Bilogia medica

1. 12/9/22 1
TEMA 2
MÉTODOS PARA ESTUDIAR LAS CÉLULAS

2. 12/9/22 2
n Competencias
Conocer Instrumentación y tecnología para el
estudio de la célula y los tejidos
1- Conocer los Métodos e instrumentos
empleados para realizar análisis
estructurales
2- Conocer los Métodos de observación
directa de células y tejidos
3- Conocer los métodos de aislamiento y
estudio subcelular

3. 12/9/22 3
① Métodos e instrumentos empleados para realizar
análisis estructurales
u Análisis microscópico
« conceptos básicos. Resolución y aumento
« microscopios ópticos
« microscopios electrónicos
« microscopio confocal
« criofractura
« técnicas de análisis de imagen
u Preparación de tejidos para microscopía. Técnica histológica
② Métodos de observación directa de células y
tejidos
③ Fraccionamiento celular y el análisis de sus
moléculas

4. Análisis Microscópico
n Resolución y Aumento
n Límite de resolución:
u distancia mínima entre dos puntos para que puedan
distinguirse como tales
u Fórmula de Abbe: LR=0,61 x longitud de onda / AN
« AN (Apertura Numérica) = n x sena
• n: índice de refracción del medio entre objeto y lente
• a: ángulo de semiapertura de la lente
n Límite de resolución:
u Humano: 100 µm
u Microscopio óptico: 200 nm
u Microscopio electrónico: 0,2 nm
u Microscopio confocal: 1,2 nm
La calidad de la imagen depende del
aumento, contraste y resolución
12/9/22 4
(500 veces >Ojo
(500.000veces >Ojo
(83.333 veces >Ojo

5. 5
PR- Depende de la amplitud del cono de iluminación
PR- 1/LM Angulo de semiapertura de
la lente. 0-1
Indice de refracción del medio
Apertura numérica
LM=
Longitud de onda de la luz
1-1,4 (inmersión)
> PR ➱LM <
1 e= 0,005nm

6. 12/9/22
Sistema mecánico
Sistema óptico
Sistema iluminación
Oculares
Objetivos
Fuente de luz
Condensador
Diafragma
Reostato
Estativo
Cabezal
T.macrométrico
Platina
Revólver
T.micrométrico

7. Microscopio óptico vs electrónico

8. Microscopio óptico vs electrónico

9. • Microscopio óptico
• Microscopio electrónico
• Microscopio confocal
* estereomicroscopio
* compuesto
* transmisión
* barrido
* fluorescencia
* contraste de fases
* luz polarizada
* Interferencial (Nomarsky)
* campo oscuro
* invertido
• Microscopios cuánticos
* M. de Efecto túnel (STM) 1006
• M. de fuerza atómica (AFM)
• 10006

10. 12/9/22 10

11. 12/9/22 11
Tipos de M.0 Estereomicroscopio y M. ordinario

12. 12/9/22 12
http://aperiodemo.leicabiosystems.com/eSlideTrayDemo.ph
p?Slides=839,840,842,843,844,845,846,847,848,849&amp;
amp;TableName=Case
http://aperiodemo.leicabiosystems.com/eSlideTrayDe
mo.php?Slides=839,840,842,843,844,845,846,847,84
8,849&amp;amp;TableName=Case

13. 12/9/22 13
Tipos de M.0 M. invertido
•Observar células en cultivo
•Permite una mejor manipulación

14. 12/9/22 14
Tipos de M.0 M. fluorescencia

15. 12/9/22 15
Tipos de M.0 M. Contraste de fases
Figura 9-7 Biología molecular de la célula, quinta edición (© Garland
Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

16. 12/9/22 16
Tipos de M.0 M. Contraste de fases, C. Oscuro e interferencial
campo claro contraste de fases
contraste interferencial
(Nomarski)
campo oscuro

