El documento describe las técnicas de biotecnología reproductiva aplicadas a la ganadería en Panamá, incluyendo inseminación artificial, transferencia de embriones, congelación de semen y ovocitos, y determinación del sexo. Explica los protocolos, materiales y equipos utilizados, así como los resultados obtenidos y desafíos pendientes para mejorar la eficiencia de estas técnicas en el país. El autor concluye destacando la importancia de estas herramientas para el mejoramiento genético del ganado panameño.

1. Posibilidades de la Biotecnología
Animal como herramienta para el
mejoramiento ganadero y su estado
actual en Panamá.
Dr.M.V. Reinaldo de Armas PhD.
Prof. Reproducción y Biotecnología Animal.
Escuela de Ciencias Pecuarias.
Centro de Investigaciones en Biotecnologías Agropecuarias
Facultad de Ciencias Agropecuarias - UP

3. REVOLUCIÓN TECNOLÓGICA

4. BIOTECNOLOGÍAS

5. BIOTECNOLOGÍAS

6. BIOTECNOLOGÍAS

7. Inseminación artificial y congelación de semen

8. • Sincronización e inducción de la ovulación
• Inseminación artificial y congelación de semen
• Producción de embriones por superovulación
• Producción in vitro de embriones
• Congelación de ovocitos y embriones
• Micromanipulación de embriones para producir gemelos
idénticos y quimeras
• Determinación y selección del sexo de embriones y
espermatozoides
• Clonado de animales por medio de transferencia nuclear
• Transgénesis.
• Marcadores genéticos
Biotecnologías Reproductivas:

9. La necesidad de los sistemas de explotación
intensivos de implementar la IA, han sido el motor
impulsor de las investigaciones desarrolladas en
cuanto al desarrollo de técnicas de sincronización e
inducción del celo. ¿ Por qué ?
Sincronización e inducción de la
ovulación:

10.  Empleo de las Prostaglandinas: Para que este medicamento
ejerza su acción resulta necesario la presencia de un cuerpo lúteo
(CL) activo en uno de los ovarios de la hembra. Una de las
desventajas de este tratamiento es la dispersión de la
presentación de los celos, pero sus resultados de gestación
son altos (~60%). ¿Abortos?
Entre los sistemas de sincronización del celo
los más conocidos son:
Ovsynch (GnRH, PGF2α, GnRH): Se pueden lograr resultados
de preñez que oscilan entre 33 y 55%.

11. Empleo de Progestágenos y Estradiol: Los sistemas
más conocidos que emplean estos principios hormonales
son los implantes subcutáneos (Crestar y Sinchromate B),
espirales y las Y intravaginales (CIDR). Hay otros
tratamientos que solo emplean progestágenos, como las
inyecciones seriadas de progesterona (P4) o suministro en
la dieta. Los resultados de gestación está alrededor del
50%.

12. los
resultados son ligeramente más bajos que los
que son logrados sobre celos detectados.
Estrógenos, Dispositivos liberadores de progestágenos,
PGF2α, PMSG y GnRH.

13. la respuesta individual, el efecto raza,
estado reproductivo, nutricional y productivo.
hay regulaciones en diferentes
países

14. Selección de toros para la
reproducción y para la congelación
de semen.

15. CERTIFICADO DE EXAMEN ANDROLÓGICO
Datos de la Finca: Datos del Animal:
Finca: Identificación:
Propietario: Especie:
Localidad: Raza:
Provincia: Edad:
Peso:
Fecha: Color:
Resultados del Examen General y Especial:
Aplomos:
Visión:
Condición Corporal: (en escala de 1 a 5).
Temperamento:
Escroto:
Testículos: Circunferencia escrotal:
Adherencias:
Epidídímos:
Prepucio:
Pene:
Vesículas Seminales:
Próstata:
Respuesta al Electroeyaculador:
Resultado del Espermiograma:
Cantidad del eyaculado:
Color:
Vigor de los Espermatozoides:
Motilidad por campo bajo microscopio: % V/M: %
Concentración de Espermatozoides: x 106 espermios / ml
Anormalidades Espermáticas: % Patologías:
Células de Descamación:
Calificación Final del Semen Según Morfología:
Observaciones y Recomendaciones:
Requisitos para la selección
de un Reproductor:
• Salud General
• Valor Genético
• Examen Reproductivo
• Capacidad de Servicio

