proceso de desarrollo

1. Célula In Vitro. desarrollo Biol.—Plant 42:37–43, enero–febrero de 2006 q
2006 Sociedad de Biología In Vitro 1054-5476/06 $18,00+0,00
DOI: 10.1079/IVP2005722
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA MEJORADA A PARTIR DECOCOS NUCIFERA (L.) EXPLANTES DE PLUMULA
MT PÉREZ-NÚÑEZ1, JL CHAN1, L. SÁENZ1, T. GONZÁLEZ1, JL VERDEIL2,YC.OROPEZA1*
1Centro de Investigación Científica de Yucatán, Mérida, Yucatán, México
2L'Institut de Recherche pour le Développement-Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Development
(IRD-CIRAD), Montpellier, Francia
(Recibido el 29 de junio de 2005; aceptado el 8 de noviembre de 2005; editor SS Korban)
Resumen
El coco es una de las especies más recalcitrantes para regenerarsein vitro.Aunque los esfuerzos de investigación anteriores que utilizaron explantes
de plúmulas han dado como resultado una embriogénesis somática reproducible, la eficiencia es de solo 4 o 10 embriones somáticos por plúmula sin o
con un tratamiento con brasinólido, respectivamente. Con el fin de aumentar la eficiencia de la embriogénesis somática en la palma de coco, se
evaluaron e informaron aquí dos enfoques diferentes: la embriogénesis somática secundaria y la multiplicación de callos embriogénicos. Los embriones
somáticos primarios obtenidos a partir de explantes de plúmula se utilizaron como explantes y formaron callos embriogénicos y embriones somáticos
secundarios. Los callos embriogénicos obtenidos después de tres ciclos de multiplicación fueron capaces de producir embriones somáticos. La eficiencia
del sistema se evaluó en un proceso por etapas que comenzó con un paso inicial para inducir la embriogénesis somática primaria, seguido de tres pasos
para inducir la embriogénesis somática secundaria, seguido de tres pasos para la multiplicación del callo embriogénico y, finalmente, la producción de
embriones somáticos a partir del callo. El rendimiento total calculado de una plúmula fue de 98 000 embriones somáticos. Comparando esto con el
rendimiento obtenido a partir de la embriogénesis somática primaria, se obtiene un aumento de aproximadamente 50 000 veces. Cuando se compara
con el rendimiento informado previamente en la literatura con el uso de un tratamiento con brasinólido, es un aumento de aproximadamente 10 000
veces en el rendimiento. El presente protocolo representa un avance importante en la mejora de la eficiencia de la producción de embriones somáticos
de coco.
Palabras clave:Coco; embriogénesis somática secundaria; multiplicación de callos.
Introducción polinización cruzada, excluiríamos la clonación de individuos con
características agronómicas conocidas.
La embriogénesis somática se define como un proceso en el que una
estructura bipolar, parecida a un embrión cigoto, se desarrolla a partir de una
célula no cigota sin conexión vascular con el tejido original (Von Arnold et al.,
2002). Los embriones resultantes pueden germinar y convertirse en plántulas.
Alternativamente, los embriones somáticos pueden usarse como explantes
para producir embriones somáticos adicionales a través de la embriogénesis
somática secundaria (Vasic et al., 2001). La embriogénesis somática secundaria
puede repetirse varias veces, lo que contribuye significativamente a aumentar
el rendimiento de la formación de embriones somáticos, especialmente en
plantas con baja capacidad embriogénica (Raemakers et al., 1995). Por
ejemplo, la producción de embriones somáticos enTheobroma cacaoaumentó
30 veces después de dos ciclos de embriogénesis somática secundaria
(Maximova et al., 2002). Además, los embriones obtenidos mediante
embriogénesis somática secundaria suelen estar mejor desarrollados que los
obtenidos mediante embriogénesis somática primaria. También se ha
informado que la embriogénesis somática secundaria ayuda a retener la
competencia embriogénica durante tiempos de cultivo prolongados, hasta 10
años en diferentes especies (Stamp y Henshaw, 1987; Baker y Wetzstein, 1995;
Schavemaker y Jacobsen, 1995; Martinelli et al., 2001). ). Por otro lado, una
práctica común para mantener y multiplicar el callo es subdividirlo y
subcultivar repetidamente estas piezas. Esto da como resultado la producción
de mayores cantidades de callos, como se informó anteriormente para varias
especies (George, 1996). Ni secundaria