17. 12/9/22 17
Controles CO2 y
temperatura
Interruptor
microscopio
Invertido
Interruptor
lámpara
fluorescente
Láseres/Prismas
Controlador
(Ganancia PMT,
Pinhole, Eje Z,
zoom,...)
Microscopio
Invertido
Monitorización
de platina (ejes
x/y)
Interruptores
generales
M. Confocal
Tipos de Microscopios

18. 12/9/22 18
Tipos de M.0 M. confocal

19. 12/9/22 19

20. 12/9/22 20
Metastatic breast cancer cells. [National Cancer Institute]

21. 12/9/22 21
high dynamic range fluorescence laser scanning microscopy (HDR-LSM)

22. 12/9/22 22
high dynamic range fluorescence laser scanning microscopy (HDR-LSM)

23. 12/9/22 23
Microscopio multifotón
Permite la generación de imágenes por emisión de fluorescencia con gran profundidad de penetración. Requiere el marcaje
previo de la muestra, ya que se basa en la excitación de un cromóforo de modo simultáneo por dos (o más) fotones
proporcionados por un láser pulsado en régimen de femtosegundos y sintonizable en el rango 690–1040 nm. La energía de
ambos fotones se suma y juntos son capaces de excitar del mismo modo que lo haría un solo fotón con el doble de energía
que uno de estos fotones individuales. Sin embargo, esta multi-excitación tiene la ventaja de ser menos invasiva y
proporciona gran discriminación confocal debido a su origen no lineal
http://wwwuser.cnb.csic.es/~fotonica/Photo
nic_en/Review/multifoton.htm

24. 12/9/22 24
Tipos de M.0 M. E. T.
Tipos de M.0

25. 12/9/22 25
Tipos de M.0 M. E. Barrido

26. 12/9/22 26
Tipos de M.0 M. E. Barrido

27. Criofractura

28. ç microscopio óptico
é microscopio electrónico
de transmisión
ç microscopio electrónico
de barrido (scanning)

29. 12/9/22

30. 12/9/22 30
Técnicas auxiliares
•-Digitalización
•-Procesamiento
•-Análisis
-estereológico
-densitométrico
-reconstrucción 3D
9
8
7
6

31. 12/9/22 31

32. 12/9/22 32
① Métodos e instrumentos empleados para realizar
análisis estructurales
u Análisis microscópico
« conceptos básicos. Resolución y aumento
« microscopios ópticos
« microscopios electrónicos
« microscopio confocal
« criofractura
« técnicas de análisis de imagen
u Preparación de tejidos para microscopía. Técnica histológica
② Métodos de observación directa de células y
tejidos
③Conocer los métodos de aislamiento y
estudio subcelular

33. 12/9/22 33
Preparación de tejidos para microscopía Procesamiento
nFIJACIÓN
nINCLUSIÓN
nCORTE
nTINCIÓN

34. 12/9/22 34
Estudio de células fijadas Fijación
P. químicos
P. Físicos
congelación
calor
alcoholes
aldehídos
Ac. pícrico
desecación

35. 12/9/22 35
Estudio de células fijadas Inclusión
- Compuestos hidrofóbicos
•Parafina
•Plásticos
•Resinas
-Deshidratación gradual
del tejido

36. 12/9/22 36
Estudio de células fijadas Corte
Microtomo
Criostato
M. De congelación
M. De parafina
Vibratomo
Ultramicrotomo

37. Preparación de muestras para MET
Estudio de células fijadas Preparación de muestras para MET

38. 12/9/22 38
Estudio de células fijadas Tinción
nFIJACIÓN
nINCLUSIÓN
nCORTE
nTINCIÓN
* colorantes
* enzimas
HISTOQUÍMICA
Prop. químicas
Prop. físicas
Afinidad
* fluorescencia
* autorradiografía
* Antígeno-Anticuerpo
* Complementariedad bases

39. 12/9/22 39
Estudio de células fijadas Tinción
1- Propiedades ácido- base
Hematoxilina-Eosina
Giemsa

40. 12/9/22 40
Estudio de células fijadas Tinción
2- Específicas de diferentes componentes químicos
DNA
T. Feulgen DAPI