17. Congelación de Semen:
Diluentes crioprotectores:
 Citrato yema
 Glicerina leche
 Biladyl
 Triladyl
 Andromed
Métodos de congelación:
 Ámpulas
 Pastillas
 Pajuelas

20. En nuestro país se ha estado tomando conciencia de la necesidad
del empleo de estas técnicas e instituciones tanto privadas como
estatales y profesionales independientes brindan los servicios de
congelamiento de semen e inseminación artificial.
Congelación de Semen en Centrales de IA:
CENTRO DE REPRODUCCIÓN
GENÉTICO GANADERO S.A.
La Mata, Veraguas
La congelación en Centrales y fincas:
Profesionales de Forma Privada
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Chiriquí Los Santos, Azuero
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA ANIMAL
Gualaca, Chiriquí

21. Producción de embriones por superovulación
A pesar de que la técnica de transferencia de embriones data de finales
del siglo XIX (Walter Heape) y de la generalizada popularidad de esta
técnica, en la mejora genética. En Panamá se han desarrollado
numerosos trabajos, pero sin seguir programas estratégicos de
mejoramiento genético y hasta el momento hay muy pocos resultados
publicados de los mismos.
En sentido general, la técnica emplea vacas de alto valor genético, para la
inducción hormonal de ovulaciones múltiples y así obtener un número
considerable de embriones. Una vez realizada la misma, es necesario la
fecundación de los óvulos liberados. Luego de 7 días se realiza un lavado
del útero, para colectar los embriones y clasificarlos morfológicamente.
Los embriones aptos pueden ser transferidos a otras vacas previamente
sincronizadas o conservados por congelación para su posterior
transferencia. Generalmente los resultados son entre 4 y 6 embriones
por donante superovulada y de 50 ó 70%, para embriones
congelados o transferidos en fresco, respectivamente.

22. SUPEROVULACIÓN y TE

23. Existen numerosos esquemas de
superovulación entre los cuales podemos
citar:
Inicio en fase media luteal o tratamiento
convencional : Sobre la base del diagnóstico
transrectal de un CL, ya sea con una sola dosis de
PMSG o dosis múltiples de FSH (4 días a intervalos
de 12h), con la aplicación de PGF2α, 48h después
de la aplicación de PMSG o en la 6ta y 7ma
aplicación en el tratamiento con FSH.

24. Manipulación de la onda folicular (sin la
necesidad de detección del celo):
• Con estradiol y progesterona
• Por punción folicular
• Aplicación de GnRH o LH
• Estimulación de la 1ra onda folicular
• Estimulación de los folículos subordinados
Superovulaciones repetidas:
• Utilización de PMSG al final del tratamiento superovulatorio
• Una o dos aplicaciones de FSH
• Formula de FSH de liberación lenta
• Dos inyecciones de FSH en concentraciones reducidas de
hialuronato

25. No obstante a todo el desarrollo alcanzado en las
investigación es sobre superovulación, los resultados de la
misma son impredecibles y poco repetibles. De forma tal
que la misma es afectada por múltiples factores dentro
de los que podemos citar: nutrición, edad, raza, categoría,
estado lactacional, manejo, tipo de hormona empleada,
entre otros.
Estos factores son difíciles de controlar por el técnico,
frente al interés genético que m pueda presentar el
productor por reproducir un animal en particular.

