Bacterias filamentosas EDAR Valencia

Valencia, Diciembre 2013.
Estudio de las relaciones de las bacterias
filamentosas no ramificadas (Microthrix y tipo
0581) formadoras de espumas con los parámetros
Operacionales y Físico- Químicos en una EDAR
de la Comunidad Valenciana.
Trabajo Final de Máster en Ingeniería Ambiental
Realizado por:
-Sergio Tena Sierra
Dirigido por:
-Dr. José Luis Alonso Molina
-Dr. Luis Borrás Falomir

Trabajo Final de Máster Ingeniería Ambiental
2
AGRADECIMIENTOS
“El científico no busca un resultado
inmediato. No espera que sus ideas avanzadas
sean fácilmente aceptadas. Su deber es sentar
las bases para los que vendrán, señalar el
camino” (Nikola Tesla)
En primer lugar dar las gracias a Alba, no solo por su ayuda incondicional en
este trabajo sino por enseñarme lo bonita que puede ser la vida si sabes sonreír y
difrutar de cada instante.
En segundo lugar agradecer a José Luis Alonso y Andrés Zornoza su ayuda y
disposición y lo más importante contagiarme su motivación y su actitud hacia la
investigación.
A Luis Borrás por su ayuda y su disposición.
A la Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad
Valenciana (EPSAR) por facilitar los datos para la realización de este estudio.
A mi familia por sus esfuerzos, sus ánimos y su ayuda.

3
RESUMEN
Las bacterias filamentosas no ramificadas (Microthrix y Tipo 0581) generan
importantes problemas de foaming y bulking, dificultando la operación de las EDAR y
comprometiendo la calidad del efluente. La correcta identificación de estas bacterias es
imprescindible para poder abordar el problema de la forma más eficaz. La gran
similitud morfológica entre Microthrix y Tipo 0581 hace que, mediante microscopía de
contraste de fases, solamente puedan diferenciarse por su diferente respuesta a la
tinción gram (positiva para Microthrix y negativa para Tipo 0581). Por ello, se hace
importante la utilización de técnicas moleculares como FISH para corroborar los
resultados obtenidos mediante la microscopía convencional. En este estudio se lleva a
cabo la identificación y cuantificación de la población de Microthrix y tipo 0581
presentes en el fango activo de la EDAR de la Cuenca del Carraixet (Comunidad
Valenciana) durante un período de un año. Se analiza además la dinámica poblacional
de estas bacterias y las posibles relaciones entre las variables operacionales y físico-
químicas que pueden afectar a su actividad y crecimiento. En el análisis FISH se
emplearon sondas marcadas de ácidos nucelicos del gen 16S rRNA. Actualmente, no
existe una sonda específica para Tipo 0581, de modo que en este estudio se emplea una
sonda a nivel de phylum (para el phylum Chloroflexi, al que pertenece esta bacteria).
No se conoce bibliografía publicada sobre la ecofisiología del Tipo 0581, por lo que se
trata de un campo nuevo de investigación. Por otra parte, dentro del género Microthrix
se ha realizado la identificación de las diferentes especies de las que se dispone de una
sonda específica (M. parvicella y M. calida). Este es el primer estudio que se lleva a cabo
en España en que se identifica M. calida en fangos activos. La abundancia de bacterias
filamentosas en las 46 muestras de fango activo se midió de acuerdo con la escala
subjetiva de Eikelboom, donde las observaciones se clasifican en una escala de 0
(ninguno) a 5 (crecimiento abundante). En todas las muestras se observaron bacterias
filamentosas de los grupos objeto de estudio. Los valores para la sonda de Microthrix
son máximos (IF=5) desde la primera muestra (del día 10/12/08) hasta la muestra del
día 08/07/09, a partir de la cual disminuyen al tiempo en que empieza a detectarse el
morfotipo 0581. En muchos casos, el resultado de la sonda general de Microthrix
coincide con el de las sonda de M. parvicella, lo que indica que es este el morfotipo
filamentoso más abundante dentro del género Microthrix. Siendo Microthrix calida la
que resulta en abundancias menores, aunque está presente en la mitad de las muestras.
Los resultados del análisis estadístico revelan un comportamiento diferente entre las
especies dentro del género Microthrix y entre estas, y el Tipo 0581. Esta dinámica
poblacional está influenciada sobre todo por la temperatura, el nivel de oxígeno
disuelto, la carga de aceites y grasas, y de ácidos grasos volátiles. El Tipo 0581 presenta
necesidades diferentes a las de la mayoría de bacterias del género Microthrix para los
diferentes parámetros, esto explica el hecho de que sus máximas abundancias no
coincidan en el mismo tiempo y espacio en la EDAR.