Coco (Cocos nuciferaL.) es una de las especies más recalcitrantes para
in vitroregeneración. Esto es desafortunado, ya que existe un gran
interés en la micropropagación del coco debido a la creciente necesidad
de variedades de coco mejoradas o seleccionadas, particularmente
aquellas resistentes a diversas enfermedades (Harnold y Randles, 1991;
Arellano y Oropeza, 1995; Eden-Green, 1997). ). La investigación sobre la
micropropagación del coco ha demostrado que la embriogénesis
somática es un enfoque viable parain vitroregeneración de plantas
(Hornung y Verdeil, 1999). El explante de plúmula, que consiste en el
meristemo del brote y rodeado por primordios de hojas extirpados de
embriones cigóticos maduros, ha demostrado ser el más sensible para la
formación de callos embriogénicos y embriones somáticos (Hornung,
1995). El uso de estos explantes ha permitido desarrollar un protocolo de
micropropagación reproducible (Chan et al., 1998; Sáenz et al., 1999)
pero con baja eficiencia, alrededor de cuatro embriones somáticos por
plúmula. El uso de compuestos como los brasinoesteroides (Azpeitia et
al., 2003) y las anticitoquininas (Azpeitia et al., 2003) ha aumentado el
número de embriones somáticos por plúmula solo 2,5 veces y 1,5 veces,
respectivamente. Por lo tanto, se requiere una mayor eficiencia de
regeneración a través de la embriogénesis somática para la
micropropagación masiva de cocoteros de élite. Sin embargo,
* Autor a quien debe dirigirse la correspondencia: Correo electrónico cos@cicy.mx
37
Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.com

2. 38 PÉREZ-NÚÑEZ ET AL.
Se ha informado embriogénesis somática ni multiplicación de callos para el
coco. Por lo tanto, con base en el uso de explantes de plúmula de coco, los
objetivos del presente trabajo fueron: (a) determinar si la embriogénesis
somática secundaria puede ser inducida a partir de embriones somáticos; (b)
para determinar si el callo embriogénico se puede multiplicar; y (c) determinar
si estos procesos son útiles para obtener mayores rendimientos de callos
embriogénicos y finalmente de embriones somáticos.
(SE/CE) para PSE, SSE1 – 2y ECM2 – 3. Los datos presentados corresponden a medias de
seis réplicas, cada una con 100 explantes para embriogénesis somática primaria y
secundaria, y tres réplicas cada una con 30 explantes para multiplicación de callos
embriogénicos. Los datos se sometieron a análisis de varianza (ANOVA). Las
comparaciones de medias se determinaron mediante la prueba de Student-Newman-
Keuls enPAGS ,0.05.
Resultados
Embriogénesis somática primaria.Los explantes de plúmula cultivados
en medio I/condición I formaron callos a lo largo de los primordios de las
hojas externas que rodean el meristema del brote dentro de los 15 a 30
días posteriores al cultivo. Por lo tanto, este callo se denominará callo
inicial. Este callo era duro y de color blanco o beige (Higo.1a),como
informaron previamente Azpeitia et al. (2003). El análisis histológico
mostró la presencia de células meristemáticas en la periferia del callo (
Higo.2a).
El callo inicial eventualmente evolucionó a un callo embriogénico. Los
cambios en el desarrollo incluyeron la formación de estructuras translúcidas
en forma de oreja que aparecieron después de 45 días (Higo.1B).El análisis
histológico de estas estructuras mostró la presencia de pequeñas células
meristemáticas densamente teñidas ubicadas en su periferia (no mostradas).
Aproximadamente a los 60 días, comenzaron a desarrollarse estructuras
globulares y luego alargadas a lo largo de la superficie de las estructuras
translúcidas (Higo.1C);estos eran compactos, suaves y fácilmente distinguibles. Dado
que los embriones somáticos finalmente se desarrollaron a partir de estas
estructuras (ver más abajo), en adelante se denominarán estructuras embriogénicas.
El análisis histológico de estas estructuras mostró la presencia de pequeñas células
meristemáticas densamente teñidas (Higo.2B).Las células meristemáticas finalmente
se convirtieron en nódulos meristemáticos, ubicados a lo largo de la periferia de las
estructuras embriogénicas, pero debajo de una capa de células no teñidas que
forman el protodermo (PD) (Higo.2C).La mayoría de los callos que alcanzan esta
etapa de desarrollo lo hicieron dentro de los 90 días y en adelante se denominarán
callos embriogénicos.