26. Producción de embriones in vitro.
Para poder producir embriones in vitro, primero tenemos que
conseguir la maduración de los ovocitos, la capacitación del
semen que vamos a utilizar para fecundar y después el
cultivo de los embriones obtenidos hasta estadios
preimplantatorios.
•Medio de maduración (TCM 199 + FSH)
•TALP hepes o gradientes de Percol (medios
para procesamiento del semen)
•Medio de fertilización (TCM 199 + heparina)
•Medio de desarrollo (TCM 199 + IGF1 y otros aditivos o
OSF)
Medios empleados en la FIV

27. La metodología para conseguir la fecundación
in vitro es la siguiente:
-Obtención de los ovocitos post mortem (ovarios de animales
sacrificados) o in vivo (aspiración folicular guiada por ecografía).

28. Maduración de los ovocitos in vitro

29. Separación de fracción espermática
motil (swim up ó gradientes de percol) y
capacitación in vitro de los
espermatozoides, bien procedentes de
semen fresco o de semen congelado.

30. Inseminación in vitro de los ovocitos madurados en el
laboratorio con el semen capacitado. El tiempo de
inseminación varía dependiendo de la especie animal de
que se trate.

31. Cultivo in vitro, con una duración variable y dependiendo de dónde se
realice la transferencia de embriones: en el oviducto (hasta el estadio
de mórula), y en cuerno uterino (mórula o blastocisto).

32. Dependiendo de la especie animal, los resultados son muy
variables, si bien en ovejas y vacas la fecundación in vitro
funciona bien, en la cerda, durante muchos años ha presentado
un gran problema como ha sido la polispermia en la fecundación.
En contraste con la FIV de ovocitos colectados post mortem, la
FIV de ovocitos colectados in vivo por aspiración folicular permite
realizar colectas hasta tres veces por semana (cuatro embriones
por colecta 16 mensuales) y los costos de producción son bajos y
estables (solo la inversión inicial es relativamente alta).
En general los resultados de maduración, fecundación y cultivo in
vitro de embriones, dejan mucho que desear, porque no se
superan cifras promedios de nacimientos superiores al 40% .

33. Congelación de ovocitos y embriones.
En el caso de los bovinos, constituye una herramienta útil:
• Ya que el número de embriones producidos no es predecible y
la disponibilidad de receptoras es otra problemática.
• También posibilita la transferencia de algunos embriones y la
conservación del resto en bancos de germoplasma.
• Permite el intercambio comercial a largas distancias con un
material libre de enfermedades contagiosas.
En la actualidad ya se han logrado estabilizar protocolos que
emplean congeladores programables que ejecutan todo el
procedimiento de congelación lenta y permiten obtener resultados
alrededor del 50% de preñez después de la descongelación y
transferencia directa sin remoción del crioprotector., empleando
como crioprotector etilenglicol al 20% en PBS.

34. - 7 0C
- 32 0C
- 196 0C
t 0C
min.
3 6
seeding
0. 3 0C / min.
5 min.
Equipo de congelación programable
- 7 0C
- 32 0C
- 196 0C
t 0C
min.
3 6
seeding
0. 3 0C / min.
5 min.

35. La vitrificación: Es otro procedimiento de criopreservación, en el
cual el embrión es sometido a una solución crioprotectora altamente
concentrada, que provoca una deshidratación drástica y extrema.
Esta solución con el embrión pasa de un estado líquido a otro casi
sólido, sin llegar a congelarse al ser introducida en N2 líquido. La
descongelación se realiza de igual forma pero si es imprescindible
retirar el crioprotector del embrión, antes de su transferencia, lo cual
ha determinado el poco uso práctico de la misma. Esta técnica en la
actualidad es objeto de estudio como alternativa en la conservación
de embriones producidos por FIV..

36. Es necesario acotar que los resultados de
gestación logrados con embriones producidos in
vitro son menores que los obtenidos por
superovulación (25 a 30%. vs 40 a 50%), por
tales razones se ensayan actualmente nuevos
protocolos que salven esta dificultad dado el
vertiginoso auge que está alcanzando la
producción de embriones por FIV.