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LISTADO DE ACRÓNIMOS
ACC Análisis de correspondencias canónicas
ACP Análisis de componentes principales
AG Aceites y Grasas
AGV Ácidos Grasos Volátiles
CM Carga Másica
DBO Demanda Biológica de Oxígeno
DNA Ácido desoxirribonucleico
DQO Demanda Química de Oxígeno
EDAR Estación Depuradora de Aguas Residuales
EF Edad del Fango
EPS Sustancias Poliméricas Extracelulares
EPSAR Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales
FISH Hibridación in situ con sondas fluorescentes
he habitante equivalente
IF índice de filamentos
IVF Índice volumétrico de Fango
LAO Organismo Acumulador de Lípidos
LCFA Ácidos grasos de cadena larga
OD Oxígeno Disuelto
PAO Bacterias Acumuladoras de Polifosfato
SSLM Sólidos Suspendidos del Licor Mezcla
SSVLM Sólidos Suspendidos Volátiles del Licor Mezcla
TRH tiempo de retención hidráulico

5
ÍNDICE
1.- INTRODUCCIÓN..................................................................................................12
1.1.- Características de las aguas residuales.............................................................12
1.2.- Tratamiento de las aguas residuales.................................................................15
1.2.1.- Fangos activos ...........................................................................................15
1.2.2.- El flóculo ...................................................................................................16
1.2.3.- Problemas de separación en los fangos activos originados por
microorganismos.................................................................................................17
1.3.- Parámetros operacionales del proceso de depuración ......................................18
1.4.- Importancia de las bacterias filamentosas ........................................................19
1.4.1.- Candidatus Microthrix parvicella................................................................19
1.4.2.- Candidatus Microthrix calida......................................................................22
1.4.3.- Tipo 0581...................................................................................................24
1.5.-Identificación de morfotipos filamentosos ........................................................25
1.5.1.- Microscopía convencional..........................................................................25
1.5.2.- Técnica FISH para la identificación de bacterias filamentosas....................27
2.- OBJETIVOS............................................................................................................29
3.- MATERIAL Y MÉTODOS......................................................................................30
3.1.- Descripción de la EDAR...................................................................................30
3.2.- Muestreo..........................................................................................................31
3.3.- Variables físico-químicas y parámetros operacionales......................................31
3.4.- Hibridación in situ con sondas marcadas con fluoróforos (FISH).....................32
3.4.1.- Preparación de reactivos para FISH...........................................................32
3.4.2.- Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón ................................33
3.4.3.- Aplicación de las muestras a los portaobjetos ............................................34
3.5.- Sondas utilizadas.............................................................................................34
3.6.- Hibridación “in situ” .......................................................................................35
3.7.- Observación al microscopio .............................................................................36
3.8.- Técnicas de Análisis Estadístico para muestras ambientales ............................38
3.8.1.- Análisis bivariante.....................................................................................38
3.8.2.- Análisis Multivariante ...............................................................................40

