Es un Manual para procedimientos de Laboratorio en Toxicología Ambiental

1. MANUAL DE
PROCEDIMIENTOS
“LABORATORIO DE
TOXICOLOGÍA
AMBIENTAL”
Dr. Fernando R. Cussi S.
2010

2. CONTENIDO
Objetivo del Laboratorio de Toxicología Ambiental; Carrera de Ingeniería
Ambiental de la Escuela Militar de Ingeniería.
Objetivos generales y específicos del manual.
Glosario.
Áreas de aplicación.
Responsables.
Relación de procedimientos del Laboratorio de Toxicología Ambiental.
Procedimientos del Laboratorio de Toxicología Ambiental.
Ubicación del Laboratorio.

3. OBJETIVO DEL LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA AMBIENTAL; CARRERA
DE INGENIERÍA AMBIENTAL DE LA ESCUELA MILITAR DE INGENIERÍA.
OBJETIVOS GENERALES DEL MANUAL
El objetivo del presente manual de Toxicología Ambiental es fortalecer la
formación académica de los alumnos de la carrera de Ingeniería Ambiental
mediante una secuencia de actividades en el laboratorio, los cuales pretenden ser
formativos y motivadores. De tal manera, que el trabajo en laboratorio, debe ser
programado, calendarizado y organizado en cuanto a los apoyos humanos y
materiales que permitan lograr las metas planeadas por los objetivos terminales de
la materia.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Los objetivos específicos del presente manual de Toxicología Ambiental, es tal,
que el alumno conocerá los efectos de los diversos agentes contaminantes en la
salud humana, los principales estudios toxicológicos que incluyen la
caracterización del riesgo, evaluación de la exposición de dosis respuesta de los
contaminantes, los procesos de toxicocinética y toxicodinámia que lo llevarán al
entendimiento de los mecanismos de absorción y biotransformación de los
contaminantes dentro del organismo humano. La formación académica recibida
por parte del profesor titular de la materia de toxicología ambiental y el desarrollo
de la actividad aplicativa fomentará y motivará la inquietud investigadora inherente
a cada estudiante, en su afán de conocimiento para conocer y modificar su medio.
GLOSARIO
ÍNDICE
1. Práctica
1. Determinación de la concentración letal media (LC50) del insecticida dimetoato
utilizando la lombriz de tierra Eisenia fetida
2. Práctica

4. 2. Biomarcadores de exposición a plaguicidas organofosforados: actividad
carboxilesterasailización del ensayo de repulsión a un suelo contaminado con
la lombriz de tierra Eisenia fetida.
3. Práctica
3. Utilización del ensayo de repulsión a un suelo contaminado con la lombriz de
tierra Eisenia fetida.
4. Práctica
4.- Biomarcadores de exposición a metales pesados: actividad glutatión-s-
transferasa.
ÁREAS DE APLICACIÓN
DOCENCIA
El docente de la carrera de Ingeniería Ambiental desempeña actividades
formativas prácticas docentes, en el laboratorio de Toxicología Ambiental de la
Carrera de Ingeniería Ambiental, para lo cual requiere de la infraestructura y
material adecuado, lo que conlleva a un aprovechamiento integral por parte del
alumno. Dicha actividad deberá ser tal, que el alumno se sienta motivado y
comprometido con su formación académica.
INVESTIGACIÓN
Las actividades desempeñadas en el laboratorio de Toxicología Ambiental de la
Carrera de Ingeniería Ambiental, involucran a los profesores investigadores, los
cuales desarrollan proyectos de investigación, de los cuales, son responsables de
la implementación, desarrollo, ejecución y evolución de los mismos, siendo parte
fundamental en el fortalecimiento de la infraestructura del laboratorio.
EXTENSIÓN
El laboratorio de Toxicología Ambiental de la Carrera de Ingeniería Ambiental,
desarrollará funciones propias que presten servicios de asesoría y asistencia a
otros organismos públicos y privadas, cuando así fuera necesario, pretendiendo
en lo posible ser autosuficiente, tanto en recursos técnicos y materiales, mediante
dichas actividades, además de fortalecer la infraestructura del laboratorio.
RESPONSABLES
El Coordinador del laboratorio, el docente titular.

5. LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA AMBIENTAL
PRÁCTICA No 1
Nombre de la práctica:
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (LC50) DEL
INSECTICIDA DIMETOATO UTILIZANDO LA LOMBRIZ DE TIERRA
Eisenia fetida
1.- INTRODUCCIÓN
Los ensayos de toxicidad constituye un elemento esencial en el esquema del
proceso Evaluación del Riesgo Ecológico (ERA). Éstos son utilizados
fundamentalmente para recibir los efectos agudos o crónicos de nuevas
sustancias químicas potencialmente peligrosas para el medio ambiente como los
fitosanitarios, o bien para estimar el impacto ecológico de una nueva fuente de
emisión de residuos tóxicos al ambiente (efluentes). Si bien este enfoque de ERA
es predictivo, podemos igualmente hacer uso de los ensayos de toxicidad para
evaluar los efectos tóxicos de un ambiente históricamente contaminado que
ocasione, o pueda ocasionar, un deterioro ecológico. En estos casos estaríamos
empleando los ensayos de toxicidad bajo una perspectiva retrospectiva.
2.- OBJETIVO
• Aprendizaje del significado de LC50, como calcularlo, sus ventajas y
limitaciones.
• Manipulación de la lombriz de tierra.
• Aprendizaje en la ejecución del ensayo de toxicidad aguda, contempla la
utilización del ensayo de toxicidad aguda con la lombriz de tierra como criterio
determinante para definir un suelo contaminado.
.
3.- MARCO TEÓRICO.
En términos generales, los ensayos de toxicidad constituyen el principal
instrumento en la toma de decisiones acerca de la gestión ambiental de una matriz
ambiental contaminada (agua, suelo, sedimento, etc.). Esto ha llevado al
desarrollo de múltiples protocolos estandarizados dependiendo de la matriz

6. ambiental considerada, la especie a utilizar en el ensayo o el tiempo de ejecución
del mismo, entre otros factores.
En la relación de la toxicidad de un suelo contaminado o de una sustancia que
puede contaminar el suelo (ej.: plaguicidas), el ensayo de toxicidad emplea la
lombriz de tierra como un organismo modelo. Estos organismos presentan
cualidades ecológicas y biológicas que justifican su uso como bioindicadores de
contaminación del suelo. En términos generales las lombrices de tierra
representan el 80% de la biomasa del suelo; sus hábitos alimenticios y
escavadores contribuyen a la aireación del suelo, a una mayor filtración del agua y
estructuración del suelo y favorecen la generación de una importante capa de
humus en la superficie del suelo, entre otras características.
Desde el punto de vista ecotoxicológico, Lanno et al. Destacan una serie de
propiedades en relación con la exposición de las lombrices a contaminantes
presentes en el suelo. Algunas de ellas son: presentan un tegumento muy
vazcularizado y desprovisto de cutícula lo que le permite la entrada directa de
contaminantes; son capaces de ingerir grandes cantidades de suelo o fracciones
específicas del mismo (materia orgánica) lo que se traduce en una vía importante
de entrada de contaminantes; muchas especies tienen el tamaño considerable lo
que facilita no solo analizar residuos de contaminantes en diversos tejidos, sino
determinar la respuesta de biomarcadores bioquímicos y moleculares; existe un
amplio conocimiento de la fisiología de estos organismos en la relación a otros
invertebrados.
El porcentaje de supervivencia, la tasa de reproducción o de crecimiento de la
lombriz son los parámetros que comúnmente de utilizan para estimar la potencia
tóxica de un suelo contaminado y/o riesgo de efectos adversos en el ambiente
edáfico. Tales pruebas toxicológicas tienen repercusiones importantes a la hora de
realizar o establecer decisiones acerca de la peligrosidad de un contaminante en
el suelo y en la puesta en marcha de medidas correctoras, de recuperación (ej.:
fitorremediación), o incluso sancionadoras.
Fundamentos de la Operación
Se desarrollara un protocolo de experimentación empleando, un insecticida
(dimetoato, organofosforado) a determinada concentración, el compuesto
organofosforado es ampliamente utilizado en agricultura y se determinará sus
efectos al medio ambiente, específicamente a la fauna, mediante el empleo de la
lombrices de tierra y determinando la dosis letal media.