37. A continuación exponemos ejemplos de donde se ofertan los
servicio de transferencia de embriones en el país:
Empresas Extranjeras:
Profesionales Extranjeros (USA, Colombia y Costa Rica)
Empresa Privada Nacional: CENTRO DE REPRODUCCIÓN
GENÉTICO GANADERO S.A.
La Mata, Veraguas
Embryotec, S.A.
Chiriquí, Chiriquí
Profesionales Nacionales (Chiriquí, Azuero y Panamá)
Gobierno:
CENTRO DE REP
GENÉTICO GANA
David, Chiriquí La Mata, Ve
Clayton, Ciudad Panamá
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Chiriquí Los Santos, Azuero

38. Determinación y selección del sexo de embriones y
espermatozoides
Con las modernas técnicas de biología molecular y la identificación
de secuencias de ADN específicas del cromosoma Y en varias
especies de animales, se han logrado grandes avances para el
diagnóstico del sexo en embriones, logrando así, mantener la
viabilidad y un alto grado de precisión en embriones
preimplantatorios. Uno de los requisitos para el diagnóstico, es
obtener una pequeña biopsia del embrión, sin que este afecte su
desarrollo posterior. No obstante en su aplicación práctica, nos
enfrenta a un proceso ya consumado y que no podemos
gobernar.

39. Sexado de espermatozoides
Varios son los métodos de separación de espermatozoides y
podríamos resumirlos en dos: aquellos que intentan separar
espermatozoides sobre la base de sus características físicas o
cinéticas y aquellos que actúan sobre las diferencias nucleares de los
espermatozoides que transportan el cromosoma X o el Y. Para
separar espermatozoides es necesario conocer que el núcleo del
espermatozoide que transporta el cromosoma X es más grande y
contiene por tanto una mayor cantidad de ADN que el que transporta
el cromosoma Y.
Para el proceso en cuestión (citometría), el semen tiene que ser
teñido con un colorante fluorescente, el cual se unirá a cada
espermatozoide individual según su contenido de ADN. Se hacen
pasar luego a manera de una corriente o flujo muy delgado a través
de la máquina separadora, la misma utiliza un rayo láser, que ilumina
el colorante. Como el espermatozoide "X" contiene 3.8 % más de
ADN, éste atrapa más colorante y hace que resplandezca más
brillantemente.

40. Posteriormente una computadora clasifica los
espermatozoides en tres grupos:
1) los que llevan cromosoma "X",
2) los que portan "Y", y
3) una población mixta de portadores de "x" e "y"
que no pudieron ser clasificados con absoluta
claridad.
Aquél flujo fino de espermatozoides se fracciona
entonces en gotitas conteniendo un
espermatozoide cada una, pasando por un
dispositivo que les asigna una carga eléctrica + o
- , según la clasificación efectuada por la
computadora - . Se les hace pasar luego por un
campo magnético donde aquéllas con carga +
son atraídas hacia el lado - , y las que poseen
carga - lo son hacia el lado + . Una vez que han
sido separadas las fracciones, el semen puede
usarse en fresco (24 horas) o ser congelado.

41. La citometría, desarrollada por el Dr. Lawrence Johnson en
el año de 1992, consigna un 90% de seguridad en el sexado
del semen.
Pero aún los resultados alcanzados en la IA, con semen
sexado son más bajos que los que se logran semen
convencional (se disminuye la tasa de preñez a la IA, entre
un 15 y 20%) y no se recomienda su uso para inseminación
de donadoras para la transferencia de embriones, pero ha
sido empleado con éxito en la FIV.

42. Micromanipulación de embriones para producir
gemelos idénticos y quimeras
Esta 1ra técnica permite duplicar el número de embriones
disponibles y posibilita la inducción de partos dobles de igual
sexo, eliminando el riesgo del freemartinismo y le brinda al
productor una posibilidad de incremento en la tasa de
natalidad.
Estos animales genéticamente idénticos, tienen a su vez gran
importancia para el desarrollo de investigaciones sobre
comportamiento fisiológico, ya que los mismos son un material
difícil de obtener en la naturaleza (clones)

43. Existen diferentes formas en las cuales los embriones pueden ser
divididos satisfactoriamente y hay gran variación en las técnicas,
producto fundamentalmente de hábitos y experiencias individuales.
Estas técnicas pueden ser divididas en tres grupos:
Separación de blastómeros
División de mórulas antes de la compactación
División de mórulas compactas o blastocitos.

