El documento introduce los conceptos básicos de biología molecular, incluyendo la estructura del ADN, la transcripción y traducción genética, y las herramientas de biología molecular como enzimas de restricción y PCR. También describe cómo la biología sintética, la ingeniería genética y la biotecnología moderna permiten diseñar nuevos organismos y sistemas biológicos para aplicaciones útiles.

1. Introducción a la biología molecular Raul Blas Facultad de agronomia Dpto. Fitotecnia [email_address] Curso: Bioseguridad y Biotecnología Moderna

3. Biología es tecnología. La biología es la tecnología más antigua. A lo largo de la historia de la vida en la Tierra, los organismos han hecho uso de unos a otros en formas sofisticadas (Carlson, 2010). La tecnología es un proceso y un conjunto de conocimientos tanto como una colección de artefactos (Carlson, 2010)

4. Interacción entre organismos constituye una economía natural global que mueve los recursos naturales a escalas desde molecular a macroscópica Los seres humanos siempre han dependido explícitamente de esta economía biológica para proveerse de alimentos, oxigeno, y otros servicios. Hasta hace poco, nuestra economía industrial se basó principalmente en tecnologías no biológicas; la revolución industrial fue construida principalmente sobre el fuego, minerales y química. Ahora, nuestra economía parece estar cambiando rápidamente, y basados en la incorporación de nuevos organismos cuyos genomas han sido modificados a través de la aplicación del esfuerzo y el ingenio humano.

5. formas de uso de la biología como tecnología agricultura mejoramiento genético e.g. La biorremediación utilizado para limpiar los contaminantes (generados por otras tecnologías humana) a través de la selección de las plantas y los animales que se alimentan de materiales que se consideran en general como residuos o desperdicios.

6. 1828: Friedrich Wohler , produjo cristales de Urea Nacio la quimica organica sintetica 1843-45: Hermann Kolbe, sintetizó acido acético a partir de sus elementos inorgánicos

7. http:// syntheticbiology.org / (MIT) Biología Sintética (BS) es el diseño y construcción de nuevas partes biológicas, dispositivos y sistemas. el rediseño de sistemas biológicos naturales, ya existentes, para aplicaciones útiles. BS se basa en trabajos recientes en la biología de sistemas que consiste en la modelación de sistemas biológicos, pero va más allá de la construcción y la estandarización de partes biológicas, que se unen para formar sistemas más complejos. BS se basa en el desarrollo de las matemáticas, computación, bioquímica, etc.

9. La genética Molecular La “molecularización” de la genética en los años 1950 cambió el estudio de las herencias en general. Molecularización se refiere: a la caracterización de los procesos biológicos a la escala de las proteinas, y ácidos nucleicos (ARN, y ADN); en la identificación de las modalidades de bloqueo de los procesos biológicos elementales por las alteraciones de las macromoléculas. El desarrollo de cristalografía de rayos X, y resonancia magnética molecular, en las décadas antes de 1950 abrió la venta al mundo molecular.

10. Experimento de Frederick Griffith, 1928

11. El principio de la transformacion era DNA

12. Que es el DNA? Componentes fundamentales de los acidos nucleicos : Componente acido: Fosfatos Componente neutro: Azucares Componente basico: Bases nitrogenadas Adenina, Guanina, Citosina y Timina

13. Estructura del ADN Nucleotidos unidos por enlaces fosfodiester

16. Pares de bases DNA doble hebra Célula Cromosomas núcleo Antiparalelismo de las dos hebras

17. Ta mano de genomas y numero de genes en vegetales Source : INRA (2003) ; Borém et al. (2003) ; Delseny, et al . (2004) ; Gibson & Muse (2004), pb = paire de bases, 1Mb = 10 6 pb

18. Tipos de secuencias del genoma nuclear Tipo de secuencias Número de copias por genoma Que son? Secuencias únicas 1 copia o unos pocos Famila multigenica Genes que codifican proteinas Secuencias medianamente repetidas 1000 a 100000 copias Genes que codifican para ARNr, ARNt, eventualmente de genes de protéinas Secuencias altamente repetidas 100000 a 1000000 No son genes, Rol poco conocido

19. Genomas en los organismos genoma es el conjunto de todas las secuencias de DNA de un individuo o de una especie .

20. Un gen es el conjunto de secuencias de DNA que incluye: Secuencias estructurales (intrones, exones) y Secuencias reguladoras , necesarias para codificar un producto genico, sea este un RNA maduro de cualquier tipo o una proteina funcional . Que es un gen?

21. Gen RNA Proteina

23. Transmisión de la información genética

24. Secuencias reguladoras Exon1 Intron1 Exon3 Exon2 Exon4 Intron2 Intron3 Región reguladora Región estructural Donde? Cuando? Que cantidad? Exon1 Intron1 Exon3 Exon2 Exon4 Intron2 Intron3 Pre-mRNA Exon1 Exon3 Exon2 Exon4 AAAAA Proteína Transcripción Maduración de mRNA Traducción

25. Corte y empalme de exones

26. … 30% de genes

27. Código genético El codigo genetico es el conjunto de pautas que rigen la transferencia de la informacion contenida en el mRNA (transcrito del DNA) para la sintesis de las proteinas Es la correlacion entre dos lenguajes informativos: la secuencia de nucleotidos en el mRNA (el lenguaje con 4 letras de los acidos nucleicos) La secuencia de aminoacidos en el polipeptido (lenguaje con 20 letras de las proteinas) Concretamente, el codigo genetico establece la correspondencia entre los 64 posibles tripletes de bases del mRNA y los 20 aa de las proteinas.

