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1. FACULTAD: DE INGENIERIA CIVIL Y AMBIENTAL
CURSO: ANALISIS INSTRUMENTAL
TEMA: ELECTROFORESIS
CICLO: VII
PROFESOR: Blog: Santos E. Inoñan chozo
ALUMNO: José Luís Vásquez Alvarado

2. ELECTROFORESIS
 Es una técnica para la separación de moléculas según la
movilidad de éstas en un campo eléctrico.
 La separación puede realizarse sobre la superficie
hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en
papel o en acetato de celulosa), a través de una matriz
porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución
(electroforesis libre).
 Dependiendo de la técnica que se use, la separación
obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las
moléculas y a su masa.
 La electroforesis se usa en una gran mayoría en la
materia del ADN recombinante ya que nos permite saber
la carga que poseen los poli-péptidos, y separar los
diferentes poli-péptidos resultantes de las variaciones del
experimento del ADN recombinante.
 El primer aparato sofisticado de electroforesis fue por
químico alemán Arne Tiselius en 1937.
CONCEPTO:

3. ELECTROFORESIS
los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad,
eficacia, poder de resolución y versatilidad.
Método de separación de:
• Proteínas
• Ácidos nucleicos
• Otras biomoléculas
Permite determinar:
• Peso molecular de una proteína
• Punto isoeléctrico
• Distinguir moléculas por su carga neta o su forma

4. Instrumentos de la electroforesis

5. Principios teóricos:

6. La velocidad de la migración en un sistema electroforético:
Inversamente proporcional a la viscosidad del medio.
Proporcional a la fuerza aplicada al campo.
Proporcional a la carga de la molécula.
Inversamente proporcional al tamaño de la molécula.
Inversamente proporcional al coeficiente de fricción.

7. Factores que afectan a la electroforesis
• En general la electroforesis depende directamente del campo eléctrico y este
depende de distintos parámetros. Basándose en la ley de Ohm se tiene que:
𝑉 = 𝐼𝑅
• Diferencia de potencial (V): define el campo eléctrico; la velocidad de avance es
directamente proporcional a ella.
• Resistencia (R): la movilidad de las moléculas es inversamente proporcional a ella.
• Intensidad (I) : cuantifica el flujo de carga eléctrica, se relaciona directamente con
la distancia recorrida por las moléculas.
• Por último, otro factor que afecta significativamente a la electroforesis es la
temperatura, esta es importante puesto que por el efecto Joule el paso de una
corriente eléctrica va a producir calor y este es directamente proporcional a la
diferencia de potencial y a la resistencia. Por lo tanto, es necesario controlar de
manera estricta la temperatura para que esta no afecte a la muestra
desnaturalizándola.

8. Parámetros que influyen en la movilidad electroforética:
Tenemos:
Parámetros externos
Campo eléctrico
Temperatura
Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema electroforético
Viscosidad
Fuerza iónica
La naturaleza de los iones componentes
El pH
Parámetros relacionados con el suelo
 la carga
La forma y tamaño de los iones

9. a. Papel : En desuso
b. Acetato de celulosa:
Ventajas: presenta poca adsorción, necesita cantidades pequeñas de
muestra, porosidad uniforme, transparente, sin contaminantes y resultados
precisos.
Inconvenientes: débil resolución y electroósmosis. Se ha quedado obsoleta.
c. Gel de agarosa: Es un polisacárido, cuyas disoluciones poseen la propiedad
de permanecer liquidas por encima de 50º C y formar un gel, semisólido al
enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de
fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido.
Ventajas: No presenta fenómenos de adsorción, pequeña cantidad de
muestra, mejor visualización y resolución.
Inconvenientes: electroósmosis.
TIPOS DE SOPORTES:

10. Tipos de electroforesis
• El campo eléctrico se aplica a disoluciones o
suspensiones.
• Históricamente, es el origen de la electroforesis tal y
como hoy la conocemos. Actualmente está en desuso,
ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla.
• Las diferentes proteínas se desplazan a velocidades
diferentes según sus cargas y coeficientes de fricción
respectivos, formándose nubes que se van desplazando
en la disolución tampón y que puede seguirse con
diversos sistemas ópticos, poniéndose de manifiesto las
sustancias que se van separando tiene poco poder de
resolución.
Existen 3 tipos de electroforesis: de frente móvil, zonal y continua.
1.-Electroforesis de frente móvil

11. 2.-Electroforéticos zonales.
• Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en
diferentes campos.
• Son útiles para lograr la separación de mezclas
complejas.
• Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de
proteínas a un soporte sólido, que se impregna con
una solución tampón.
• Los soportes son en general polímeros y forman un
gel poroso que restringe el movimiento de las
moléculas a través del medio durante la electroforesis
y disminuyen los flujos de convección del solvente.
• Como soporte han sido utilizados papel (celulosa),
almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de
celulosa, entre otros.

12. 3.-Electroforesis capilar:
• Es un análisis de sustancias que permiten obtener información precisa acerca
de sus componentes, permitiendo separar e identificar los compuestos químicos
en la muestra determinada.
Constituye una alternativa electroforética de creciente implantación en los
laboratorios clínicos.
• Ventajas:
• Técnica automatizada, ofreciendo resultados reproducibles y precisos.
• Separa cualquier tipo de tamaño: moléculas de alto y bajo PM (al contrario
que la convencional, que solo separa moléculas grandes).
• Utiliza volúmenes muy pequeños de muestra (0.1-10 nL), mientras que la
convencional, utiliza del orden de μL. No requiere el uso de colorantes, ya que
las proteínas se detectan directamente por espectrofotometría.
Resolución muy elevada
• La velocidad de separación es mucho mayor que en la convencional.