44. Producción de quimeras: Es otro ejemplo práctico del uso de
la micromanipulación en la obtención de individuos por
combinación o agregación de células de 2 ó más embriones,
es decir de 2 ó más pares parentales. Esta técnica resulta ser
el procedimiento inverso al realizado en la producción de
individuos idénticos u homocigóticos.

45. Las quimeras como hemos planteado tienen tejidos de cada
embrión que la originó, por lo cual poseen cuatro ó más padres.
A su vez si uno de los embriones originales era hembra y el otro
macho, el sexo de la quimera resultará indudablemente macho.
Desgraciadamente los tejidos que se desarrollan de cada
embrión, no pueden ser hasta ahora controlados, de aquí que
la contribución de cada embrión original es usualmente desigual
y no es raro obtener un 5% proveniente de un animal y un 95%
del otro. Por esta razón son empleados en la actualidad solo
para lograr transgénicos quiméricos.

46. Clonación:
Clonar significa crear un ser vivo idéntico a otro, a partir de una
célula del individuo original. Hasta hace poco tiempo, los únicos
clones que se podían obtener en el laboratorio eran los de células
embrionarias. Todas las células o blastómeros que componen un
embrión son totipotentes, capaces de regenerar todo el embrión y
todas contienen la misma información genética. Cuando llegan al
estadio de blastocisto, es cuando comienza la diferenciación celular,
ya que las células del trofoblasto darán lugar a la formación de la
placenta y las otras, las llamadas del nódulo embrionario o de la
masa celular interna, son las que originaran el ectodermo,
mesodermo, y el endodermo. Éstas son células diferenciadas y
darán lugar a la formación del órgano o tejido para el cual están
programadas. Para poder formar clones los requisitos mínimos
son: núcleo de una célula donante y ovocitos previamente
enucleados.

47. La clonación de células somáticas por transferencia nuclear (TN), ha
permitido la propagación de animales élites y la generación de animales
transgénicos para fines agrícolas y biomédicos. La TN implica la
enucleación de un ovocito receptor, seguido de la fusión con una célula
donante del núcleo. Luego su activación para continuar su desarrollo
hasta estadios transferibles. Esto ha sido logrado por múltiples autores
en ovejas, cabras y vacas, entre otras especies. Factores como métodos
de enucleación, fusión, activación, tipo de célula donante, sincronía del
ciclo celular donante/ receptora influyen en los resultados de la TN, los
cuales a un resultan en una baja supervivencia de los embriones y los
fetos clonados.

48. Las principales técnicas de clonación son:
- Por separación de blastómeros en los
embriones
-Por transferencia nuclear, que fue
el método utilizado para clonar a la
oveja Dolly.
-Agregación de embriones clonados
para incrementar los resultados de
preñez.
La clonación por TN es hoy una realidad pero aún hay mucho por
investigar en cuanto a incrementar la eficiencia de las técnicas,
resultados de preñez y sobrevida de los fetos producido, así
como trastornos en su desarrollo hasta adultos.

49. Bisección y selección del
citoplasma receptor * *
Pareo celular
1st and 2nd Fusión
Eliminación del cumulus y zona
pelúcida * **
Activación, cultivo
y transferencia

50. Empresas dedicadas a la
clonación comercial de
animales:
CRONOLOGÍA DEL DESAROLLO DE
LA CLONACIÓN ANIMAL
Rana: 1952
Carpa: 1963
Ratón: 1986, 1991 y 2007
Oveja: 1986, de células secundarias, 1995, de células
diferenciadas de un embrión, 1996, Oveja Dolly.1997,
clones trangénicos, Polly y Molly.
Macaco Rhesus: 2000
Cerdo: 2000
Gaur y Bovino 2001, Noah.
Bovino : 2001, 2002,
Gato 2001, 2004, 2007, 2008
Conejo: 2003, Francia y Corea del Norte.
Mula: 2003,
Venado: 2003
Yegua: 2003
Rata: 2003
Perro: 2005
Mosca de fruta: 2007
Camello: 2009
Toro de lidia: 2010