Cuando los callos embriogénicos se transfirieron al medio II/condición II, se
observaron embriones somáticos en las estructuras embriogénicas dentro de
los 30 a 40 días posteriores a la transferencia (Higo.1D).Los embriones
somáticos tempranos eran de 1 a 2 mm de diámetro, globulares y blancos. El
análisis histológico de estos embriones no reveló un meristemo bien definido,
pero sí algunas capas de células meristemáticas (Higo.2D). Para el día 40, los
embriones somáticos se desarrollaron en formas alargadas y se observaron
algunos embriones fusionados. Los embriones eran capaces de germinar y
desarrollarse después de la germinación en medio II/ condición II (Higo.1mi).
La evaluación de los rendimientos mostró que el porcentaje de
explantes que formaron callo inicial fue de 83.33 y 38.16 para callo
embriogénico, y la producción de embriones somáticos fue de 5.16 SE/EC
(Cuadro 1).
Embriogénesis somática secundaria.Los embriones obtenidos
mediante embriogénesis somática primaria se cultivaron en medio I/
condición I para determinar si eran capaces de formar callos iniciales y
embriogénicos. Para el día 15, se observó la formación inicial de callos
alrededor del embrión; este callo era duro y de color blanco o beige (
Higo.1F).El análisis histológico mostró que el tejido proliferante que
formaba un anillo alrededor del embrión contenía células
meristemáticas (Higo.2e, f).Similar a la embriogénesis somática primaria,
la mayoría de estas células se observaron en la periferia del callo. Estas
células también revelaron un citoplasma más densamente teñido.
Materiales y métodos
Material vegetal.
Cocoteros Green Malayan Dwarf de 15 años. Los cilindros de embriones que contenían
endospermo se extirparon en el campo y se colocaron en una solución de NaClO al 0,6% (p/
v) durante la recolección y luego se enjuagaron tres veces con agua destilada. Una vez en el
laboratorio, en condiciones asépticas, los cilindros se lavaron en etanol al 70 % durante 3
min, se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril durante 5 min cada una, se lavaron
en solución de NaClO al 6 % (p/v) durante 20 min y se enjuagaron nuevamente. tres veces
con agua destilada estéril. Los embriones se extirparon de cilindros de endospermo, se
lavaron en solución de NaClO al 0,6 % (p/v) durante 10 min y se enjuagaron con agua
destilada estéril tres veces. Se extirparon las plúmulas de estos embriones utilizando un
microscopio estereoscópico y se colocaron directamente en un medio de cultivo.
Embriogénesis somática primaria.La preparación de los medios y las condiciones
de cultivo se llevaron a cabo de acuerdo con Azpeitia et al. (2003). Los medios I y II se
prepararon usando medio Y3 (Eeuwens, 1976), complementado con 3 gl21
gelrita y 2,5 gl21carbón vegetal (lavado con ácido, probado en cultivo de células vegetales),
pero el medio I contenía 600metroMETROácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), mientras
que el medio II contenía 6metroMETRO2,4-D y 300metroMETRO6-benciladenina (BA). Todos
los productos químicos fueron suministrados por Sigma (St Louis, EE. UU.). El pH del medio
se ajustó a 5,75 con NaOH antes de autoclavarlo durante 20 min a 1208C. Para la inducción
de callos, cada explante se cultivó durante 3 meses. en un recipiente de vidrio de 35 ml que
contenía 10 ml de medio I. Los cultivos se mantuvieron en completa oscuridad a 27 ^ 28C sin
subcultivo (condición I). Para la inducción de embriones somáticos primarios, se
subcultivaron callos en un recipiente de vidrio de 100 ml que contenía 25 ml de medio II. Los
cultivos se mantuvieron bajo un fotoperíodo de 16 h (45–60metromol m22s21PPFD) en 27 ^ 2
8C, y los explantes se subcultivaron una vez cada 2 meses. (condición II).
Embriogénesis somática secundaria.Se extirparon embriones somáticos primarios
globulares y se subcultivaron en medio I/condición I para la inducción de callos
embriogénicos. Para la inducción del desarrollo del embrión, los callos se
subcultivaron luego en medio II/condición II.
Multiplicación de callos.Las estructuras embriogénicas se aislaron del callo
embriogénico que crecía en medio I/condición I y se subcultivaron en el
mismo medio y condición durante 60 a 90 días para probar si se podía obtener
un callo embriogénico recién formado a partir de ellas. Este procedimiento se
repitió dos veces. El callo embriogénico obtenido se subcultivó en medio II/
condición II para probar su potencial embriogénico.
