Tecnología De La Biología Celular Y Molecular (1).pptx

1. Tecnología De
La Biología
Celular Y
Molecular

2. Objetivos
02
Comprender las diferencias
estructurales y funcionales entre
los microscopios óptico y
electrónico
01
Desarrollar la importancia de la
tecnología de la biología celular y
molecular en la carrera de
medicina.
Caracterizar la Citoquímica en la
identificación intracelular de
moléculas.
04
Describir las técnicas de
cromatografía en columna,
electroforesis, radioautografía y
centrifugación en el estudio de
macromoléculas.
05
Comprender el estudio de las
células vivas y los cultivos de
células animales y vegetales
03

3. LA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR ESTUDIA OBJETOS MUY
PEQUEÑOS
“Es el estudio integrado de las células mediante todos los métodos
técnicos disponibles”

4. PREPARACIÓN DE LOS CORTES PARA EL ESTUDIO EN LOS
MICROSCOPIOS ÓPTICO Y ELECTRÓNICO
Fijadores:
 Formaldehído
 Glutaraldehído
 Tetraóxido de osmio** M. Electrónica
M. Óptico
FIJACIÓN:
•Primer paso o etapa para
una preparación
FINES:
•Evitar autólisis
•Prevenir proliferación de
bacterias
•Endurecer las células y
aumentar afinidad por
colorantes.

5. MICROTOMIA
Los tejidos necesitan ser cortados en rodajas finas por MICRÓTOMO.
Para M. Optico el tejido esta incluido en parafina, usa cuchilla de
acero, espesor de 1 a 6 um
Para M. Electrónico el tejido esta incluido en resina tipo epoxi, usa
cuchilla de cristal o diamante (ultramicrótomos), espesor 20 a 100 nm
(0,02 a 0,1 um)

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TINCION
Orgánulos son transparentes
Colorantes básicos (azul de
toluidina, metileno, hematoxilina)
se combina con moléculas acidas
ADN y ARN basófilas
Colorantes ácidos (Eosina, orange
G, fuscina ácida) se combina con
moléculas básicas proteínas
citoplasmáticas, son acidófilas

7. Las principales unidades de medida utilizadas en biología
celular son el micrómetro (µm) y el nanómetro (nm). La
unidad Angstrom (Å) debe sustituirse por el nanómetro.

8. MICROSCOPIO ÓPTICO sirve como soporte
*sistema de
iluminación
*platina
*tubo binocular
PARTE
MECÁNICA:
constituido por
lentes
(condensador,
objetivos y ocular)
Poder de
resolución:
• capacidad de separar
detalles, expresado por
el Límite de resolución.
Límite de
Resolución:
• de las mejores lentes es
de 0.12 um y depende
del objetivo.
Objetivos:
• acromáticos (más
usado), neofluares,
planoacromáticos,
apocromáticos,
planoapocromáticos.
PARTE
ÓPTICA:
Ampliación total= AUM obj. x AUM ocular

9. MICROSCOPIO DE POLARIZACION
Semejante al Microscopio Óptico
Común.
Compuesto de una platina rotatoria,
debajo (polarizador), encima
(analizador).
Sirve para distinguir las sustancias
monorrefringentes de las
birrefringentes a su vez permite
conocer la ordenación interna de las
birrefringentes y su orientación
submicroscópica
Espato de Islandia (nicol)
Polaroides

10. MICROSCOPIO DE POLARIZACION
Cristalinos
• Anisótropos O birrefringentes, la velocidad
de la luz varía según la dirección de
propagación
• Doble refracción, de un único rayo
luminoso resultan dos rayos refractados,
polarizados rectilíneamente
Amorfos
• Isótropos O monorrefringentes, es siempre
igual, independientemente de la dirección
que siga dentro de ellos
• El cuerpo tiene un único índice de
refracción
Polarizador y analizador: secciones cruzadas = AMORFOS
Polarizador y analizador: secciones no cruzadas: CRISTALINOS +/- intensidad
Estudio de estructuras duras:
tejido óseo, dientes, fibras colágenas,
musculares, nerviosas, cilios, flagelos, gotitas
lipídicas, etc.

