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Organización de la Cromatina y la Estructura del Nucleosoma

        IV Curso de Postgrado en Biología Vegetal:
       REGULACIÓN EPIGENÉTICA EN PLANTAS
             Facultad de Ciencias Forestales
               Universidad de Concepción

                            Junio de 2012

                         Martín Montecino L. Ph.D.
                    Centro de Investigaciones Biomédicas
              Centro FONDAP para la Regulación del Genoma
            Facultad de Ciencias Biológicas-Facultad de Medicina
                        Universidad de Andrés Bello
Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
X



    Aspectos a analizar:


    1.-Proteínas o complejos proteicos con actividad
    remodeladora de cromatina dependiente de energía

    2.-Modificaciones covalentes de proteínas que
    constituyen y organizan la cromatina

    3.-Modificación covalente de DNA (metilación)
Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
Lewin, B., Genes, 2000
Lewin, B., Genes, 2000
Lewin, B., Genes, 2000
X



    Aspectos a analizar:


    1.-Proteínas o complejos proteicos con actividad
    remodeladora de cromatina dependiente de energía

    2.-Modificaciones covalentes de proteínas que
    constituyen y organizan la cromatina
Complejo
                           Remodelador
                          SWI/SNF + ATP
 150 pb




¿Como se produce esta alteración en la estructura del nucleosoma?
hSWI/SNF
150 pb




         Langst y Becker, Biochem. Biophys. Acta, 1677, 58,63, 2004
         Becker y Horz, Ann. Rev. Biochem. 71, 247-73, 2002
hSWI/SNF

230 pb




         Langst y Becker, Biochem. Biophys. Acta, 1677, 58,63, 2004
         Becker y Horz, Ann. Rev. Biochem. 71, 247-73, 2002
“Nucleosome Eviction”
                                                        DNA aceptor




         hSWI/SNF
150 pb




           Gutiérrez et al. EMBO J. 2007
           Workman, J. Genes Dev. 20, 2009-2017, 2006
¿Como se produce el reconocimiento de una secuencia en particular
            por parte de un complejo remodelador?
¿SWI/SNF?




¿SWI/SNF?
¿FT?




¿FT?
Asociación funcional de SWI/SNF con:

-La maquinaria transcripcional básica (RNA pol II Holoenzyme)
-Con factores de transcripción específicos
Osteoblast differentiation Ex Vivo




Osteoprogenitor              Osteoblast              Osteocyte




   Proliferation               ECM                 Mineralization
                             Maturation

Collagen I               Alkaline                  Osteopontin
                         phosphatase
P21WAF/CIP1                                        Osteocalcin

RUNX2

Ric-8B

Osterix
Gutierrez et al. Biochemistry, 2000
Gutierrez et al. J. Biol. Chem. 2002
Sierra et al. Mol. Cell. Biol. 2003
Paredes et al. Mol. Cell. Biol. 2004
Villagra et al. J. Biol. Chem. 2006
Gutierrez et al. J. Biol. Chem. 2007
Montecino et al. Biochem. Cell Biol. 2007
Osteoblast differentiation Ex Vivo




Osteoprogenitor              Osteoblast              Osteocyte




   Proliferation               ECM                 Mineralization
                             Maturation

Collagen I               Alkaline                  Osteopontin
                         phosphatase
P21WAF/CIP1                                        Osteocalcin

RUNX2

Ric-8B

Osterix
Working model
Working model




         X
Working model




         X
Osteoblast differentiation Ex Vivo




Osteoprogenitor              Osteoblast              Osteocyte




   Proliferation               ECM                 Mineralization
                             Maturation

Collagen I               Alkaline                  Osteopontin
                         phosphatase
P21WAF/CIP1                                        Osteocalcin

RUNX2

Ric-8B

Osterix
Osteoblast differentiation Ex Vivo




Osteoprogenitor              Osteoblast              Osteocyte




   Proliferation               ECM                 Mineralization
                             Maturation