29. Modelos de representacion Formato en tabla Se han elaborado diversos modelos (tablas, esquemas, etc) para representar de forma clara y sencilla la correlacion existente entre codones del mRNA y aa del polipeptido traducido En todos los modelos, la secuencia del triplete se refiere al codon del mRNA

30. Video mRNA-aa

32. Interaccion de los factores de transcripcion con la polimerasa La flexibilidad del DNA permite la aproximacion fisica de los tres tipos de secuencias promotoras a pesar de su lejania en la secuencia lineal de DNA. De esta forma los factores de transcripcion unidos a las regiones basal, proximales, y distales pueden contactar entre si y con la RNA polimerasa II, por lo que participan en forma conjunta en el control del inicio de la transcripcion.

33. Genes constitutivos ; aquellos que se expresan de una forma constante, a la misma velocidad en todo momento de la vida celular (~ genes domesticos o caseros(housekeeping genes) Genes inducibles ; estan reguladas en tiempo y espacio (~genes regulables o de expresion diferencial), los TFs que regulan estos genes no estan presentes en la celula de forma continua, sino que se sintetizan o se activan en momentos especificos o en tejidos particulares.

34. Herramientas básicas de biología Molecular Enzimas de restricción Ligación PCR Electroforesis Hibridación Southern Blot

35. Secuencias Palindromicas Enzimes de restriccion Sequence is symmetrical about the center point G A A T T C C T T A A G Point of cleavage Point of cleavage 5’ 5’ 3’ 3’

37. Corte de DNA con Eco RI Restriction enzymes

38. Mecanismos de Ligación ATP

39. Mecanism o de liga c ion

40. Electroforesis

45. Sonda ( probe ) e s un fragment o de DNA de longitud variable ( ~ 100-1000 bases longitud) Es u s a d o para detect ar muestras de DNA o RNA (la presenc ia de secuencia de nucleotid os que son complementar ios a la secuencia de la sonda) La sonda de hibridizacion es marcado radiactivamente (comm unmente con 32 P) o con marcdores inmunologicos como digoxigenin. La sonda marcada es denaturada ( por calentamiento ) en simples hebras de DNA y h i bridiz a d a al DNA objetivo ( target DNA ) (Southern blotting) or RNA (northern blotting) Se immobiliz a sobre la membran a . Secuencias de DNA complementrias a la sonda son detect a d as por la visualizacion de la sonda a traves de la autoradiografia.

46. Hibridación Sonda DNA Sonda Marcada H i brid ac ion DNA Blanco CGCAGATCTAAT ATAT CGCAGATCTAAT ATAT CCTTCCGGAATTA GCGTCTAGATTATATA CCAGAATAGGCTA CGCAGATCTAAT ATAT

47. Gel despues de electroforesis Detectado con sondas hibridadas

48. Southern Blot Es el procedimiento por el cual se transfiere el DNA que ha sido digerido y corrido en un gel de agarosa (0,8%), hacia una matriz sólida tal como es una membrana de nylon. El total de DNA que se digerió se corre en un gel de agarosa (0,8%). El ADN se encuentra en forma de fragmentos de doble cadena que son muy cortos (100 pb) y otros muy grandes (15000 pb), por lo que el gel es sometido a determinadas soluciones para que los fragmentos puedan ser transferidos hacia la matriz sólida en forma de cadenas simples. (NaOH)

49. NaOH 0.4M

50. Capaci dad de analisis de genoma completo S intesis de genes? 10 .000 ans de processus de domestication et d’ agriculture 4. Era –”omica” Genomica Proteomica Metabolomica

51. DNA RNAi, snRNA, miRNA tRNA rRNA mRNA Regulación/expresión génica Transferencia Ribosomas Proteína metabolitos Genoma Proteoma Transcriptoma Metaboloma Fenotipo

52. InformacionBiologica Genome Genome Genome mRNAs 1 mRNAs 2 mRNAs 3 Proteome 1 Proteome 2 Proteome 3

53. Perspectivas-conclusiones

55. Animales y plantas se convierten en objetivo (blanco) como biorreactores naturales para producir nuevos productos, los que nunca fueron creados por mutagenesis, cruzamientos o seleccion Esta nueva tecnologia facilita(rá) el desarrollo radical de nuevas terapias medicas,y sistemas de diagnostico.

56. Contribucion de la biotecnologia molecular: Proporciona la posibilidad de diagnostico mas fino de las enfermedades y prevencion o cura de un amplio rango de enfermedades infecciosas y geneticas. Incremento del rendimiento de los cultivos (resistencia a stres biotico y abiotico) Desarrollo de micro-organismos que producen quimicos, antibioticos, polimeros, aminoacidos, enzimas y varios aditivos de los alimentos. Desarrolla ganado y otros animales con determinada atributos geneticamente superiores. Facilita la remocion de los contaminantes y material basura del ambiente (bioremediacion)

57. D os aspectos de la biotecnologia pueden haber contribuido a la incertidumbre : La velocidad con que fueron adoptad a s en algunos sectores economicos y llegada asombrosa en el mercado Reacciones (-) de la sociedad sobre biotecnologia El periodo corto de tiempo probablemente no es suficiente para aprender y acostumbrarse a productos transgenicos

58. Capaci dad de analisis de genomas S intesis de genes Tomate silvestre Tomate cultiv ada 10 .000 añ o s de proces o s de domestica c ion y de agricultur a Hibridacion y seleccion Ingenieria Genetica OGM 1 3 2 Evolucion en la Produccion de alimentos 4. Genómica

59. Para la ingeniería de sistemas biológicos, necesitaremos aprender considerablemente mas sobre la forma como las piezas biológicas trabajan juntas. Desafíos surgirán que no son obvias de la observación de todos los sistemas funcionales, pre-existentes. Con el tiempo, vamos a comprender y abordar los desafíos, el uso de la biología va a cambiar drásticamente en el proceso. Conclusiones