7. 4.- MATERIALES Y MÉTODOS
4.1.- Materiales y Equipos
El material necesario para el correcto desarrollo de la práctica es el siguiente:
• Lombriz de tierra (Eisenia fetida).
• Placas de petri.
• Inseticida dimetoato.
• Pipetas automáticas y de vidrio.
• Papel de filtro.
• Matraz aforado.
• Tubo de vidrio (o plástico) de 10ml.
• Pinzas.
4.2.- Procedimiento
4.1.- Preparación de las placas para el ensayo de toxicidad.
• Cortar un trozo de papel de filtro utilizando como molde la parte inferior (menor
diámetro) de la placa de petri.
• Cada grupo deberá identificar sus placas (marcador indeleble) con las
concentraciones de dimetoato a ensayar.
• La placa estará lista para ser contaminada con el insecticida y liberar las
lombrices.
4.2.- Preparación del insecticida.
• El insecticida utilizado en la práctica es el dimetoato (organofosforado), un
fitosanitario ampliamente utilizado en la agricultura.
• Las concentraciones que se emplearan en el ensayo de toxicidad se obtendrán a
partir de un producto comercial.
• Las concentraciones a añadir en las pacas serán las siguientes: 0.1, 0.25, 0.5, 1
y 2 μg i.a./ml. El insecticida será disuelto en acetona.

8. • A cada placa de petri se añadirá 1 ml de cada concentración de dimetoato y se
dejara bajo la campaña de gases hasta evaporar la acetona. A las placas ‘control’
se añadirá solamente 1 ml. de acetona.
• Evaporada la acetona, se añadirá 1 ml de agua destilada al papel de filtro
contaminado con el dimetoato.
• Las placas están listas para alojar a las lombrices y dar comienzo el ensayo.
4.3.- Liberación de las lombrices en las placas.
• Se liberan 2 lombrices, tomadas aleatoriamente del grupo, en cada placa petri.
• Las placas se colocarán en oscuridad a la temperatura del laboratorio.
• En este punto se dará por iniciado el ensayo de toxicidad aguda (24h).

9. 5.- INDICACIONES
Tiempo estimado - 2 días
Relación con el programa teórico - ensayos de toxicidad bioindicadores,
principales contaminantes, evaluación del riesgo ecológico.
CÁLCULOS
Para calcular el valor de la LC50 debemos proceder como sigue:
• Contar con el numero de lombrices muertas en cada placa (o concentración)
• Calcular el porcentaje de mortalidad.
• Comprobar si existen individuos muertos en el grupo de control. Si fuese así
debemos entonces corregir los valores de mortalidad haciendo uso de la fórmula
de Abbott:
% M corr = (Mobs – M control) x 10 c
(100 - M control)
• Comprobar que el porcentaje de mortalidad es creciente en relación a la
concentración de dimetoato, de no ser así debemos suavizar los datos, según la
fórmula:
Cuando Mt es menor que Mt-1, entonces:
Mt – 1 = (Mt + Mt- 1)
2
• Realizar un gráfico (papel milimetrado) representando la concentración de
dimetoato en el eje X, y el porcentaje de mortalidad o valor probit en el eje Y.

10. 6. REPORTAR
*Cuestionario
Transformar la concentración de dimetoato en mg/ml (ó ppm) a ug/cm².
Calcular el LC50, si los resultados lo permiten.
¿Cuáles son las limitaciones de este ensayo?
¿Cuáles son las ventajas del ensayo?
¿Cuál ha sido la principal vía de entrada del insecticida a la lombriz?
¿Cuál crees que ha sido el mecanismo de toxicidad del dimetoato en la lombriz?
7. - BIBLIOGRAFÍA
1. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). 1984.
Earthworm, acute toxcity tests. Guideline for testing Chemicals. No. 207. Paris.
France.