Collagen I               Alkaline                  Osteopontin
                         phosphatase
P21WAF/CIP1                                   + Osteocalcin

RUNX2

Ric-8B
                          C/EBPβ
Osterix
                          +SWI/SNF
Osteoblast differentiation Ex Vivo




Osteoprogenitor              Osteoblast              Osteocyte




   Proliferation               ECM                 Mineralization
                             Maturation

Collagen I               Alkaline                  Osteopontin
                         phosphatase
P21WAF/CIP1                                   + Osteocalcin

RUNX2

Ric-8B
          -
                          C/EBPβ
Osterix
                          +SWI/SNF
¿Cómo demostrar que estos reguladores están efectivamente asociados a genes?
Schones y Zhao, Nature Rev., 9: 179-190, 2008
“Direct deep sequencing”




Schones y Zhao, Nature Rev., 9: 179-190, 2008
X



    Aspectos a analizar:


    1.-Proteínas o complejos proteicos con actividad
    remodeladora de cromatina dependiente de energía

    2.-Modificaciones covalentes de proteínas que
    constituyen y organizan la cromatina
Acetilación de histonas del core nucleosomal (H3 y H4):

-Disminuye afinidad de histona H1 por nucleosomas
-Disminuye interacciones entre nucleosomas
-Facilita unión de factores de transcripción por secuencias nucleosomales
-Aumenta afinidad de complejos con actividad remodeladora de cromatina
Lewin, B., Genes, 2000
Modificación covalente de histonas




       Lewin, B., Genes, 2000
Kouzarides, T. (2007) Cell 128, 693-705
HDACs:

-Clase I: HDAC 1, 2, 3 y 8 (homólogas de yRpd3)

-Clase II: HDAC 4, 5, 6, 7, 9 y 10 (homólogas de yHda1)

-Clase III: Sirt 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 (relacionadas a ySir2)

-Clase IV: HDAC11
Narlikar y col. Cell 108, 475-487, 2002
Osteoblast differentiation Ex Vivo




Osteoprogenitor              Osteoblast              Osteocyte




   Proliferation               ECM                 Mineralization
                             Maturation

Collagen I               Alkaline                  Osteopontin
                         phosphatase
P21WAF/CIP1                                        Osteocalcin

RUNX2

Ric-8B

Osterix
Transcriptional activation of RUNX2 gene involves chromatin remodeling




                             C/EBPβ + HATs




                               HATs
                           C/EBPβ



                    Increased
                Histone acetylation




                        DHS region
                                                     Cruzat et al. Biochemistry, 2009
                                                     Henriquez et al. J. Cell. Physiol., 2011
                                                     Henriquez et al. Manuscript in preparation
Metilación de histonas
Bannister y col., Cell, 109, 801-806, 2002
Metilación de histonas:

-Metilación de histona H3 en K9 favorece compactación cromatínica
-Metilación de histona H3 en K4 favorece actividad transcripcional
-Patrones de metilación de histonas acompañan la actividad transcripcional de genes eucariontes
Kouzarides, T. (2007) Cell 128, 693-705
Li et al. (2007) Cell, 128, 707-719
Osteoprogenitor       Osteoblast    Osteocyte




  Proliferation        ECM         Mineralization
                     Maturation

Collagen I        Alkaline         Osteopontin
                  Phosphatase
P21WAF/CIP1                        Osteocalcin
                  RUNX2
RUNX2                              RUNX2
Promotor gen RUNX2/p57




   -ChIP + QPCR
Células que no
expresan Runx2/p57




Células osteoblásticas
que expresan Runx2/p57
¿Cómo se lee o interpreta este código?
Kouzarides, T. (2007) Cell 128, 693-705
Nat. Struct. Mol. Biol. 14, nº 11, 2007.
Latham y Dent, Nature Struct. Mol. Biol., 2007.
Lan et al. (2008) Curr. Opin. Cell Biol.
Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
Probst et al. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2009
Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
¿Organización de la maquinaria transcripcional en el contexto nuclear?