Histología.Los procedimientos histológicos se realizaron según Buffard-Morel et
al. (1992), pero con ligeras modificaciones. Las muestras de tejido se fijaron en
paraformaldehído al 4% en 0,2METROtampón de fosfato (pH 7,2) durante 24 h bajo
presión negativa. Las muestras se deshidrataron paso a paso (1 h cada paso)
utilizando etanol al 30, 50, 70, 80, 90, 96 y 100 % en agua. A esto le siguió la
impregnación con resina JB-4 (Polyscience, PA, EE. UU.). Se prepararon secciones de
tres micrómetros a partir de los tejidos impregnados de resina con un micrótomo
(HM 325, MICROM, Hellersbergstr, Neuss, Alemania), equipado con una cuchilla de
acero. Las secciones se tiñeron dos veces con la reacción del ácido peryódico de
Schiff (PAS) combinada con azul-negro de naftol específico de proteína. El PAS tiñe las
reservas de almidón y la pared celular de rosa, y el azul-negro de naftol tiñe
específicamente las proteínas solubles o de reserva de azul oscuro (Fisher, 1968).
Evaluación cuantitativa y estadística.La evaluación cuantitativa se llevó a cabo a
través de un proceso por etapas de la siguiente manera: el paso inicial fue la
embriogénesis somática primaria (PSE), seguido de tres pasos de embriogénesis
somática secundaria (SSE1 – 3), luego tres pasos de multiplicación de callos
embriogénicos (ECM1 – 3), y finalmente formación de embriones somáticos a partir de
los callos embriogénicos obtenidos en ECM2y ECM3. En cada paso se utilizó una
muestra representativa de los embriones o de los callos embriogénicos obtenidos
como explantes para el siguiente paso. Luego determinamos los porcentajes de
explantes formando callo inicial y callo embriogénico para cada paso y la cantidad de
embriones somáticos por callo embriogénico.
Las frutas se cosecharon entre 12 y 14 meses. después de la polinización de

3. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DECOCOS NUCIFERA 39
FYO G. 1. Desarrollo morfológico de cultivos de plúmulas de coco durante la primaria (a–e)y secundaria (f-j)embriogénesis somática. Explantes
(plúmulas o embriones somáticos) cultivados en medio I/estado I formando callo inicial (a, f).Estos eventualmente desarrollan estructuras translúcidas en
forma de oreja (TS) (b, g)antes de convertirse en callo embriogénico (c, h)con estructuras embriogénicas (ES) características. Luego, los callos
embriogénicos se transfieren al medio II/condición II, donde forman embriones somáticos (SE) (d, i).Algunos de estos embriones germinan y se
convierten en plántulas (e, j). Barras de escalaporanuncioyf-yo¼1 milímetro; y paramiyj¼1cm
El desarrollo del callo inicial en callo embriogénico ocurrió dentro de
los 60 días, a diferencia del período de 90 días para la embriogénesis
somática primaria, pero morfológicamente (Higo.1g, h)e histológico (
Higo.2gramo)desarrollo fueron idénticos.
Los callos embriogénicos se transfirieron al medio II/condición II y se observó un
mayor desarrollo en embriones somáticos a partir de estructuras embriogénicas
dentro de los 20 a 25 días de cultivo. Estos nuevos embriones somáticos eran
idénticos a los formados durante la embriogénesis somática primaria (Higo.1I).
Aunque también se observaron embriones fusionados, estos fueron menos
abundantes que los observados durante la embriogénesis somática primaria. Los
embriones somáticos obtenidos a través de la embriogénesis somática secundaria se
utilizaron como explantes para el desarrollo posterior del callo inicial, el callo
embriogénico y los embriones somáticos. Los embriones somáticos secundarios
fueron capaces de germinar y desarrollarse después de la germinación en medio II/
condición II (Higo.1j).
Durante la embriogénesis somática primaria y secundaria (y la
multiplicación del callo embriogénico, ver más abajo), algunos de los callos
iniciales produjeron un callo similar a una esponja que no se convirtió en un
callo embriogénico; esto se denominará de ahora en adelante callo no
embriogénico. Cuando se analizó histológicamente este tipo de callo (30 d de
cultivo en medio I/condición I), no se observaron células meristemáticas, ya
que las células eran de gran tamaño, sueltas, con un núcleo pequeño y
carentes de protodermo (Higo.2h).