11. Micrografía de luz polarizada de
fibrocélulas musculares estriadas en
la cual se aprecia el patrón de
bandas y estriaciones transversales.
Micrografía de cartílago hialino visto
con luz polarizada en donde se
aprecia la birrefringencia del
colágeno que forma parte del
pericondrio, correspondiendo a las
estructuras rosadas brillantes.

12. MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE
FASE
Convierte las diferencias de
fase de los rayos luminosos
en diferencias de intensidad
Estudio de células vivas
para visualizar estructuras
celulares aparezcan oscuras
fase positiva o claras en fase
negativa
Observación de células
cultivadas en su crecimiento
y división mitótica
>Densidad= <Vel luz=<IR

13. MICROSCOPIO CONFOCAL
La iluminación se realiza con
un rayo laser y escanea el
corte iluminado y realiza un
verdadero corte óptico.
La imagen es nítida, la célula
puede ser cortada durante la
microscopia y los cortes ser
utilizados de varias maneras.
Almacenar en disco
ordenadores y construir una
imagen tridimensional

14. EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO PERMITIÓ LA VISUALIZACIÓN DE
LAS ESTRUCTURAS CELULARES QUE NO SON VISIBLES AL
MICROSCOPIO ÓPTICO POR CONTAR CON UN PODER RESOLUTIVO
MUCHO MAYOR
Visualización de estructuras
celulares con alto poder
resolutivo
Empleo HACES DE
ELECTRONES.
La radiación visible permite
distinguir detalles de 0,2 µm.
Requieren preparación de
células con: Glutaraldehido
tamponada a un ph de 7,2 y
tetroxido de osmio.
Cortes con ultramicrótomos
usan cuchillas de vidrio o
diamante, espesor de 20 a
100 nm.

15. Coloración positiva:
Contraste con metales
Coloración negativa:
átomos q desvían
electrones
Sombreado: vaporización
de un metal sobre una
estructura de acuerdo a un
ángulo

16. MICROSCOPIO ELECTRONICO
DE BARRIDO (MEB)
Utiliza HAZ DE ELECTRONES
proporciona imágenes
tridimensionales
• Electrones secundarios
Para el estudio de la
superficie de las células
mantenidas en cultivo
• Las muestras no
necesitan ser cortadas
Objetos de 1 cm o más
pueden ser examinados
enteros.
• *Fijación
*Secado
*Cubierta por capa
conductora Au/Pt

17. CITOQUIMICA: INCLUYE DIVERSAS TECNICAS PARA LA
IDENTIFICACION Y LA LOCALIZACION DE LAS MOLECULAS QUE
FORMAN PARTE DE LAS CELULAS
Estudia la localización intracelular de
las diversas sustancias de la célula
Examinados por los microscopio de luz
y electrónico
Se usa un HISTOFOTÓMETRO o
citofotómetro, determina intensidad
del color producido y mide la cantidad
de sustancia analizada.

18. Ley de Lambert-Bear
“Se produce una intensidad de color
proporcional a la concentración de la sustancia
en estudio”

19. CITOQUIMICA
ADN
Reacción de FEULGEN
*Ac clorhidrico= hidrólisis
ARN
*ribonucleasa
*Azul de Toluidina
CATECOLAMINAS
*+formaldehido= Fluorescente
PROTEINAS
*Identificación de aminoácidos
Tirosina: Millon
Triptófano: Diaminobenzeno
Arginina: Sakaguchi
POLISACARIDOS
*Acido periódico Schif (PAS)
*Glucogenolítico
ENZIMAS
*Deshidrogenasas+H tetrazol:
formazan
*fosfatasa ácida-formol+ nitrato de
plomo: fosfato de plomo

20. LA MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA SE APLICA A LAS
TECNICAS CITOQUÍMICAS
Células epiteliales triple
coloración: núcleo (azul),
microtúbulos (verdes),
actina (rojo)
200X
SUSTANCIAS FLUORESCENTES absorben
energía y emiten luz de mayor longitud de
onda.
Compuestos fluorescentes constituyentes
normales de las células: Vit A, Vit B2,
porfirinas.
Aplicación: Combinación con métodos
inmunológicos, estas técnicas usan
anticuerpos conjugados con compuestos
fluorescentes.