6
4.- RESULTADOS.......................................................................................................42
4.1.- Cuantificación e identificación de bacterias filamentosas del género Microthrix y
Tipo 0581.................................................................................................................42
4.1.1.- Microscopía convencional..........................................................................42
4.1.2.- Técnica molecular FISH .............................................................................44
4.2.- Comparación microscopía convencional-FISH.................................................49
4.3.- Análisis estadístico entre las bacterias filamentosas del género Microthrix y el
Tipo 0581 y los parámetros operacionales y físico-químicos....................................55
4.3.1.- Análisis Bivariante. Coeficiente de correlación de Spearman .....................56
4.3.2.- Análisis Multivariante. Análisis de correspondencias canónicas................64
5.- DISCUSIÓN...........................................................................................................76
5.1.- Técnica convencional versus FISH ...................................................................76
5.2.- Dinámica poblacional ......................................................................................77
5.3.- Variables del afluente ......................................................................................79
5.4.- Variables del licor mezcla ................................................................................80
5.5.- Variables operacionales ...................................................................................82
6.- CONCLUSIONES ..................................................................................................85
7.- BIBLIOGRAFIA .....................................................................................................86
ANEXO I. Relación de las fechas de muestreo. ...........................................................90
ANEXO II. Parámetros físico-químicos y variables de estudio....................................91
ANEXO III. Variables físico-químicas y operacionales utilizadas en el análisis
estadístico...................................................................................................................93
ANEXO IV. Preparación de los reactivos para la técnica FISH ....................................95

7
INDICE DE ECUACIONES
Ecuación 1. Cálculo del coeficiente lineal de Pearson. .................................................38
Ecuación 2. Cálculo del coeficiente de correlación de Spearman. ................................39

8
INDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Volumen de Agua Depurada. EPSAR, 2012 ................................................13
Gráfico 2. Índice de Filamentosa de Microthrix en la linea A+B...................................49
Gráfico 3. Índice de filamentosa de Microthrix convencional y sonda general en la linea
A+B.............................................................................................................................50
Gráfico 4.Índice de filamentosa de Microthrix en la linea C+D....................................51
Gráfico 5. Índice de filamentosa de Microthrix convencional y sonda general en la linea
C+D ............................................................................................................................52
Gráfico 6.Índice de filamentosa de tipo 0581 en la línea A+B.......................................53
Gráfico 7.Índice de filamentosa de tipo 0581 en la línea C+D ......................................53
Gráfico 8. Comparativa de Microthrix frente al tipo 0581 en la línea A+B....................54
Gráfico 9.Comparativa de Microthrix frente al tipo 0581 en la línea C+D. ...................54
Gráfico 10. Análisis canónico de correspondencia para las bacterias filamentosas
estudiadas y variables del afluente de la línea A+B de la EDAR Carraixet. .................65
estudiadas y variables del afluente de la línea C+D de la EDAR Carraixet. .................66
estudiadas y variables del afluente del conjunto de ambas líneas de la EDAR Carraixet.
...................................................................................................................................67
Gráfico 13.Gráfico de análisis canónico de correspondencia para las bacterias
filamentosas estudiadas y variables del licor mezcla de la línea A+B de la EDAR
Carraixet.....................................................................................................................68
estudiadas y variables del licor mezcla de la línea C+D de la EDAR Carraixet............69
Gráfico 15.Análisis canónico de correspondencia para las bacterias filamentosas
estudiadas y variables del licor mezcla del conjunto de ambas líneas de la EDAR
Carraixet.....................................................................................................................70
estudiadas y variables operacionales de la línea A+B de la EDAR Carraixet. ..............71
estudiadas y variables operacionales de la línea C+D de la EDAR Carraixet. ..............72
estudiadas y variables operacionales del conjunto de ambas líneas de la EDAR
Carraixet.....................................................................................................................73