Los resultados para la evaluación del rendimiento mostraron que el
porcentaje de explantes que formaron callo inicial fue de 81.66 para SSE1, 76,0
para SSE2, y 81,8 para SSE3(Tabla 1). El porcentaje de explantes que formaron
callos embriogénicos fue de 46,16 para SSE1, 42,33 para SSE2, y 56,0
para SSE3(Tabla 1). La producción de embriones somáticos fue de 4,66
SE/EC para SSE1, y 6.33 para SSE2; esto no fue evaluado para SSE3
(Tabla 1).
Multiplicación de callos embriogénicos.Estructuras embriogénicas
aisladas de callos embriogénicos (Higo.3una, b)se subcultivaron en
medio I/condición I para determinar si eran capaces de formar callos
iniciales y embriogénicos. La formación del callo inicial en estructuras
embriogénicas aisladas se observó después de 15 días y fue perceptible
solo durante unos pocos días. Las secciones histológicas mostraron la
presencia de células meristemáticas con citoplasma densamente teñido
en tejidos periféricos (Higo.3discos compactos).Esto fue seguido
inmediatamente por la formación de estructuras translúcidas que se
hicieron perceptibles después de 30 días (similares a las deHigo.1b, g).
Las observaciones histológicas de estas estructuras mostraron nódulos
meristemáticos (Higo.3mi).Entre los días 45 y 60, se formaron
estructuras embriogénicas en la superficie de estructuras translúcidas. El
proceso de formación de callos iniciales y embriogénicos durante la
multiplicación de callos embriogénicos no mostró diferencias con los
reportados para la embriogénesis somática primaria o secundaria.
El proceso de subdivisión del callo embriogénico y subcultivo de las
piezas aisladas en medio I/condición I se llevó a cabo durante dos ciclos
adicionales. Nuevamente, el callo inicial y el embriogénico se
desarrollaron en cada uno de estos dos ciclos, sin mostrar diferencias
morfológicas o histológicas en relación con las observaciones del primer
ciclo de multiplicación del callo embriogénico. Cuando se subcultivaron
explantes obtenidos del centro de un callo embriogénico, formaron un
callo no embriogénico y, por lo tanto, no se utilizaron.

4. 40 PÉREZ-NÚÑEZ ET AL.
FYO G. 2. Secciones histológicas de cultivos de coco durante la primaria (anuncio)y embriogénesis somática secundaria (p.ej). (a)Sección de un explante
de plúmula que muestra crecimiento de hojas plumulares (PL) y presencia de células meristemáticas (MC). (B)Sección de un callo embriogénico que
muestra la presencia de células meristemáticas en la periferia. (C)Sección de un callo embriogénico que muestra la formación de nódulos meristemáticos
(MN) y protodermo (PD). (D)Sección de un callo embriogénico que muestra un embrión somático globular (GSE). (mi)Sección de un embrión somático
primario que muestra la formación de un callo inicial (IC) en la parte media del cuerpo del embrión. (F)Sección de callo que muestra la presencia de
células meristemáticas (MC). (gramo)Sección de un callo embriogénico que muestra la formación de nódulos meristemáticos (MN) y protodermo (Pd).
(h)Sección de un callo no embriogénico obtenido durante la embriogénesis somática secundaria, que muestra la ausencia de nódulos protodérmicos y
meristemáticos.
Para evaluar si los callos embriogénicos obtenidos durante la
multiplicación de callos embriogénicos eran capaces de formar
embriones somáticos, se subcultivaron en medio II/condición II.
Embriones somáticos formados a partir de los 20 a 25 d de cultivo.
Los resultados de la evaluación del rendimiento mostraron que el
porcentaje de explantes que formaron callo inicial fue de 91.6 para ECM1, 97,5
para ECM2, y 98,5 para ECM3(Tabla 1). El porcentaje de explantes que formaron
callo embriogénico fue de 72,7 para ECM1, 90,0 para ECM2, y 82,5 para ECM3
(Tabla 1). La producción de embriones somáticos fue de 7,20 SE/EC para
ECM2, y 7.5 para ECM3(Tabla 1); esto no fue evaluado para ECM1.
Rendimientos acumulativos.Con base en los datos de la Tabla 1, calculamos
las cifras acumulativas de los rendimientos totales de explantes, callos
embriogénicos y embriones somáticos producidos a lo largo del proceso.