51. Transferencia de genes:
Microinyección citoplasmática de células o fragmentos:
La inyección intracitoplasmáticamente en ovocitos
en metafase II, de células somáticas o frag-
mentos de ellas previa coincubación con ADN
externo y luego al someter los ovocitos a FIV
se pueden lograr embriones que expresen el
transgen. La eficiencia es aceptable pero hay
gran cantidad de mosaicismo.
En la actualidad se están desarrollando trabajos que han logrado
clonar incluso células gaméticas (ovocitos y embriones), lo cual sin
dudas permitirá elevar la eficiencia de la transgénesis disminuyendo el
frecuente mosaicismo encontrado, de forma tal que ambos gametos
puedan portar el transgen deseado.
Las aplicaciones de estas tecnologías están solo limitadas por
nuestras capacidades de imaginación e innovación. Por tales
razones podemos decir que están abiertos nuevos caminos hacia
el futuro.

52. Microinyección de ADN exógeno en los pronúcleos:
Ha demostrado ser útil en especies de importancia
zootécnica, pero presenta dificultades en el bovino
por la baja visualización de los pronúcleos
Transgénesis por clonación (TN): Esta tecnología ha
ido reemplazando a la anterior y se han aprovechado
las células somáticas de los animales transgénicos
para ser estos clonados por TN.
Inyección intracitoplasmática de células ó penetración
con espermios transfectados con ADN foráneo:
Esta técnica posee un alto índice de mosaisismo y
puede que el transgen quede extracromosómico y no
integrarse al ADN del embrión.
Inyección intracitoplasmática de espermatozoides:
Se microinyecta un espermatozoide o una célula trans-
fectada con ADN foráneo, pero es indispensable la
posterior activación para el inicio de las divisiones
ya sea por estímulos físicos o químicos.

53. Vaca clonada con genes humanos produce leche similar a la
materna
“Rosita” provee de leche compuesta con dos proteínas de alta importancia para la
nutrición de los lactantes

54. Empleo de técnicas de Biología
molecular en selección y
mejoramiento
:_
- Marcadores moleculares de resistencia a
enfermedades (
- Marcadores moleculares asociados a
producción (
- Determinación de genes ligados a
características de calidad (terneza y marmoleo)

55. Propiedad privada:
• La Escuela de Medicina ‘John Hopkins (USA), solicitó una patente por
animales diseñados genéticamente para incrementar la masa muscular.
Cubre la propiedad de los animales transgénicos, el proceso de
creación, e incluso los productos alimenticios derivados de ellos.
• La compañía Monsanto solicitó una serie de patentes en más de 160
países, para nuevas técnicas de cruzamiento diseñadas para cerdos
con ciertas frecuencias de genes, y para todos los hatos porcinos y
poblaciones que resulten de ellos.
Propiedad social:
Proyecto de creación de una raza doble
propósito para tierras calientes de
Panamá . (Simgyr).
En desarrollo en el CIBA, FCA-UP.

56. Conclusiones
• El empleo de todas estas biotecnologías reproductivas, va
estar condicionado a la posibilidad de constar con la
infraestructura necesaria y el personal capacitado para
ejecutarlos.
• Resulta indispensable que nos preocupemos realmente por
buscar los fondos requeridos para poder implementar aquellas,
que nuestro sector pecuario necesita en la brevedad posible
para poder enfrentar los retos del presente siglo y finalmente
salir airosos con una ganadería altamente productiva.
• A pesar de disponerse en la actualidad de un gran parque de
biotecnologías reproductivas listas para su empleo en la
producción pecuaria, nos queda mucho por investigar para
elevar sus resultados, hacerlas sostenibles y evitar los
problemas éticos que su aplicación pueden provocar.