21. INMUNOCITOQUIMICA REACCION AG-AC LOCALIZA
MOLECULAS PROTEICAS ESPECIFICAS
Pueden ser:
INDIRECTA
ANTI-GAMMAGLOBULINA
ANTI - AC
MAYOR SENSIBILIDAD
DIRECTA
PEROXIDASA
ESTA TECNICA NO ES SENSIBLE
FERRITINA COMPLEJO PROTEINA A
+ ORO COLOIDAL

22. MACROMOLECULAS: PROTEINAS - ADN -
ARN PUEDEN SER AISLADAS POR
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Mezcla de proteínas disueltas en
agua se hace pasar por la matriz
solida porosa la velocidad de
migración de las proteínas varia
con la interacción con la matriz.

23. INTERACCION DE INTERCAMBIO
IONICO
separación de las proteínas
DEPENDE DE CARGAS
ELECTRICAS + ó -
FILTRACION EN GEL
Proteínas migran
VELOCIDADES VARIABLES DEPENDE DEL
TAMAÑO Y FORMA DE SUS MOLECULAS
INTERACCION HIDROFOBICAS
Las partículas de la matriz
tienen superficie hidrófoba y
retardan la migración de las
proteínas hidrofóbicas.
TIENE ALTA ESPECIFICIDAD
Enzimas y Sustratos
Utiliza para PURIFICACION
DE ANTICUERPOS
INTERACCION DE AFINIDAD
GRADO Y TIPO DE
INTERACCION DE LAS
PROTEINAS CON LA
MATRIZ DE LA COLUMNA

24. ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA
Determina el tamaño de las moléculas
proteicas por disolución, desnaturalización
de las proteínas con SDS y agentes
reductores (mercaptoetanol)
ANALIZAR PROTEINAS

25. RADIOAUTOGRAFIA UTILIZADA PARA ESTUDIAR LOS
SITIOS DE SINTESIS Y EL DESTINO DE LAS
MACROMOLECULAS
Técnicacitoquímicapara
detectarisotoposradiactivos
Permitelocalizaciónde
sustanciasradiactivasen los
tejidos
Se puedeaplicaralmicroscopio
electrónico
De lasdiferentestécnicas
radioautográficaslamás
utilizadaes:TECNICADE
EMULSIONLÍQUIDA
• BROMURO DE PLATA

26. APLICACIONES
El método autorradiográfico ha
sido utilizado para el estudio de
diversos e importantes
fenómenos biológicos.
Síntesis de proteínas
Síntesis de ADN en el núcleo,
mitocondrias y sulfatación de
glucoproteínas en el aparato de
Golgi.
Estudia el ARN

27. SON TECNICAS PARA EL
FRACCIONAMIENTO CELULAR Y
OBTENCIÓN DE ORGANULOS EN
ESTADO DE PUREZA Y PODER
ESTUDIAR SUS PROPIEDADES
QUÍMICAS, FÍSICAS Y BIOLÓGICAS.
CENTRIFUGACION
Fraccionada o diferencial y Contragradiente

28. centrifugación fraccionad ao diferencial
centrifugación contragradiente

29. ESTUDIO DE LAS CELULAS VIVAS Y CULTIVOS DE
CELULAS ANIMALES Y VEGETALES
Las células extraída del cuerpo
de un animal o planta son
estudiadas mientras están
vivas.
Microscopio de
contraste de fase.
Colorantes supravitales
Medios de cultivo: en
frasco o placas,
químicamente definidos
con aminoácidos,
vitaminas, factores de
crecimiento.
Micromanipuladores
Colocadas en
medios
isotónicos, con
uso de:
HETEROCARIONTES

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