El número de explantes podría aumentar de 100 plúmulas, la cantidad
inicial en la embriogénesis somática primaria, a 1129 explantes de
embriones somáticos en SSE3y a 1 597 284 explantes de estructuras
embriogénicas en MEC3(Tabla 2). La producción de callos embriogénicos
aumentó de 38 en embriogénesis somática primaria a 632 en SSE3y al 1
309 773 en ECM3(Tabla 2). Finalmente, la cantidad de embriones
somáticos aumentó de 196 en embriogénesis somática primaria a 1129
en SSE2y al 9 823 297 en ECM3(Tabla 2). Aunque la conversión de
embriones en plántulas estaba fuera del alcance del presente estudio, se
calculó para la embriogénesis somática primaria que alrededor del 12%
de los embriones formaron plántulas. No tenemos datos para la
conversión de embriones somáticos secundarios o los obtenidos
después de los pasos de multiplicación de callos embriogénicos.

5. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DECOCOS NUCIFERA 41
TABLA 1
FORMACIÓN DE CALLO INICIAL (IC), CALLO EMBRIOGÉNICO (EC) Y EMBRIONES SOMÁTICOS POR EC (SE/EC) DESPUÉS DEL PRIMARIO SOMÁTICO
EMBRIOGÉNESIS (PSE) Y VARIOS PASOS DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA SECUNDARIA (SSE) Y MULTIPLICACIÓN EC (ECM)
Paso Tipo de explante norteexplantesz % CIy % CEy SE/CEy
PSE
SSE1
SSE2
SSE3
ECM1
ECM2
ECM3
Plúmula
SE
SE
SE
Pedazo de CE
Pedazo de CE
Pedazo de CE
100
100
100
100
30
30
30
83,33 ^ 8,66 a
81,66 ^ 15,2 a
76,0 ^ 14,17 a
81,8 ^ 8,2 a
91,6 ^ 11,72 a
97,5 ^ 2,5 a
98,5 ^ 1,5 a
38.16 ^ 10.24b
46,16 ^ 5,77 b
42,33 ^ 8,16 b
56.0 ^ 17.0 ab
72,7 ^ 23,4 a
90,0 ^ 10,0 a
82,5 ^ 6,5 a
5.16 ^ 1.6 a
4,66 ^ 0,51 a
6,33 ^ 1,36 a
–
–
7,20 ^ 0,28 a
7.5 ^ 1.1 a
zDe los rendimientos totales de SE o EC obtenidos al final de PSE, SSE(1 - 3)o ECM(1 - 3), respectivamente, solo se utilizó una parte, 100 (seis repeticiones) para PSE y
SSE(1 - 3), y 30 (tres repeticiones) para ECM(1 - 3).
yLas cifras presentadas son medias con desviación estándar y diferentesletrasdentro decolumnasdenotan diferencias significativas (PAGS ,0,05).
Discusión rendimientos de callos embriogénicos y embriones somáticos
(Raemakers et al., 1995; George, 1996; Maximova et al., 2002). Ni la
embriogénesis somática secundaria ni la multiplicación de callos
embriogénicos se han informado previamente para el coco.
Para determinar si podía iniciarse la embriogénesis somática secundaria, se
evaluaron los embriones somáticos primarios para la formación de callos
iniciales, callos embriogénicos y embriones somáticos secundarios, y de hecho
se obtuvieron todas estas etapas de desarrollo.
La embriogénesis somática reproducible del coco a partir de
explantes de plúmulas se ha logrado previamente con baja
eficiencia (Chan et al., 1998; Sáenz et al., 1999; Azpeitia et al., 2003).
Para mejorar el sistema, se desarrollaron embriogénesis somática
secundaria y multiplicación de callos embriogénicos. Estos enfoques
han sido útiles en otras especies para obtener mayor
FYO G. 3. (a)Observaciones morfológicas e histológicas durante el proceso de multiplicación de callos embriogénicos. Un callo embriogénico que
muestra estructuras embriogénicas (ES). (B)SE aislados utilizados como explantes para iniciar el proceso. (C)Sección de un ES aislado que muestra la
presencia de células meristemáticas (MC) en la periferia y (D)vista ampliada de tejido periférico que muestra MC densamente teñido y la presencia de un
protodermo (PD). (mi)Una sección de un callo embriogénico que muestra la presencia de nódulos meristemáticos (MN) debajo de las capas de células de
PD.

6. 42 PÉREZ-NÚÑEZ ET AL.