11. 2. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). 1984.
Earthworm, reproduction tests. Guideline for testing Chemicals. No. 222. Paris.
France.
3. International Standar Organization (ISO). 1993. Soil Quality – effects of
pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxiciti
using artificial soil substrate. ISO, Geneve, Switzerland. No. 11268-1.
4. International Standar Organization (ISO). 1998. Soil Quality – effects of
pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on
reproduction. ISO, Geneve, Switzerland. No. 11268-2.
5. International Standar Organization (ISO). 2004 Draft: Soil Quality – avoidance
tests for evaluating the quality of soils and the toxicity of chemicals. Tests winth
earthworms (eisena fetida/andrei). Geneve, Switzerland.
6. Jongmans AG Pulleman MM, Balabame M. Van Oort F, Marinissen JCY. 2003.
Soil structure and characteristics of organic matter in two orchards differing in
earthworm activity. Appl Soil Ecol 24:219-232
7. Paoletti MG. 1999. The role of earthworms for assessment of sustainability and
as bioindicators. Agric Ecosyst Environ 74:137- 155.
8. Lanno R. Wells J, Conder J, Bradham K, Basta N. 2004. The bioavailability of
chemicals in soil for earthworms. Ecotoxicol Environ Saf 57:39-47

12. LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA AMBIENTAL
PRÁCTICA No 2
Nombre de la práctica:
BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN A PLAGUICIDAS
ORGANOFOSFORADOS: ACTIVIDAD CARBOXILESTERASA.
1.- INTRODUCCIÓN
Las carboxilesterasas (CbE) pertenecen a un grupo de enzimas esterasas que
hidrolizan un amplio rango de ésteres de ácidos carboxílicos.
Las CbEs han sido detectadas en el hígado y muchas especies de vertebrados.
Las CbEs participan en la detoxificación de insecticidas carbamatos y piretroides
(figura 3), por tener una estructura química similar a los ácidos carboxílicos. Por
ejemplo, los productos de la hidrólisis de los carbamatos son un alcohol y el ácido
cárbamico, el cual se descompone rápido en CO2 y metilamina (fig. 3 A). Tales
productos son fácilmente excretados por tener una solución en agua mayor que el
compuesto parental.

13. 2.- OBJETIVO.
Los objetivos de la práctica son los siguientes:
• Aprendizaje en le ensayo de actividad CbE en plasma.
• Aprendizaje en el ensayo enzimático discontinuo.
• Corroborar si existen diferencias en la actividad CbE entre las distintas especies
que se utilizan en la práctica.
• Conocimiento de la función fisiológica de las CbEs y su papel en el mecanismo
de resistencia de las plagas a ciertos plaguicidas.
3.- MARCO TEÓRICO
En mamíferos, existe un grupo de CbEs que son inhibidas por insecticidas
organofosforados, carbamatos (Fig. 6) a este grupo de CbEs se les ha dado un
papel de detoxificación de estos plaguicidas tal y como ocurre con las
colinesterasas plasmáticas, es decir, actuando como ‘sustrato suicidas’ puesto que
la inhibición es el caso de los insecticidas organofosforados es irreversible (Fig.
6B).

14. Fundamento de la Operación
Se evaluará la actividad de las carboxiesterasas (CbE) en diversas especies,
obtenidas a través del plasma y se observará cuál de ellas presenta una mejor
actividad enzimática.
4.- MATERIALES Y MÉTODOS
4.1.- Materiales y Equipos
El material necesario para el correcto desarrollo de la práctica es el siguiente:
• Muestra de plasma de diferentes especies (aves, reptiles, peces).
• Tubo de vidrio (o plastico) de 10ml.
• Espectofotómetro UV-Vis.
• Cubeta de plástico.
• Micropipetas automáticas.
• Vasos de precipitados de 100-250 ml.
Reactivos:
• Tris.
• 1-nafil acetato.
• Ácido clorhídrico.
• Cloruro de calcio.
• Acetona.
• SDS.
• Tritón X-100.
• Fast Red ITR.
4.2.- Procedimiento