9
INDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1.hipótesis de utilización de LCFA por M.parvicella en plantas de fangos
activos con alternancia de fases anaerobia-aerobia. Nielsen et al., 2002.........................22
Ilustración 2.Árbol filogenético del género Microthrix. Levantesi et al., 2006. ...............23
Ilustración 3. Línea de tratamiento de agua y fango de la EDAR del CARRAIXET.
EPSAR........................................................................................................................30
Ilustración 4.Esquema simplificado del proceso de hibridación in situ con sondas
marcadas con fluoróforos............................................................................................32
Ilustración 5. Pasos a realizar para la fijación de muestras según su pared celular. .....33
Ilustración 6. Índice de filamentosas ...........................................................................37
Ilustración 7.Matriz de covarianzas ACC....................................................................40
Ilustración 8: Imágenes con contraste de fases. A la izquierda Microthrix, a la derecha
Tipo 0581. Aumento 1000x. Se observa la similitud morfológica entre ambas bacterias.
...................................................................................................................................43
Ilustración 9: Imágenes con contraste de fases de la reacción a la tinción Gram. A la
izquierda Microthrix, gram positiva; a la derecha Tipo 0581, gram negativa. Aumento
1000x. Mediante la tinción Gram es posible diferenciar estas bacterias por microscopía
convencional...............................................................................................................43
Ilustración 10.A la izquierda vista convencional y a la derecha FISH con la sonda
GNSB941+CFX1223 del mismo campo de la muestra. En el caso de la imagen FISH sí
puede apreciarse la presencia de los filamentos dentro del flóculo. Aumento: 1000x. .44
Ilustración 11.A la izquierda vista con contraste de fases y a la derecha vista FISH del
mismo campo con la sonda MPAall-1410. Aumento: 1000x.........................................45
Ilustración 12.Árbol filogenético del phyllum Actinobacteria. Nielsen et al,2008.........45
Ilustración 13.árbol filogenético del phyllum Chloroflexi. Nielsen et al, 2008..............46

10
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Composición típica de A. Residual doméstica................................................12
Tabla 2. Concentraciones medias de entrada y de salida de las depuradoras y
rendimientos medios de depuración obtenidos en la Comunidad Valenciana.........13
Tabla 3. Límite de vertido. MAGRAMA 2012. .............................................................14
Tabla 4.Límites adicionales de vertido en zonas sensibles. MAGRAMA, 2012. ............14
Tabla 5.Problemas típicos en los fangos activos causados por microorganismos. Fuente:
Ferrer, J. y Seco, A., 2007. ...........................................................................................18
Tabla 6. Ventajas de la técnica FISH. ...........................................................................28
Tabla 7.Limitaciones de la técnica FISH. .....................................................................28
Tabla 8. Ficha técnica de la instalación. Fuente: EPSAR...............................................31
Tabla 9. Sondas utilizadas...........................................................................................35
Tabla 10. : Solución de hibridación según porcentaje de formamida. ..........................35
Tabla 11. Solución de lavado según porcentaje de formamida.....................................36
Tabla 12. Escala de valoración de organismos filamentosos. .......................................37
Tabla 13, Valores mínimos y máximos (rango), media y desviación estándar de la
abundancia de las bacterias identificadas por microscopía convencional en la línea A+B
de la EDAR Carraixet..................................................................................................42
Tabla 14. Valores mínimos y máximos (rango), media y desviación estándar de la
abundancia de las bacterias identificadas por microscopía convencional en la línea C+D
Tabla 15. Valores mínimos y máximos (rango), media y desviación estándar de
abundancia de las bacterias identificadas por microscopía convencional en el conjunto
de las dos líneas de agua de la EDAR Carraixet. .........................................................43
Tabla 16: Resultados de abundancia con las diferentes sondas FISH para las dos líneas
Tabla 17. Valores mínimos y máximos (rango), media y desviación estándar de las
sondas hibridadas en las muestras de la línea A+B en la EDAR Carraixet...................48
sondas en la EDAR Carraixet Línea C+D.....................................................................48
sondas en el conjunto de las dos líneas de agua de la EDAR Carraixet........................49
Tabla 20. Correlaciones Spearman entre las bacterias filamentosas estudiadas y los
parámetros físico-químicos del afluente......................................................................57
Tabla 21.Correlaciones Spearman entre las bacterias filamentosas estudiadas y los
parámetros físico-químicos del licor mezcla................................................................59
Tabla 22.Correlaciones Spearman entre las bacterias filamentosas estudiadas y los
parámetros operacionales. ..........................................................................................61
Tabla 23.Relación de muestras estudiadas ..................................................................90
Tabla 24. Listado de los parámetros físico-químicos del afluente. ...............................91

