Este documento describe el uso de Drosophila melanogaster como modelo para estudiar enfermedades neurológicas. Drosophila ofrece ventajas como su rápido ciclo de vida, bajo costo y versatilidad experimental. El documento discute cómo se pueden usar técnicas como Gal4/UAS, RNAi y mutagénesis para alterar los niveles de genes en Drosophila y estudiar su papel en procesos como la neurodegeneración y el estrés oxidativo. Finalmente, se presentan los resultados de un estudio metabolómico mediante RMN que encontró diferencias
Modelos de enfermedades neurológicas en Drosophila
1. Modelos de enfermedades neurológicas
en Drosophila melanogaster
1 de octubre 2019
Máximo Ibo Galindo Orozco
igalindo@cipf.es
2. ¿Por qué Drosophila?
Ventajas prácticas: rápido, barato, ocupa poco espacio
Relevancia: gran nivel de similitud a otros animales
Capacidad experimental: técnicas y recursos
4. Drosophila como modelo en biomedicina.
E. coli Levadura Nemátodo Mosca Mamíferos
Genes 4000 6000 19000 15000 30000
Genoma (Mb) 4.6 150 300010012
Neuronas 0 0 302 105 1011
Drosophila es un animal con una cierta complejidad biológica, y muchos procesos
celulares y moleculares son comparables a sus equivalentes vertebrados.
Drosophila aporta versatilidad experimental
5.
6.
7. El 70% de genes responsables de una enfermedad hereditaria en
humanos tiene un ortólogo en Drosophila
http://flydiseasemodels.blogspot.com
9. Premio Nobel de Medicina en 1946
Herman Joseph Muller “por su descubrimiento de que los rayos X pueden causar mutaciones”.
Premio Nobel de Medicina en 1995
Christiane Nusslein-Volhardt, Eric Wieschauss y Ed Lewis. “por sus estudios sobre el control genético
del desarrollo embrionario temprano”.
Premio Nobel de Medicina 2011
Bruce A. Beutler y Jules A. Hoffmann (sistema inmunitario innato) y Ralph M. Steinman
“descubrimiento de la célula dendrítica y su papel en la inmunidad adaptativa”
Premio Nobel de Medicina en 1933
Thomas Hunt Morgan “por sus descubrimientos en el papel de los cromosomas en la herencia biológica”.
Premio Nobel de Medicina 2017
Jeffrey C. Hall, Michael Rosbash y Michael W. Young "descubrimientos de los mecanismos
moleculares que controlan el ritmo circadiano"
10. Cromosomas equilibradores
- Al menos un alelo letal recesivo
- Múltiples inversiones (para evitar la recombinación)
- Marcadores fenotípicos dominantes
FM7a, y scw v B
CyO, Cy dp pr cn
SM6, al Cy dp cn sp
Tm3, ri p sep bx Sb e
TM6B, Hu Tb e
11. L1
CyO
L2
Gla Bc
x
L1
L2
L1
Gla Bc
L2
CyO
Gla Bc
CyO
L1
+
L2
+
L1
L2
L1
+
L2
+
+
+
x L1 y L2 son letales en homozigosis
Todos los genotipos resultantes están
marcados. Podemos saber si el
heterozigoto L1/L2 está presente o no
12. El elemento P es un transposón natural de Drosophila
3 kb
4 exones, codifica para la transposasa
2 repeticiones invertidas 31 pb
La transposasa se une a las repeticiones invertidas y promueve la
transposición a otro locus cromosómico
El elemento P como vector de transformación
13. Elemento P autónomo
Elemento P no autónomo: puede saltar pero carece de transposasa
Elemento P “helper”, puede producir transposasa, pero no saltar
white
15. Es un proceso barato
Es rápido: 2 generaciones para seleccionar transformantes,
2 generaciones para hacer una cepa estable
Alta eficiencia: 10 al 20% de individuos inyectados producen
progenie transformada
Acepta tamaños de hasta 15 kb
16. Glass
GMR Glass
El gen Glass se expresa exclusívamente en el ojo
El sistema GAL4-UAS para expresión dirigida
GMR GDAP1 GDAP1
Puedo expresar mi gen de interés en el ojo
17. GMR GAL4
UAS GDAP1
GMR GAL4
UAS GDAP1
X
Gal4
El sistema binario Gal4-UAS
UAS
GMR UAS GDAP1Gal4
X
Gal4 es un factor de transcripción de
Saccharomyces cerevisiae
Glass es un gen de Drosophila que
se expresa en el ojo GMR Glass
19. Estudios de ciclo celular con Fly-FUCCI
Utilizamos un driver que funciona sólamente en la parte posterior de cada segmento,
engrailed-Gal4 (en-Gal4; UAS-RedStinger).