TABLA 2
RENDIMIENTO ACUMULADO CALCULADO DE CALLO EMBRIOGÉNICO (EC) Y EMBRIONES SOMÁTICOS (SE) DESPUÉS DE EMBRIOGÉNESIS
SOMÁTICA PRIMARIA (PSE) Y VARIOS PASOS DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA SECUNDARIA (SSE) Y MULTIPLICACIÓN DE EC (ECM)
Paso rebanar explantesz CEz SEz
PSE
SSE1
SSE2
SSE3
ECM1
ECM2
ECM3
–
–
–
–
£15
£20
£13
100
196
421
1129
9480
136 520
1 597 284
38 ^ 10.2
90^11,32
176 ^ 34,3
632^271,4
6826 ^ 2708.5
122 868 ^ 19 306,8 1
309 773 ^ 146 828
196 ^ 60,87
421 ^ 46,72
1129 ^ 240
–
–
–
9 823 297 ^ 2 307 528
zCifras calculadas con porcentajes informados en la Tabla 1 extrapolando a los rendimientos totales para cada paso.
De manera similar, los embriones somáticos secundarios también fueron
capaces de desarrollar callos iniciales, callos embriogénicos y embriones
somáticos secundarios. Cuando la embriogénesis somática primaria y
secundaria se compararon morfológica e histológicamente, se encontró
que eran muy similares con solo diferencias menores. Con ambos tipos
de explantes, plúmula o embriones somáticos, el callo inicial se
desarrolló a partir de los tejidos periféricos como se ha informado para
otras especies comoVitis rupestrisS. (Martinelli et al., 2001) y Quercus
suberL. (Puigderrajols et al., 2001). Durante la embriogénesis somática
primaria y secundaria, era común encontrar embriones fusionados. Sin
embargo, estos fueron más abundantes en la embriogénesis somática
primaria (datos no mostrados).
La formación del callo inicial durante la embriogénesis somática
secundaria no tomó más tiempo que el necesario para la embriogénesis
somática primaria, pero la formación del callo embriogénico y de los
embriones somáticos fue más rápida durante la embriogénesis somática
secundaria. Por lo tanto, la embriogénesis somática secundaria fue más
eficiente que la embriogénesis somática primaria. Se ha informado una
diferencia similar para los cultivos de yuca (Stamp y Henshaw, 1987).
Para investigar si el callo embriogénico del coco podía multiplicarse,
los callos embriogénicos se subdividieron y se usaron piezas aisladas de
estructuras embriogénicas como explantes. Nuestros hallazgos
demostraron que las estructuras embriogénicas produjeron nuevos
callos embriogénicos que fueron capaces de formar embriones
somáticos; por lo tanto, la estrategia de multiplicación de callos
embriogénicos es posible en cocoin vitrocultura. Desde el punto de vista
del desarrollo, el proceso es muy similar al observado para la
embriogénesis somática primaria y secundaria, excepto que la formación
inicial de callos apenas se nota, con la formación de estructuras
translúcidas a los pocos días de cultivo; y muy importante, el callo
embriogénico recién formado pudo formar embriones somáticos. La
formación de callos embriogénicos y embriones somáticos durante la
multiplicación de callos embriogénicos fue más rápida que la formación
de callos a partir de la embriogénesis somática primaria utilizando
explantes de plúmulas.
Se evaluó el rendimiento cuantitativo tanto de la embriogénesis somática
secundaria como de la multiplicación del callo embriogénico para determinar
si cualquiera de los dos procesos podría ser útil para mejorar el rendimiento
del callo embriogénico y del embrión somático. El porcentaje de explantes que
formaron callos iniciales durante la embriogénesis somática primaria fue de
83,3, para la embriogénesis somática secundaria fue de 76–81,8 y para la
multiplicación de callos embriogénicos fue de 91,6–98,5. En todos los casos,
las diferencias no fueron estadísticamente significativas.