                 Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
¿Organización de la maquinaria transcripcional en el contexto nuclear?

¿Contribución del RNA no-codificante (LncRNAs)?




                 Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
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Organización de la cromatina y estructura nucleosoma

  • 1. Organización de la Cromatina y la Estructura del Nucleosoma IV Curso de Postgrado en Biología Vegetal: REGULACIÓN EPIGENÉTICA EN PLANTAS Facultad de Ciencias Forestales Universidad de Concepción Junio de 2012 Martín Montecino L. Ph.D. Centro de Investigaciones Biomédicas Centro FONDAP para la Regulación del Genoma Facultad de Ciencias Biológicas-Facultad de Medicina Universidad de Andrés Bello
  • 2. Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
  • 3. X Aspectos a analizar: 1.-Proteínas o complejos proteicos con actividad remodeladora de cromatina dependiente de energía 2.-Modificaciones covalentes de proteínas que constituyen y organizan la cromatina 3.-Modificación covalente de DNA (metilación)
  • 4. Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
  • 8. X Aspectos a analizar: 1.-Proteínas o complejos proteicos con actividad remodeladora de cromatina dependiente de energía 2.-Modificaciones covalentes de proteínas que constituyen y organizan la cromatina
  • 9.
  • 10. Complejo Remodelador SWI/SNF + ATP 150 pb ¿Como se produce esta alteración en la estructura del nucleosoma?
  • 11. hSWI/SNF 150 pb Langst y Becker, Biochem. Biophys. Acta, 1677, 58,63, 2004 Becker y Horz, Ann. Rev. Biochem. 71, 247-73, 2002
  • 12. hSWI/SNF 230 pb Langst y Becker, Biochem. Biophys. Acta, 1677, 58,63, 2004 Becker y Horz, Ann. Rev. Biochem. 71, 247-73, 2002
  • 13. “Nucleosome Eviction” DNA aceptor hSWI/SNF 150 pb Gutiérrez et al. EMBO J. 2007 Workman, J. Genes Dev. 20, 2009-2017, 2006
  • 14. ¿Como se produce el reconocimiento de una secuencia en particular por parte de un complejo remodelador?
  • 17. Asociación funcional de SWI/SNF con: -La maquinaria transcripcional básica (RNA pol II Holoenzyme) -Con factores de transcripción específicos
  • 18. Osteoblast differentiation Ex Vivo Osteoprogenitor Osteoblast Osteocyte Proliferation ECM Mineralization Maturation Collagen I Alkaline Osteopontin phosphatase P21WAF/CIP1 Osteocalcin RUNX2 Ric-8B Osterix
  • 19. Gutierrez et al. Biochemistry, 2000 Gutierrez et al. J. Biol. Chem. 2002 Sierra et al. Mol. Cell. Biol. 2003 Paredes et al. Mol. Cell. Biol. 2004 Villagra et al. J. Biol. Chem. 2006 Gutierrez et al. J. Biol. Chem. 2007 Montecino et al. Biochem. Cell Biol. 2007
  • 20. Osteoblast differentiation Ex Vivo Osteoprogenitor Osteoblast Osteocyte Proliferation ECM Mineralization Maturation Collagen I Alkaline Osteopontin phosphatase P21WAF/CIP1 Osteocalcin RUNX2 Ric-8B Osterix
  • 24. Osteoblast differentiation Ex Vivo Osteoprogenitor Osteoblast Osteocyte Proliferation ECM Mineralization Maturation Collagen I Alkaline Osteopontin phosphatase P21WAF/CIP1 Osteocalcin RUNX2 Ric-8B Osterix
  • 25. Osteoblast differentiation Ex Vivo Osteoprogenitor Osteoblast Osteocyte Proliferation ECM Mineralization Maturation Collagen I Alkaline Osteopontin phosphatase P21WAF/CIP1 + Osteocalcin RUNX2 Ric-8B C/EBPβ Osterix +SWI/SNF