Podemos estudiar el ciclo celular de las células de los discos imaginales de ala de los
diferentes genotipos con la cepa Fly-FUCCI
P
Promotor
de
engrailed
A
Engrailed
en
Promotor
de
engrailed
CRUCES CON en-Gal4
UAS-ECFP-E2F, UAS-Venus-CycB UAS-RNAiCG9548
;
en-Gal4, UAS-RedStinger (DsRed) +
20. Efectos sobre la división celular
▷ Pladienolide B 1µM: parada general en fase G1, expresión de CycB casi inexistente
21. repo-Gal4: glia
UAS-hCD4-GFP: gfp membrana plasmática
UAS-dp110CAAX: PI3K*
UAS-dEGFRλ: EGFR*
UAS-RNAi: RNAi contra candidatos
Tub-Gal80ts: Represor Gal4, termosensible
Chi, KC., Tsai, WC., Wu, CL. et al. Mol
Neurobiol (2019) 56: 4589.
https://doi.org/10.1007/s12035-018-1392-2
Un modelo de gioblastoma en moscas adultas
22. Clones de ADN (más de 1.000.000)
Vectores de transformación
cDNAs
CuraGen yeast two-hybrid collection.
Líneas celulares (136 líneas)
Cepas de Drosophila (44.904 cepas)
Mutantes
Gal4/UAS
GFP, RFP etc.
Aberraciones cromosómicas (deleciones, duplicaciones, traslocaciones, etc.)
Cepas control (wild types, cromosomas equilibradores)
FRT/FLP (clones)
RNAi
29. Genomic locus 13.9 Kb (6 exons) 8q21.1
358 aa (42 KDa)
Glutathion-S-transferase family
GST-N GST-C TM TM
1 2 3 4 5
TAGATG
I II III IV V VI
GDAP1 es una proteína mitocondrial
GDAP1 Mitotracker
Pedrola et al. 2005, 2008
30. Wagner, K.M, et al. PLoS One 2009, 4(4):e5160.
GDAP1 promotes mitochondrial fission.
Axel Niemann et al. J Cell Biol 2005;170:1067-1078
31. Age
1 week
(young flies)
5 weeks
(old flies)
NEURODEGENERATION
Tissues
eye muscle
Genotypes
Normal expression Over-expression RNAi
32. GMR GAL4
UAS GDAP1
GMR GAL4
UAS GDAP1
X
Gal4
Binary Gal4-UAS system: expression, RNAi
UAS
GMR UAS GDAP1Gal4
X
Gal4 is a transcription factor from
Saccharomyces cerevisiae
GMR-Gal4, UAS-Gdap1: Knock-up
GMR-Gal4, UAS-RNAiGdap1: Knock-down
33. 800 ommatidia
7 neurons per omatidium
The Drosophila eye
4
2 1
3
5
6
7
N
N
N
N
N
N
N
m
m
m
m
m
41. 0
5
10
15
(AU)
***
*
0
5
10
15 **
*
FREE GSH LEVELS RATIO GSH/GSSG
0
50
100
150
REL.FLUO/PROT.CONTENT
*
***
GLUTATHIONYLATION
NITROSYLATION
0
1
2
3
4
(AU)
**
***
SOD2DCF
C O K C O K
C O K C O K
1 week 5 weeks
1 week 5 weeks
Alterations in oxidative stress
42. La alteración de los niveles de Gdap1 causa:
-Neurodegeneración
-Degeneración muscular
-Defectos en las sinapsis
-Defectos en tamaño, estructura y localización de las mitochondrias
-El estrés oxidativo está implicado, pero no es la causa primaria
43. ***
10 days 20 days 30 days
0
20
40
60
80
100
***
***
***
**
*
Motility
%
1 week 5 weeks
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Body Weight (per fly)
mg
*
Control Gdap1 KU Gdap1 KD
Survival (days)
%
A metabolomic study of Gdap1 alterations
Age
1 week 5 weeks
TissuesGenotypes
Control KU KD Whole fly (Act5-Gal4)
5 experimental replicates
30 individuals each
52. Pyruvate
Acetyl-CoA
TCA cycle
PDC PDP
PDK
Lipids
AKHR
CG6178
Glycogen
Glucose
Pyruvate
PyrK
Hex
G-6Pase
PEPCK
GlyS GlyP
LactateAlanine
ALT LDH
Insulin
signalling
Zorzano A, Hernandez-Alvarez MI, Sebastian D,
Munoz JP: Mitofusin 2 as a driver that controls
energy metabolism and insulin signaling.