11
Tabla 25.Listado de los parámetros físico-químicos del licor mezcla. ..........................92
Tabla 26.Listado de los parámetros operacionales.......................................................92
Tabla 27. Media, desviación estándar (SD) y rango (mínimo-máximo) de los
parámetros físico-químicos del afluente......................................................................93
parámetros físico-químicos del licor mezcla................................................................93
parámetros operacionales. ..........................................................................................94

12
1.- INTRODUCCIÓN
1.1.- Características de las aguas residuales
El agua es un recurso fundamental en el desarrollo de la vida, por lo que la
conservación de su calidad debe de constituir uno de los principales objetivos de esta
sociedad. Por ello, tras su utilización, tanto en los hogares como en las industrias, ha
de someterse a un proceso de depuración que le devuelva la calidad necesaria para
poder volver al medio natural sin perjudicarlo.
Para llevar a cabo el proceso de depuración del agua se dispone de una
completa infraestructura con una red de alcantarillado y colectores a través de los
cuales el agua es conducida a las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales
(EDAR), donde se les aplica el correspondiente tratamiento.
Las principales características de las aguas residuales domésticas son:
Tabla 1. Composición típica de A. Residual doméstica.
Concentración (mg/l)
Fuerte Media Débil
Sólidos totales 1200 720 350
Sólidos disueltos totales 850 500 250
Fijos 525 300 145
Volátiles 325 200 105
Sólidos Suspendidos totales 350 220 100
Fijos 75 55 20
Volátiles 275 165 80
Sólidos Sedimentables (ml/l) 20 10 5
Demanda Bioquímica de Oxígeno,
5 días 20ºC (DBO5, 20º)
400 220 110
Carbono Orgánico Total (CCT) 290 160 80
D.Q.O. (Demanda Química de
Oxígeno)
1000 500 250
Nitrógeno total como N2 85 40 20
Nitrógeno Orgánico 35 15 8
Amoniaco Libre 50 25 12
Nitritos 0 0 0
Nitratos 0 0 0
Fósforo (total como P) 15 8 4
Orgánico 5 3 1
Inorgánico 10 5 3
Cloruros 100 50 30
Alcalinidad (como CaCO3) 200 100 50
Aceites y grasas 150 100 50
Fuente: Metcalf and Eddy,2000.