41. Métodos histoquímicos
Sudán (lípidos)
Hierro coloidal
Feulgen (DNA)
PAS (carbohidratos)
Estudio de células fijadas Tinción

42. 12/9/22 42
Estudio de células fijadas Tinción
T. PAS (depósitos de glucógeno) TVan Gieson (tejido conectivo)
Sarcoma de Ewing
Gloméruloesclerosis
Tiñe glucógeno, mucina, glicoproteínas…,

43. 12/9/22 43
Enzimas
HRP
Estudio de células fijadas Tinción
E + S E + P
ES

44. HRP
DAB red. DAB oxidado
O2
O2
+ H2O2 + H2O
HRP
-Visualización de la enzima-
peroxidasa
Visualización directa de Enzimas
Estudio de células fijadas Tinción

45. 12/9/22 45
AChE
Técnica hisoquímica de visualización de acetil colinesterasa

46. 12/9/22 46
Estudio de células fijadas Tinción-m.físicos

47. 12/9/22 47
Precursores radioactivos
Estudio de células fijadas Tinción-m.físicos

48. 12/9/22 48
Fluorescentes
Estudio de células fijadas Tinción-m.físicos

49. 12/9/22 49

50. 12/9/22 50
Estudio de células fijadas Tinción-Ag-Ac

51. 12/9/22 51
indirecto

52. 12/9/22 52
1961:
100 0C o pH>13
Desnaturalización DNA
65 0C Renaturalización DNA
DNA-DNA; RNA-RNA; DNA-RNA
Hibridación
Para localizar fragmentos
específicos se utiliza la
técnica de hibridación de
ácidos nucleicos.
Estudio de células fijadas Complementariedad de bases

53. Hibridación “in situ”
- se basa en la capacidad que tienen
los ácidos nucleicos de hibridarse
(unirse las monocademas que tienen
secuencias de bases
complementarias)
- se utilizan sondas con una
secuencia de bases conocida. Las
sondas están marcadas (en el caso
de la figura es fluorescente)
- sirven para demostrar las
secuencias de ácidos nucleicos
correspondiente a determinados
genes

54. La combinación de métodos permite ver
la realidad de modos diferentes ....
Macrófago fagocitando
bacterias
é Tinción con naranja
de acridina
M. E. de barrido è

55. ....y comprenderla mejor
Células hepáticas con
lisosomas evidentes
é Pigmentos de
lipofucsina. H-E
M.E. Transmisión è

57. Keen and Hudspeth, PNAS 2006
Manuel Castellano Muñoz
The Rockefeller University, Nueva York (EE.UU.)

58. 12/9/22 58
① Métodos e instrumentos empleados para realizar
análisis estructurales
② Métodos de observación directa de células y
tejidos (seminario)
③ Conocer los métodos de aislamiento y estudio
subcelular
u Fraccionamiento subcelular:centrifugación diferencial.
u Citofotometría
u Introducción de compuestos en la célula.
u Registros electrofisiológicos.

59. Centrifugación
diferencial
El precipitado difiere en cada fracción:
ç núcleos, citoesqueleto (fracción
nuclear)
ç mitocondrias, lisosomas, peroxisomas
(fracción mitocondrial)
ç“microsomas” y pequeñas vesículas
(fracción microsomal)
ç ribosomas, grandes moléculas
(fracción ribosómica)

60. 12/9/22 60

61. 12/9/22 61
CITOMETRÍA DE FLUJO

62. 12/9/22 62
Difracción de RX

63. 12/9/22 63
K+
_
K+
_
K+
_
K+
_
K+
_ K+
_
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+ Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Registros intracelulares
Cl
-
Cl
-
Cl
-
Cl
-
Cl
-
Cl
-
Cl
-

64. 12/9/22 64
K+
_
K+
_
K+
_
K+
_
K+
_ K+
_
ESTRICNINA
GLICINA
GABA
Receptor de GABA
Pipeta de registro
Pipeta con GABA
MICROIONTOFORESIS
REGISTRO
GABA
BICUCULINA

65. 12/9/22 65