15. 4.2.1.- Preparación de las muestras de plasma.
• Las muestras de plasma se toman de diferentes organismos y se centrifugan a
10.000 rpm durante 10 minutos a 4º C. Se prepara el Sobrenadante (plasma) y se
deshecha el pellet o precipitado.
• Las muestras de plasma son diluidas en H2O destilada a una reacción de 1/20.
4.2.2.- Preparación de las soluciones o reactivos.
• Tampón Tris/HCI 25 mM/1 mM CaCl2, pH=7.6
Disolver 1.50 g de tris y 0.054 g de CaCl2 en 500 ml de agua destilada.
Ajustar a pH=7.6 con HCl. Tener cuidado con el pH porque la actividad CbE es pH
dependiente.
• SDS 2.5% (w/v).
Disolver 2.5g de SDS en 100 ml de agua destilada
• Tritón al 2.5% (w/v).
Disolver 2.5g de Tritón X-100 en 100 ml de agua destilada.
• Fast red ITR al 0.1% en Tritón 2.5% (w/v).
Disolver, en el momento de su uso 0.01 g de Fast red ITR en 10 ml de
Tritón X al 2.5% en agua. Proteger de la luz.
• 1-naftil acetato 3.46 mg /10 ml de acetona.
Disolver 3.46 mg de 1 naftil acetato en 10 ml de acetona y conservar el tuvo de
vidrio en hielo (se evita que se concentre el 1 naftil acetato por evaporación de la
acetona).
4.2.3.- Ensayo enzimático.
• Añadir 1 μL de suero diluido (agitar los eppendorf antes de tomarlos) en 1940 μL
de tampón Tris/HCI y agitar. Usar tubos de vidrio o plástico de 10 ml.
• Incubar la muestra durante 5 min a 25ºC (en baño de agitación).
Recordar hacer 2 blancos para tarar el espectrofotómetro.

16. • Añadir 50 μL de 1-naftin acetato y agitar los tubos.
• Dejar transcurrir la reacción enzimática durante 10 min a 25ºC.
• Retirar los tubos del baño de agitación y bloquear la reacción con la adición a
cada tubo de 0.5 ml de SDS 2.5%.Agitar.
• Añadir 0.5 ml de Fast Red ITR en tritón 2.5% y agitar los tubos.
• Dejar reposar durante 30 minutos en absoluta oscuridad.
• Leer Absorbancia total a una longitud de onda de 530 nm
5.- INDICACIONES
Tiempo estimado-- 4 horas

17. Relación con el programa teórico--Biomarcadores, resistencia a los plaguicidas,
evaluación del riego ecológico.
5.1.- Cálculo de la actividad CbE
La actividad CbE se calcula de la siguiente forma:
• Paso 1. Transformación de la variación de Abs/min a variación de concentración
milimolar por minuto por ello, se divide el valor de Abs /min por el coeficiente de
extinción molar del complejo que se forma entre el naftol y el Fast Red ITR, cuyo
valor es de 33,22 mM -1cm-1
• Paso 2. Considerar si la muestra diluida, es decir, el volumen final de la reacción
y el volumen de la muestra añadido a la cubeta , y si éste fue o no previamente
diluido.
• Paso 3. Convertir la actividad desde mM a μmol/ml. Teniendo en cuenta que
1mM = 1 mmol/L= 1μmol/ml, entonces el resultado es el siguiente
6.- REPORTAR
• La actividad CbE
*Cuestionario
• ¿Qué animal tolerara mejor los insecticidas piretroides, carbamatos y
organofosforados?
• ¿Qué diferencia hay entre un ensayo enzimático continuo y otro discontinuo?

18. 7. - BIBLIOGRAFÍA
1. Walter CH. 1998. In: Calow P. (ed), Handbook of Ecotoxicology, Blackwell
Science Ltd, Oxford, United Kingdom.
2. Sogorb M.A., Vilanova E. (2002). Enzymes ionvolved in the detoxification of
organophosphorus, carbamatos and pyrethroid insecticides through hydrylysis,,
Toxicol, Lett., 128:215-228.
3. Jokanovic M. (2001). Biotransformation of organophosphorus Compounds.
Toxicology, 166:139-160.
4. Satoh T., Hosokawa M. (1998). The mammalian carboxylesterases: from
molecules to functions, Annu, Rev Pharmacol. Toxicol., 38: 257-288
5. Sanchez-Hernàndez J.C. (2001). Wildlife exposure to organophosphorus
insectidcides.
6. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 172:21-63.

19. LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA AMBIENTAL
PRÁCTICA No. 3
UTILIZACIÓN DEL ENSAYO DE REPULSIÓN A UN SUELO CONTAMINADO
CON LA LOMBRIZ DE TIERRA Eisenia fetida.
1.- INTRODUCCIÓN.
• Las lombrices de tierra evitan el suelo contaminado gracias a la existencia de
quimiorreceptores en el prostomio (fig. 1). Algunos estudios experimentales han
puesto de manifiesto que esta capacidad de repulsión de las lombrices pueden
utilizarse como un índice de contaminación del suelo. De hecho, el protocolo de
ejecución de tal ensayo toxicológico esta en el proceso de estandarización.
2.- OBJETIVO.
• Aprendizaje de la ejecución del ensayo de repulsión con la lombriz de tierra.
• Comparar si existen diferencias entre la respuesta de repulsión de la lombriz al
Cu y al Hg.
• Significado eco toxicológico del ensayo de toxicidad.