El porcentaje de explantes que formaron callos embriogénicos durante la embriogénesis somática primaria fue de 38,1, para la embriogénesis
somática secundaria fue de 42,3–56,0 y para la multiplicación de callos embriogénicos fue de 72,7–90,0, siendo el último significativamente mayor
que los dos primeros. En el caso de la formación de embriones somáticos, las cifras variaron de 4,6 a 7,5 SE/EC sin diferencias significativas. Los
resultados muestran que cada una de las respuestas morfológicas estudiadas para la embriogénesis somática secundaria y la multiplicación de
callos embriogénicos no se redujeron cuantitativamente en relación con la embriogénesis somática primaria y fueron reproducibles. Para los
rendimientos generales del proceso, 100 plúmulas dieron como resultado un total de 1,3 millones de callos embriogénicos y 9,8 millones de
embriones somáticos, o 13 000 callos embriogénicos y 98 000 embriones somáticos por sola plúmula. Al comparar estos rendimientos con los
rendimientos actuales para la embriogénesis somática primaria, los aumentos fueron de unas 35 000 veces para la formación de callos
embriogénicos y de unas 50 000 veces para la formación de embriones somáticos. Las cifras anteriores en la literatura para la embriogénesis
somática primaria (Azpeitia et al., 2003) eran de 360 embriones somáticos por 100 plúmulas o alrededor de 1000 embriones si los explantes se
trataron con 22(S);23(S)-homobrasinolida. Por lo tanto, el rendimiento actual de embriones es unas 27 000 veces mayor si se compara con el
resultado de Azpeitia et al. (2003) obtenido sin tratamiento con brassinolide o incluso 10 000 veces mayor si se compara con el obtenido con
tratamiento con brassinolide. En nuestros experimentos, no se probó el tratamiento con brasinolida. los aumentos fueron de unas 35 000 veces
para la formación de callos embriogénicos y de unas 50 000 veces para la formación de embriones somáticos. Las cifras anteriores en la literatura
para la embriogénesis somática primaria (Azpeitia et al., 2003) eran de 360 embriones somáticos por 100 plúmulas o alrededor de 1000
embriones si los explantes se trataron con 22(S);23(S)-homobrasinolida. Por lo tanto, el rendimiento actual de embriones es unas 27 000 veces
mayor si se compara con el resultado de Azpeitia et al. (2003) obtenido sin tratamiento con brassinolide o incluso 10 000 veces mayor si se
compara con el obtenido con tratamiento con brassinolide. En nuestros experimentos, no se probó el tratamiento con brasinolida. los aumentos
fueron de unas 35 000 veces para la formación de callos embriogénicos y de unas 50 000 veces para la formación de embriones somáticos. Las
cifras anteriores en la literatura para la embriogénesis somática primaria (Azpeitia et al., 2003) eran de 360 embriones somáticos por 100
plúmulas o alrededor de 1000 embriones si los explantes se trataron con 22(S);23(S)-homobrasinolida. Por lo tanto, el rendimiento actual de
embriones es unas 27 000 veces mayor si se compara con el resultado de Azpeitia et al. (2003) obtenido sin tratamiento con brassinolide o incluso
10 000 veces mayor si se compara con el obtenido con tratamiento con brassinolide. En nuestros experimentos, no se probó el tratamiento con
brasinolida. 2003) fueron 360 embriones somáticos por 100 plúmulas o alrededor de 1000 embriones si los explantes se trataron con 22(S);23(S)-
homobrasinolida. Por lo tanto, el rendimiento actual de embriones es unas 27 000 veces mayor si se compara con el resultado de Azpeitia et al. (2003) obtenido sin tratamie
Es importante enfatizar que después de tres pasos de multiplicación
de callos embriogénicos, los callos aún podían producir embriones. Estos
embriones se probaron como explantes y produjeron callos
embriogénicos y embriones somáticos (datos no mostrados). Dado que
el uso repetitivo de la multiplicación de callos tiene el riesgo de perder la
competencia embriogénica (George, 1996; Das Neves et al., 1999), tal vez
se pueda realizar un uso alternativo de la embriogénesis somática
secundaria y la multiplicación de callos embriogénicos varias veces para
explotar sus respectivas propiedades. ventajas, que incluyen la
conservación de la competencia embriogénica y una gran capacidad de
multiplicación. De esta manera, si el protocolo se amplía con más pasos
de embriogénesis y multiplicación de callos embriogénicos, deberíamos
esperar obtener un rendimiento mayor que el informado aquí.
El protocolo informado aquí representa un progreso importante hacia la
aplicación práctica al mostrar una forma de mejorar la eficiencia de la producción de
embriones somáticos de coco. Como se mencionó anteriormente, el uso de
explantes de plúmulas de embriones cigóticos obtenidos por polinización cruzada
impedirá la aplicación de este protocolo para la clonación de individuos de palma con
características agronómicas conocidas. Sin embargo, esto podría ser

7. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DECOCOS NUCIFERA 43
superar si los embriones se obtienen por autopolinización de palmas isogénicas, o
alternativamente, reemplazando las plúmulas con un tipo de explante obtenido de
una palma madura con características conocidas. Sin embargo, los intentos de lograr
lo último no han tenido éxito hasta ahora en la obtención de una producción
reproducible de callos embriogénicos y embriones somáticos.
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Expresiones de gratitud
Los autores desean agradecer a CONACYT, México por el financiamiento
parcial de la investigación aquí reportada (Programa SISIERRA becas 970104 y
990130) y por una beca para MT Pérez-Núñez (Beca 162930).
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