas de este péptido .
• Se amplió un clon, alcanzando un número final de 1,6 × 10 6 . Se amplió, clonó molecularmente,
expandió y secuenció el ADNc que codifica las cadenas α y β de TCR de ese clon de células T CD8 + .
Clonamos molecularmente las cadenas α y β de TCR específicas del péptido HLA-A*02:01/CT37 a partir de
un clon de células T CD8 +

15. • La expansión in vitro de células transducidas estables produjo células T CD8 + puras al 93%.
• Utilizando el análisis FACS, observamos una alta expresión de nuestras construcciones TCRαβ
en células T CD8 + transducidas .
• La expresión de las construcciones TCRαβ fue mayor para las construcciones 2 y 3, que
portaban la cadena CD3ζ
Se produjo tres construcciones , se transfirió con éxito y se expresó en células T CD8 + purificadas
alogénicas.
las tres construcciones. Los cuadros representan las secuencias de aminoácidos de las cadenas indicadas dentro de los cuadros.

16. • Para determinar la avidez funcional del TCR clonado para los complejos HLA-A*02:01/CT37
péptido YLCSGSSYF, primero calculamos la concentración de péptido necesaria para obtener
el 50% de la lisis máxima (CE 50 ) utilizando una dilución en serie del péptido YLCSGSSYFV.
• Para obtener experimentalmente valores de CE 50 , utilizamos una proporción 16:1 E:T de
células T CD8 + aisladas de seis donantes sanos positivos HLA-A*02:01 , que fueron
transducidos con la construcción 1, y sus células CD3 autólogas
PBMC autólogas con células CD3 empobrecidas por lisis de células T
CD8 + transducidas con TCR en un péptido HLA-A*02:01/CT37 YLCSGSSYFV con alta
avidez funcional

17. • Para determinar si las construcciones de TCRαβ eran funcionales y
estaban restringidas por complejos HLA/péptido apropiados, se
probó si las células T CD8 + transducidas podían lisar células
autólogas HLA-A*02:01 pulsadas con el péptido CT37 YLCSGSSYFV o
el péptido de control CT37-YYLCSGSSYF .
• Las células T CD8 + transducidas con todas las construcciones
fueron capaces de lisar objetivos autólogos pulsados ​​con el péptido
CT37 YLCSGSSYFV, pero no aquellos pulsados ​​con el péptido CT37-
YYLCSGSSYF de control .
• las actividades de lisis de las células T CD8 + transducidas con las
construcciones 2 y 3 fueron significativamente mayores que las de
las células transducidas con la construcción 1, siendo la más alta las
células transducidas con la construcción 3.
Las células T CD8 + transducidas con constructo lisaron PBMC autólogas
empobrecidas en células CD3 en una forma altamente específica restringida al
péptido HLA-A*02:01/CT37 YLCSGSSYFV

18. • Tanto los niveles de secreción de IFN-γ como la frecuencia de las células T CD8+ secretoras de
IFN-γ fueron significativamente mayores en las células T CD8 + transducidas con las
construcciones 2 o 3, en comparación con las células T CD8 + transducidas con la construcción
1.
• Cuando se expusieron a células autólogas pulsadas con el péptido CT37 YLCSGSSYFV se
observó el nivel más alto para las células T CD8 + transducidas con la construcción 3.
• No se pudo detectar la secreción de IFN-γ o la frecuencia de las células T CD8+ secretoras de
IFN-γ mayor que el fondo en cultivos donde las PBMC fueron pulsadas con el péptido CT37
YYLCSGSSYF de control.
Las células T CD8 + transducidas con constructo produjeron IFN-γ cuando se estimularon con
PBMC autólogas empobrecidas en células CD3 en un péptido HLA-A*02:01/CT37 restringido a
YLCSGSSYFV

19. • Se examinó si las células T CD8 + transducidas con nuestras construcciones exhibirán las
mismas funciones cuando se expongan a líneas celulares de ADC de pulmón.
• Se genotipó líneas celulares de ADC de pulmón disponibles para la detección de aquellas que
portan el alelo HLA-A*02:01 .Primero probamos las líneas HLA-A*02:01 positivas HCC2935 y
H1993, y la línea HLA-A*02:01 negativa H1299 como control.
• HCC2935 fue la única línea que portaba una de las mutaciones causantes del cáncer
analizadas. La línea porta un alelo con una deleción de EGFR de 15 nucleótidos en el exón 19
y un alelo de EGFR de tipo salvaje . Independientemente de la mutación causante del cáncer
que portaban estas líneas, observamos que todas expresaban el ARNm y la proteína CT37
•
Líneas celulares de ADC de pulmón lisadas con células T CD8 + transducidas con constructo que
expresan CT37 Ag de forma restringida a HLA-A*02:01