13. Electroforesis en acetato de celulosa
• Se usa para la separación y caracterización de proteínas y otras
moléculas.
• El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con
propiedades de adsorción mínimas, por lo que se evita la formación de
colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras
ventajas son:
1) La separación es muy rápida
2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeñas
3) Las tiras pueden hacerse transparentes
4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados
5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos
• Entre sus desventajas figuran que captan poca agua y son más
susceptibles a la evaporación que el papel. Son también más susceptibles
al flujo electro-endosmótico.

14. Electroforesis en gel
• La electroforesis en gel se
utiliza generalmente con
propósitos analíticos, pero
puede ser una técnica
preparativa para purificar
moléculas parcialmente antes
de aplicar espectrometría de
masas, PCR, clonación o
secuenciación de ADN.

15. Esquema de preparación de un gel de electroforesis
horizontal
• Típicamente empleado con agarosa para
correr ácidos nucleicos.
• La placa que se observa se introduce a
continuación en una cubeta rellena de
tampón de electroforesis y conectada a
los electrodos.

16. Tipos de electroforesis en gel
• Se utiliza en biología molecular, genética y bioquímica:
• La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efectúa
en geles de agarosa.
• La electroforesis de proteínas se lleva a cabo en geles de
poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), isoelectroenfoque, geles nativos o
electroforesis bidimensional.
• Electroforesis capilar.
• Electroforesis de ADN.
• Zimografía o zimogramas
• Extracción en gel.

17. Las ventajas de la electroforesis en gel
• En soporte en gel respecto a la electroforesis libre son muy amplias,
así podemos aplicar la muestra desde un origen conocido, el frente de
llegada de las moléculas.
• Es menor en la electroforesis en soporte porque en la libre existe un
gran movimiento aleatorio browniano (ya que las moléculas en
solución tienen energía cinética propia).
• Señalar que en la electroforesis libre el movimiento de las moléculas
se debe a su densidad de carga.
• Mientras que en la electroforesis en soporte en gel, la movilidad
electroforética es por densidad de carga y por tamaño, ya que el gel
forma un tamizado, así permite un mayor poder de resolución.

18. Electroforesis discontinua
Es técnica que se utiliza para conseguir máximas resoluciones.
Consiste en concentrar una fina capa demuestra. El sistema de geles
se prepara en una columna vertical constituida por 3 regiones:
Superior o gel muestra.
Intermedia o gel espaciador( ambos con mayor tamaño de poro y menos
concentrado).
Inferior o gel separador.
• Se preparan en un tampón y a distintos pHs.
• El mayor tamaño de poro permite una mayor movilidad de moléculas
que en el gel separador.
• La baja fuerza iónica crea una resistencia eléctrica mayor, donde el
campo eléctrico es mayor en regiones superiores con lo que
la movilidad es mayor en regiones muestra y espaciador.

19. Electroforesis continua
• Es un método donde el buffer se mueve
perpendicularmente al campo.
• Se usa un solo tipo de gel.
• la muestra se aplica también en una zona pero
se añade continuamente a lo largo del proceso.

20. LA INMUNOELECTROFORESIS
• Es el nombre genérico que reciben un amplio número de métodos
bioquímicos para la separación y caracterización
de proteínas basadas en la electroforesis y la reacción
con anticuerpos.
• Todas las variantes de la inmunoelectroforesis requieren
inmunoglobulinas, anticuerpos que van a reaccionar con las proteínas
que se desea separar o caracterizar.
• Los métodos fueron desarrollados y usados ampliamente durante la
segunda mitad del Siglo XX.

21. Tipos de inmunoelectroforesis
En orden de aparición, los métodos inmunoelectroforéticos fueron:
• Análisis inmunoelectroforético (Inmunoelectroforesis de una
dimensión)
• Inmunoelectroforesis cruzada (Inmunoelectroforesis cuantitativa en
dos dimensiones)
• Inmunoelectroforesis en cohete (Inmunoelectroforesis cuantitativa de
una dimensión)
• Contrainmunoelectroforesis
• Inmunoelectroforesis de afinidad

22. El número de bandas observado en una IEF debe entenderse como el número mínimo de
componentes presentes, es decir, puede haber más componentes que no sean detectados por el
antisuero empleado o que no hayan alcanzado la relación de equivalencia antígeno-anticuerpo
adecuada.
La IEF es una técnica principalmente cualitativa, que se desarrolla en condiciones nativas y es
especialmente apropiada para el análisis de líquidos fisiológicos y extractos celulares. Permite
identificar substancias en mezclas muy complejas y en concentraciones muy bajas. Sin
embargo, requiere que dichas substancias sean inmunogénicas y depende de los anticuerpos
utilizados, por lo que es difícil de estandarizar.
Fases de una inmunoelectroforesis (IEF).

23. Ventajas de inmunoelectroforesis
• puede ser usado para identificar tanto monoclonales como poli
clónales gammapatías.
• La prueba de inmunoelectroforesis es más específico que la
prueba de electroforesis de proteínas y puede identificar
inmunoglobulinas específicas.
Desventaja de inmunoelectroforesis
• Es que los resultados no pueden identificar el nivel exacto de
moléculas de Ig en una muestra, por lo que otro procedimiento,
inmunofijación, se puede utilizar como una alternativa más
sensible.