20. 3.- MARCO TEÓRICO.
El ensayo de toxicidad consiste en colocar la lombriz entre dos suelos (uno de
referencia y el otro contaminado) y permitir, durante 48 horas, que la lombriz “elija”
el suelo. A la hora de llevar a cabo este sencillo ensayo, se han utilizado diversos
diseños experimentales, desde dispositivos de 6 cámaras interconectadas y
albergando 6 tipos de suelos hasta un diseño más sencillo que emplea dos
cámaras con dos suelos conectados entre si. Este ultimo diseño se empleara en la
practica (fig. 2).
Fundamentos de la Operación
La comprobación de la existencia de quimiorreceptores que presenta la lombriz de
tierra, para evitar áreas contaminadas por un metal pesado.
4.- MATERIALES Y MÉTODOS
4.1.- Materiales y Equipos
• Muestras de suelo no contaminado
• Placas de petri de 20cm de diámetro
• Espátulas de plástico desechables
• Balanza
• Papel de aluminio
• Estándares de Hg. (HgCl2) y Cu (cUSO4)
• Vasos de precipitado

21. • Pipetas de plástico o vidrio
• Un trozo de radiografía (separador)
4.2.- Procedimiento
4.2.1 Preparación del suelo
• El suelo será tamizado a un tamaño de partícula < 5 Mm. para evitar particular
gruesas que puedan dañar el tegumento de la lombriz.
• El suelo se dividirá en tantas fracciones como concentraciones de Hg y Cu se
quiera ensayar. Así, para realizar el ensayo de repulsión utilizando 5
concentraciones de Cu y 5 concentraciones de Hg, necesitaremos dividir la
muestra desuelo en 12 fracciones considerando 2 submuestras para los controles
de cada metal pesado.
• Las concentraciones de Cu y Hg a ensayar serán las siguientes: 5, 50, 100, 150,
200 ug/g peso seco. Una vez calculada las diluciones y preparados las soluciones
de cada metal se procederá a contaminar los suelos según el peso del suelo y la
concentración deseada.
• Los suelos contaminados se colocaran en bolsas de plástico herméticamente
cerradas y se procederá a su homogenizado. Se añadirá un volumen de agua tal
que la humedad del mismo este entre el 30-40% en relación a su peso (considerar
el volumen de solución acuosa conteniendo el metal pesado).
• Las submuestras de suelos tendrán un peso húmedo de 200 g y ocuparan la
mitad de la placa de petri y tal como se muestra en la foto 1
4.2.2 Liberación de las lombrices en las placas.
• Se liberaran 6 lombrices por placa. Colocándolas en la mitad de la mitad de la
placa donde los suelos toman contacto entre ellos.

22. • Las placas se colocaran en oscuridad y a la temperatura del laboratorio.
Colocando un ligero peso sobre las tapas de las placas para evitar que las
lombrices se escapen.
• En este punto se dará por iniciado en ensayo de toxicidad aguda (24 h)

24. 5. INDICACIONES.
• Para estimar la toxicidad del Cu o Hg en los suelos, debemos proceder como
sigue:
• Finalizado el ensayo (24 h después), se coloca el separador en la placa
permitiendo nuevamente separar los dos tipos de suelos (el contaminado y el
control)
• Se cuentan las lombrices en cada suelo, en el caso de cortar una lombriz cuando
se coloca el separador, este contabilizara como 0.5 para cada suelo.
• Calcular el porcentaje de lombrices en cada tipo de suelo y placa.
Realizar un grafico tal y como se muestra en la fig. 3
• El suelo se considera toxico cuando el porcentaje de lombrices en el suelo
contaminado sea inferior o igual al 20%. En la fig. 3 se muestra este umbral con la
línea horizontal en el 80%

