Ponencia presentada en el marco de las I Jornadas Científicas del Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (8-9 noviembre, 2010. Zaragoza)

1. I Jornadas Científicas IIS Aragón
Efecto de los fallos en el sistema OXPHOS sobre
la expresión génica y la diferenciación de células
ES
PIPAMER 09/05
Patricio Fernández Silva
Grupo GENOXPHOS
Dpto. Bioquímica y Biol. Molecular

2. GRUPO GENOXPHOS
Sistema OXPHOS
C. III
C. II
C. IV
Complex I
C. V

3. Mitocondria y patología

4. Modelos animales de enfermedades
mitocondriales
Estudio in vivo de las causas moleculares,
funcionales y estructurales.
Ensayos de terapia.

5. 1
mtDNA
2
Modelos animales de
enfermedades
mitocondriales
3

6. Mutagénesis del mtDNA
Mutagé
Mutagénesis Manipulació
Manipulación copias
Mutágeno (TMP) BrEt
48 horas Disminución a una copia
de mtDNA por célula
UV
Línea celular de ratón
Subclonaje
Análisis funcional en
Aná (una célula por pocillo)
microcultivo
DUPLICADO
Glucosa Galactosa
Caracterizació
Caracterización
Mutantes Se recogen los clones
Gal deficientes

7. Colección de mutantes aislados
COMPLEX GEN MUTATION PHENOTYPE
Complex I ND4 Non-Sense Knock-out
ND6 Frameshift Knock-out
ND6/ND5 Frameshift/NonSense Knock-out
ND6/ND1 Frameshift/Missense Knock-out/?
ND6 Frameshift Knock-out
Complex III Cyt b Missense Folding problem
Complex IV CO I Missense Less activity
CO I Missense Supressor
CO I Missense Less activity
Complex V A6 Missense Less activity
Prot. Synthesis tRNAIle Anticodon loop OXPHOS def

8. Generación células ES transmitocondriales
Enucleación y fusión
Enucleation
Cytoplasts
Fibroblasts
Fusion with R6G
mtDNA mutation
treated ES cells
Cytochalasin B
treatment and centrifugation

9. Generación de ratones transmitocondriales
Inyección en blastocistos
Enucleation
Fusion with
Fibroblasts Cytoplasts
mtDNA mutation R6G treated
ES cells
Injection
into
Reimplantation of C57BL/6J
embryos in blastocyst
pseudopregnant
C57BL/6J females

10. Análisis de células ES transmitocondriales
Identificación de clones ES
transmitocondriales (T6589C) mediante RFLP
Hha I
Transmitochondrial ES
Un C MT

11. Líneas ES transmitocondriales
Línea ES Línea celular Mutación Complejo afectado
transmitocondrial original
(C57BL6 XX)
ES-C57 C57BL6 WT --
ES-Balb/c Balb/c WT --
ES-NIH3T3 NIH3T3 WT --
ES-C3H C3H WT --
ES-NZB NZB WT --
ES-MB77 MB77 tRNA-Ile Complejo I, III y IV
ES-FC2C12 FC2C12 CO I (C6347T) C IV
ES-E9C E9C CO I (A6589T) C IV
ES-FHBc FHBc A6 (A8414G) CV

12. OBJETIVOS PROYECTO
En este proyecto se proponen dos objetivos:
A) analizar el efecto de las variantes no patológicas y las mutaciones
en el mtDNA sobre los patrones de expresión génica de células ES
B) analizar el efecto de las mutaciones en el mtDNA sobre la
capacidad de diferenciación de líneas ES a cardiomiocitos.

13. B) efecto de las mutaciones en el mtDNA sobre la capacidad de
diferenciación de líneas ES a cardiomiocitos.
1.- Transfección de células ES control 2.- Cuerpo embrioide (EB)
con GFP bajo promotor α-MHC (técnica de gota pendiente)
3.- Tras 5-7 días en cultivo hay células contráctiles que expresan GFP

14. A) efecto de las variantes no patológicas y las mutaciones en el mtDNA sobre
los patrones de expresión génica de células ES
1
2
Extracción de RNA de las líneas
3
Expresión génica con
microarrays de DNA (CNIC)

15. Transcriptómica en células ES
Microarrays de DNA
41,041 (60-mer) probes:
representing all empirical and predicted mouse
genes and transcripts from the NIA Mouse Gene
Index.
RefSeq, Ensembl, RIKEN, GenBank, and
UniGene.

16. Transcriptómica en células ES

17. Transcriptómica en células ES
Redes generadas
en base a
interacciones
entre genes
descritas en la
bibliografía

18. Transcriptómica en células ES
Rutas/Funciones estadísticamente afectadas

19. Transcriptómica en células ES
ES-C3H
ES-C57

20. Transcriptómica en células ES

21. Resultados Transcriptómica
Comparaciones:
A) líneas ES transmitocondriales (WT y mutantes) con ES control
B) líneas ES transmitocondriales WT entre sí y con ES control
C) líneas ES transmitocondriales mutantes con ES control

22. Resultados Transcriptómica
A) líneas ES transmitocondriales (WT y mutantes) con ES control:
1.- Cambios en 200-600 genes (solo 18 comunes a WT y Mut.)
2.- No parecen estar afectados por la transferencia los genes
implicados en pluripotencialidad.
ES transmit. WT ES transmit. Mut.
ES control
NIH3T3 Mb 77
NZB/B1NJ FC2C12
ES.C57BL6 XX
C3H E9C
Balb/c FHBc
C57BL6

23. Resultados Transcriptómica
B) líneas ES transmitocondriales WT entre sí y con ES control
C) líneas ES transmitocondriales mutantes con ES control
1.- No hay cambios significativos en funciones o rutas
2.- Los mayores cambios en genes asociados a señalización celular,
sistema inmune e inflamación (WT y Mut.)
3.- No hay cambios en metabolismo azúcares o lípidos (Mut.).
ES transmit. WT ES transmit. Mut.
ES control
NIH3T3 Mb 77
NZB/B1NJ FC2C12
ES.C57BL6 XX
C3H E9C
Balb/c FHBc
C57BL6

24. Analysis PCA
MUT.
WT

25. Patricia Meade
Ana Latorre
Unidad de Genómica CNIC:
Sergio Callejas
Ana Dopazo