Antioxid Redox Signal 2015
Schneeberger M, Dietrich MO, Sebastian D,
Imbernon M, Castano C, Garcia A, Esteban Y,
Gonzalez-Franquesa A, Rodriguez IC,
Bortolozzi A et al: Mitofusin 2 in POMC
neurons connects ER stress with leptin
resistance and energy imbalance. Cell 2013,
155(1):172-187
Hk1
PDK3
58. EL SÍNDROME DE DRAVET ES UNA EPILEPSIA INFANTIL, SUELE
DEBUTAR A LOS POCOS MESES DE EDAD
COMIENZA CON CRISIS CONVULSIVAS, CON LA EDAD PUEDE
PRODUCIR DETERIORO COGNITIVO Y CONDUCTUAL
ES MUY HETEROGÉNEO: CADA PACIENTE ES DISTINTO
NO HAY TRATAMIENTO ESPECÍFICO, SOLO PALIATIVO
Medicina Personalizada en Síndrome de Dravet
59. Missense mutations in SCN1A
500 distinct SCN1A mutations associated with Dravet syndrome and GEFS+
50% truncations (premature stop codon), 50% missense
65. Búsqueda de modificadores de susceptibilidad a crisis
epilépticas en un modelo de Síndrome de Dravet en
Drosophila melanogaster con la mutación parabss1
66. Selección genes candidatos
• Búsqueda en la literatura de genes humanos
de interés (21 candidatos)
1. Formación de circuitos en epilepsia primaria
2. Modificadores de SCN1A y SCN2A
3. Genes reguladores de la formación de circuitos y
redes
BLASTP CHRNB2
Homología de las proteínas en Drosophila
13 seleccionados
8 descartados
Pobre homología
Otro gen codifica la misma proteína
BLASTP SCN1B
67. i. Convulsión inicial. Dura varios segundos y se caracteriza por el temblor de la pierna, las contracciones de los músculos
abdominales, el aleteo y las extensiones de la probóscide.
ii. Período paralítico. Las moscas parabss1 son inmóviles y no responden a estímulos mecánicos.
iii. Fase ´´tónico-clónica``. A diferencia de otros mutantes BS, la parálisis inicial en parabss1 es seguida por un período
prolongado donde la mosca es principalmente inactiva, sufriendo intermitentemente salvas de sacudidas generalizadas.
iv. Crisis de recuperación. La mosca presenta de nuevo movimientos parecidos a la crisis inicial junto con pequeñas
sacudidas.
v. Se observa un período refractario en parabss1, durante el cual las moscas ya logran comportarse normalmente, pero no
se les puede inducir a tener más ataques por ningún estímulo externo.
vi. Finalmente, hay una recuperación completa y las moscas parabss1 recuperan la sensibilidad del golpe.
69. Crisis
0 100 200 300 400 500
bss1
para
ARNi
1nAChR
Tiempo de recuperación (s)
Gen mosca: nAChR 1 - Gen humano: CHRNB2
• Subunidad β2 del receptor colinérgico nicotínico
Crisis
0 100 200 300 400 500
bss1
para
ARNi
KNCQ
***
Tiempo de recuperación (s)
Gen mosca: KCNQ - Gen humano: KCNQ3
• Miembro 3 de la subfamilia KQT del canal de K+
dependiente de voltaje
70. Grabación en video (10 minutos) mediante el programa informático VirtualDub: 1 fotograma cada 0,5 segundos
Las imágenes son cargadas en el programa ImageJ: detección ROI (Stone et al., 2014)
71. ImageJ ofrece un fichero con las coordenadas de la mosca cada 0,5 segundos y una imagen con el recorrido total de
la mosca
Poca capacidad de exploración y su recorrido
es de poca distancia
Gran capacidad de exploración y recorrido
es de larga distancia
72. Síndrome de Dravet en un modelo de Drosophila:
- Generación de los modelos de medicina personalizada
- Búsqueda/validación de modificadores genéticos
- Cribado farmacológico (Alan Talevi, LIDeB, Universidad de la Plata)
- Nanopártículas de óxido de cerio (Víctor Puntes, ICN2, Barcelona)
- Magnetoterapia (Casto Rivadulla, U. Coruña; Juan Aguilar HNPT)