25. 6.- REPORTAR.
*Cuestionario:
• ¿Qué metal resulta más tóxico a la lombriz?
• ¿Cuál, o cuales, seria la vía de entrada del metal a la lombriz de tierra?
• ¿Qué parámetros fisicoquímicos del suelo afectarían la biodisponibilidad y
toxicidad de los metales a la lombriz?
• ¿Qué significado ecotoxicológico y ecológico tendría la conducta de repulsión de
la lombriz en el suelo?
7.- BIBLIOGRAFÍA
1 Lourerio S, Soares AMVM, Noriega AJA (2005). Terrestrial avoidance behaviour
tests as escreening tool to assess soil contamination. Environ Pollut 138:121-131.
2 Lukkari T, Haimi J (2005). Avoidance of Cu-and Zn- contaminated soil by
ecologically different earthworm species. Ecotoxicol envirom saf 62:35-41
3 ISO (2004). Draft:soil Quality- avoidance test for evaluating the quality of soils
and the toxicity of chemicals. Test wih earthworm’s biomarkers riks assessment:
current status and perspective. Reviews of environmental contamination and
toxicology (en prensa).

26. LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA AMBIENTAL
PRÁCTICA No. 4
BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN A METALES PESADOS: ACTIVIDAD
GLUTATIÓN-S-TRANSFERASA.
1.- INTRODUCCIÓN.
Las glutatión-S-transferasas (GST, EC 2.5.1.18) son una superfamilia polimorfita
de enzimas multifuncionales. Estas enzimas son cruciales en la regulación de la
susceptibilidad a enfermedades como el cáncer, gracias a su habilidad para
inmovilizar metabolitos con capacidad cancerígena.
2.- OBJETIVO.
Los objetivos de la práctica son los siguientes:
• Aprendizaje del ensayo enzimático de la GST según el método de Habig et al.
(1974)
• Estudiar el efecto de la exposición a Hg (HgCl2) sobre la actividad GST de la
lombriz de tierra Eisenia fétida.
• Comparar los niveles de GST en las porciones anterior, media y posterior de la
lombriz E. fétida.
3.- MARCO TEÓRICO
Desde el punto de vista de la ecotoxicología las GST participan en el proceso de
biotransformación conjugando metabolitos electrofílicos con el glutatión
(tripéptido), o en la inmovilización de los metales pesados (Fig. 3).

27. Como biomarcador, su respuesta es variable dependiendo de la especie, del
contaminante y de las condiciones ambientales de la exposición a la sustancia
contaminante, entre otros factores generalmente, la inducción de este enzima es
la repuesta biológica considerada biomarcador de exposición a contaminantes.
Las GST son particularmente abundantes en el hígado y otros tejidos con un
elevado metabolismo, aunque también se detectan en la sangre. Además de este
papel en los procesos de destoxificación de sustancias contaminantes. Las GST
juegan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis oxidativa,
funcionando como un mecanismo de defensa antioxidante (fig. 1)

28. Fundamentos de la Operación
Observar el efecto a la exposición al mercurio a diferentes concentraciones sobre
la actividad de la Glutatión-S-transferasa de la lombriz de tierra, para lo cual, se
extraerá de tres secciones de su organismo (anterior, media y posterior) y
comparar su nivel de Glutatión.S-transferasa en cada uno.
4.- MATERIALES Y MÉTODOS
4.1.- Materiales y Equipos
El material necesario para el correcto desarrollo de la práctica es el siguiente:
• Muestras de suelo no contaminado
• Vasos de precipitado de 1L de capacidad
• Espátulas de plástico desechables

29. • Balanza
• Papel de aluminio
• Parafilm
• Estándares de Hg (HgCl2).
• Pipetas automáticas y de vidrio
• Tubos de plástico o vidrio
• Reactivos para la relación del ensayo enzimático
• Nitrógeno liquido
• Material de disección
• Espectrofotómetro UV-Vis
• Cubetas de plástico
4.2.- Procedimiento
Protocolo de exposición al Hg
• Contaminar 5 muestras de suelo con 5 concentraciones de Hg. Las
concentraciones de Hg serán las siguientes 50, 100, 200, 400, 1600 μg/g peso
seco. Considerar un suelo control no contaminado.
• Homogeneizar los suelos contaminados con la ayuda de una bolsa de plástico
cerrada herméticamente.
• Colocar cada muestra de suelo contaminado en un vaso de precipitado de 1L de
capacidad.
• Liberar 6 lombrices de tierra en cada vaso de precipitado.
• Tapar los vasos con parafilm permitiendo el intercambio de aire con
perforaciones del papel.
• Colocar los vasos en oscuridad y a la temperatura del laboratorio.