  • 26. Osteoblast differentiation Ex Vivo Osteoprogenitor Osteoblast Osteocyte Proliferation ECM Mineralization Maturation Collagen I Alkaline Osteopontin phosphatase P21WAF/CIP1 + Osteocalcin RUNX2 Ric-8B - C/EBPβ Osterix +SWI/SNF
  • 27. ¿Cómo demostrar que estos reguladores están efectivamente asociados a genes?
  • 28. Schones y Zhao, Nature Rev., 9: 179-190, 2008
  • 29. “Direct deep sequencing” Schones y Zhao, Nature Rev., 9: 179-190, 2008
  • 30. X Aspectos a analizar: 1.-Proteínas o complejos proteicos con actividad remodeladora de cromatina dependiente de energía 2.-Modificaciones covalentes de proteínas que constituyen y organizan la cromatina
  • 31. Acetilación de histonas del core nucleosomal (H3 y H4): -Disminuye afinidad de histona H1 por nucleosomas -Disminuye interacciones entre nucleosomas -Facilita unión de factores de transcripción por secuencias nucleosomales -Aumenta afinidad de complejos con actividad remodeladora de cromatina
  • 33. Modificación covalente de histonas Lewin, B., Genes, 2000
  • 34. Kouzarides, T. (2007) Cell 128, 693-705
  • 35. HDACs: -Clase I: HDAC 1, 2, 3 y 8 (homólogas de yRpd3) -Clase II: HDAC 4, 5, 6, 7, 9 y 10 (homólogas de yHda1) -Clase III: Sirt 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 (relacionadas a ySir2) -Clase IV: HDAC11
  • 36. Narlikar y col. Cell 108, 475-487, 2002
  • 37. Osteoblast differentiation Ex Vivo Osteoprogenitor Osteoblast Osteocyte Proliferation ECM Mineralization Maturation Collagen I Alkaline Osteopontin phosphatase P21WAF/CIP1 Osteocalcin RUNX2 Ric-8B Osterix
  • 38. Transcriptional activation of RUNX2 gene involves chromatin remodeling C/EBPβ + HATs HATs C/EBPβ Increased Histone acetylation DHS region Cruzat et al. Biochemistry, 2009 Henriquez et al. J. Cell. Physiol., 2011 Henriquez et al. Manuscript in preparation
  • 40. Bannister y col., Cell, 109, 801-806, 2002
  • 41. Metilación de histonas: -Metilación de histona H3 en K9 favorece compactación cromatínica -Metilación de histona H3 en K4 favorece actividad transcripcional -Patrones de metilación de histonas acompañan la actividad transcripcional de genes eucariontes
  • 42. Kouzarides, T. (2007) Cell 128, 693-705
  • 43. Li et al. (2007) Cell, 128, 707-719
  • 44. Osteoprogenitor Osteoblast Osteocyte Proliferation ECM Mineralization Maturation Collagen I Alkaline Osteopontin Phosphatase P21WAF/CIP1 Osteocalcin RUNX2 RUNX2 RUNX2
  • 45. Promotor gen RUNX2/p57 -ChIP + QPCR
  • 46. Células que no expresan Runx2/p57 Células osteoblásticas que expresan Runx2/p57
  • 47. ¿Cómo se lee o interpreta este código?
  • 48. Kouzarides, T. (2007) Cell 128, 693-705
  • 49. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, nº 11, 2007.
  • 50. Latham y Dent, Nature Struct. Mol. Biol., 2007.
  • 51. Lan et al. (2008) Curr. Opin. Cell Biol.
  • 52. Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
  • 53. Probst et al. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2009
  • 54. Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
  • 55. ¿Organización de la maquinaria transcripcional en el contexto nuclear? Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
  • 56. ¿Organización de la maquinaria transcripcional en el contexto nuclear? ¿Contribución del RNA no-codificante (LncRNAs)? Stein et al. Trends Cell. Biol. 13, 584-592, 2003
  • 57. FIN