20. • Las células T CD8 + transducidas con la construcción 3 lisaron
significativamente HCC2935 y H1993 en una forma restringida a HLA-
A*02:01.
• Sorprendentemente, las células T CD8 + transducidas con cualquiera de las
construcciones no pudieron lisar la línea H1299 negativa para HLA-A*02:01 .
• También se observó que las células T CD8 + transducidas con la construcción
3 secretaron los niveles más altos de IFN-γ cuando se cultivaron en
presencia de las líneas celulares HLA-A*0201 positivas HCC2935 y H1993,
pero no cuando se cultivaron en presencia de HLA . -A*02:01 –línea H1299
negativa.

21. • El estudio en pacientes que padecen ADC de pulmón combinados con los experimentos
ex vivo e in vitro llevan a la identificación y aislamiento de un clon de células T CD8+
específico del péptido CT37 y a la clonación molecular de cadenas α y β de TCR únicas
de este clon mediante:
 El análisis ex vivo de tejidos utilizando CT37 IHC.
 La identificación del péptido CT37 YLCSGSSYFV seguida de la identificación de un
portador de un porcentaje relativamente alto de células T CD8 + policlonales
restringidas por complejos peptídicos HLA-A*02:01/CT37 en sangre periférica.
 Nuestro modelo in vitro utilizando PBMC autólogas empobrecidas en CD3.
• Es de destacar que el IFN-γ es un estimulador clave de la expresión de la molécula
proteosoma y MHC de clase I .
• El estudio también demuestra que los enfoques in silico son útiles para identificar
péptidos y especificidades del MHC de clase I adecuadas para el desarrollo de
plataformas preclínicas de transferencia adoptiva..
DISCUSIÓN

22. • El hecho de que el paciente NSCLC_7 tuviera características clínicas de un sobreviviente
libre de cáncer a largo plazo después de una intervención clínica adecuada y, tuviera
porcentajes relativamente grandes de células T CD8 + circulantes portadoras de TCR que
reconocieran los complejos Ag-péptido HLA-A*02:01/CT37. puede impulsar la
identificación de casos similares para el aislamiento de TCR únicos y para el desarrollo
de intervenciones oportunas de inmunoterapia.
• El estudio está de acuerdo con el concepto de que algunos CT Ag son objetivos excelentes
para el desarrollo de inmunoterapias basadas en células inmunitarias, de hecho, la
expresión proteica de CT37 Ag probablemente esté restringida a testículos/ovarios y
células malignas.
• Creemos que nuestras cadenas y construcciones α y β de TCR clonadas son adecuadas
para la evaluación preclínica in vivo de su actividad antitumoral, utilizando modelos
animales.

23. • Si los estudios de transferencia adoptiva en modelos animales demuestran una eficacia significativa
y se busca avanzar hacia los primeros estudios en humanos, se debe investigar a fondo la expresión
de CT37 en tejidos humanos normales para evitar riesgos potenciales al atacar este Ag en estudios
en humanos.
• Entendemos que la diferencia entre especies podría ocultar toxicidades tisulares normales que
podrían ocurrir en pacientes humanos.
• De las tres construcciones producidas, la construcción 3 es la más prometedora porque las células T
CD8 + transducidas con esta construcción exhibieron la mayor secreción lítica de IFN-γ y la
frecuencia de células secretoras de IFN-γ. También observamos que esos niveles de IFN-γ
aumentaron la expresión de HLA-A*02:01 cargadas con el péptido CT37 YLCSGSSYFV y de
moléculas clave de inmunoproteasoma .
• Esto es alentador porque algunos tumores de ADC de pulmón escapan a la vigilancia inmune al
disminuir la actividad del proteasoma y la expresión de las moléculas del MHC de clase I, y se sabe
que el IFN-γ mejora tanto la actividad del proteasoma de las células tumorales como la expresión de
las moléculas del MHC de clase I .

24. CONCLUSIONES
• Concluimos que los hallazgos permitirán lanzar el desarrollo de una plataforma para realizar
estudios preclínicos que evalúen y comparen in vivo si la transferencia adoptiva de células T
CD8 + transducidas con nuestras construcciones será capaz de reconocer células ADC de
pulmón que expresan el Complejos Ag, HLA-A. *02:01/CT37 para activarse y expresar
actividad CTL eficiente y producción de IFN-γ, como lo hicieron in vitro.
• Además, si los estudios in vivo en modelos animales tienen éxito, no se realizarán los
primeros estudios en humanos hasta que se descarte completamente la expresión de CT37 en
tejidos humanos normales. Esto ayudará a evitar los peligros potenciales de atacar este Ag en
estudios en humanos.