30. Preparación de las muestras.
• Una vez finalizado de la fase de exposición de las lombrices al Hg (2-3 días), se
procederá al aislamiento de las GST y su medida.
• Las lombrices se extraerán de cada suelo y se colocaran en placas de petri
conteniendo un trozo de papel humedecido con agua destilada (Foto 2).

31. • Permanecerán 24 h en oscuridad para su depuración.
• Finalizada la fase de depuración. Las lombrices serán cortadas en 3 porciones
(anterior, media y posterior) rápidamente congeladas en nitrógeno liquido.
• Cada submuestra de lombriz será pesada y homogeneizada en un volumen de
tampón (1:4 p/v) con la ayuda de un homogeneizador Ultra- Turrax.
• El homogenado será centrifugado a la 18.000 X g durante 20 minutos y a 4ºC.
• La GST se medirá en el sobrenadante.
4.3 Preparación de las soluciones para el ensayo enzimático.
1. Tampón de homogenización: Tris/HCl 100 mM / 0.1 mM PMSF,
pH= 7.6.
• Disolver 3.028 g de Tri, 0,093 g de EDTA-K2 y 21.39 g de sacarosa en 250 ml de
agua destilada.
• Ajustar a pH = 7.6 con HCl.
2. Tampón de reacción fosfato potásico 100 mM, pH = 6.5
• Disolver 3.97 g de KH2PO4 en 250 ml de agua destilada y llevar a pH = 6.5.
3. PMSF 0.5 M en dimetilsufoxido (DMSO):
• Disolver 0.087 g de PMSF en 1 ml de DMSO. Añadir 50 μL de la solución en
250 ml de tampón (factor de dilución 1/5000).
4. Glutatión reducido (GSH) 100 mM.
• Disolver 0.061 g de GSH en 2 ml de tampón fosfato pH = 6.5
5. 1-cloro, 3,4-dinitrobenceno (CDNB) 50 mM.
• Disolver 0.02 g de CDNB en 2 ml de etanol absoluto
4.4 Ensayo enzimático.
Las reacciones que tienen lugar en la cubeta se muestran en la figura 1, las
concentraciones de GSH y CDNB en el medio de incubación han de ser 5 mM y 1
mM, respectivamente. Al añadir 50 μl GSH (50mM) y 20 μl de CDNB (50 mM) a

32. un volumen final de 1 ml (medio de reacción), se consiguen esas concentraciones
finales.
• Agitar los reactivos con la ayuda de un trozo de parafilm (el volumen final en la
cubeta es de 1 ml)
• Añadir 50 μl del homogenado de lombriz y agitar nuevamente.
• Leer cinética a una longitud de onda de 340 nm.

33. 5. INDICACIONES
4.5 Calculo de la actividad GST.
1. transformación de la variación de Abs/min. A variación de concentración
milimolar por minuto. Para ello, se divide el valor de Abs/min. Cuyo valor es de 9,6
mM-1 cm-1.

34. ΔA (min. X cm) ÷ε (mM-1 x cm-1) = Δ mM/min.
2. considerar si la muestra fue diluida, es decir, volumen final de la reacción (1 ml)
y el volumen de la muestra añadido a la cubeta (0.05), y si este fue o no
previamente diluido.
3. convertir la actividad desde mM a μmo1/ml. Teniendo en cuenta que 1mM =
mmo1/L = 1μmo1/ml, entonces el resultado es el siguiente:
Δ mM/min. = μmol/ml/min
4. Normalizar la actividad de la GST a peso de tejido utilizado. Para ello se divide
entre el peso de lombriz por cada ml de homogenado (relación 1:4 en el proceso
de homogeneización).
μmol/ml/min ÷ g/ml = μmol/min/g de tejido
6.- REPORTAR.
*Cuestionario:
¿Qué efecto produjo el Hg en la actividad GST de la lombriz?
¿Cuál sería la función de la actividad GST en relación al Hg?
¿Qué significa para lombriz tener una actividad GST elevada?
7.- BIBLIOGRAFÍA
1 Wang W., Ballatori N (1998). Endogenus glutathione conjugates:
ocurrente and bilogical funtions. Pharmacological reviews. 50:335-353.