Trabajo Final de Máster
Situación en la Comunidad Valenciana
A partir del informe de gestión de la EPSAR (Entidad Pública de Saneamiento
de Aguas Residuales) del año 2012 se extrae la información relativa al tratamiento de
aguas residuales en la Comunidad Valenciana: en la actualidad se encuentran en
funcionamiento un total de 458 EDAR, tratando un volumen total de 450,16 hm
agua, que corresponde a 6.126.617 habitantes equivalentes (he). El coste por metro
cúbico de agua tratada es de 0.33 euros. A continuación se muestra una gráfica con la
evolución del volumen de agua tratada en los últimos 19 años:
Gráfico
Como puede observarse ha tenido lugar un incremento en la cantidad de agua
tratada, aunque no de forma regular, en estos 19 años. Aunque en los últimos años se
observa una disminución en la
el actual contexto de crisis económica en que ha disminuido el número de industrias y,
por lo tanto, el volumen de aguas residuales generadas por las mismas, afectando al
total global.
En la siguiente tabla se muestran los valores medios de la concentración de
algunos parámetros así como de los rendimientos de depuración:
Tabla 2. Concentraciones medias de entrada y de salida de las depuradoras y rendimientos medios de
depuración obtenidos en la Comunidad Valenciana
Parámetro SS
Entrada (mg/l) 260
Salida (mg/l) 8
Rendimiento (%) 96
(1)Valor límite establecido en la Directiva del Consejo 91/271 CEE.
0
100
200
300
400
500
600
1993
1994
1995
1996
hm3/año
Volumen de agua depurada
Ingeniería Ambiental
Situación en la Comunidad Valenciana
en la Comunidad Valenciana: en la actualidad se encuentran en
funcionamiento un total de 458 EDAR, tratando un volumen total de 450,16 hm
evolución del volumen de agua tratada en los últimos 19 años:
Gráfico 1. Volumen de Agua Depurada. EPSAR, 2012
observa una disminución en la cantidad de agua depurada, que puede relacionarse con
tabla se muestran los valores medios de la concentración de
algunos parámetros así como de los rendimientos de depuración:
. Concentraciones medias de entrada y de salida de las depuradoras y rendimientos medios de
depuración obtenidos en la Comunidad Valenciana.
Límite SS(1) DBO5(1) Límite DBO5(1) DQO
300 572
≤35 8 ≤25 33
≥90 97 ≥70 93
(1)Valor límite establecido en la Directiva del Consejo 91/271 CEE. EPSAR 2012.
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
Año
Volumen de agua depurada
13
en la Comunidad Valenciana: en la actualidad se encuentran en
funcionamiento un total de 458 EDAR, tratando un volumen total de 450,16 hm3
de
cantidad de agua depurada, que puede relacionarse con
tabla se muestran los valores medios de la concentración de
. Concentraciones medias de entrada y de salida de las depuradoras y rendimientos medios de
Límite DQO
≤125
≥75
EPSAR 2012.
2009
2010
2011
2012

14
Legislación relativa a las aguas residuales
La legislación que hace referencia a las aguas residuales y a su tratamiento es:
Directiva 91/271/CEE cuyo objetivo es proteger el medio ambiente de los efectos
negativos de los vertidos de las aguas residuales urbanas y procedentes de algunos
sectores industriales. Fue modificada por la Directiva 98/15/CE, en la que se
establece la obligación de disponer de sistemas colectores y tratar las aguas
residuales, así como los límites de vertido de los contaminantes procedentes de
EDAR. Además, indica los plazos para construir depuradoras y los tamaños de las
poblaciones que deben de contar con una. Asimismo establece mecanismos y
frecuencias de muestreo y análisis de las aguas residuales, basando el control en
los siguientes parámetros: sólidos en suspensión, DBO5, DQO, fósforo y nitrógeno.
Directiva 2000/60/EC del Parlamento Europeo, cuyo objetivo es proteger el estado
ecológico de las masas de agua continentales, aguas de transición, aguas costeras y
aguas subterráneas.
La Directiva 91/271/CEE fue transpuesta al ordenamiento español a través del
Real Decreto Ley 11/1995 de 20 de Diciembre, en el se definen los criterios para la
clasificación de los puntos de vertido en “zona sensible” y “zona menos sensible” de
los cuales dependen los requisitos de vertido. Este Real Decreto fue desarrollado por el
Real Decreto 509/1996, modificado por el Real Decreto 2116/1998, en el que se
desarrolla la normativa aplicable para el control de las aguas residuales urbanas en
España. En las siguientes tablas se recogen los requisitos de vertido mencionados
anteriormente:
Tabla 3. Límite de vertido. MAGRAMA 2012.
Tabla 4.Límites adicionales de vertido en zonas sensibles. MAGRAMA, 2012.
Concentración Porcentajes de Reducción
DBO5 25 mg/l de O2 70-90 %
DQO 125 mg/l de O2 75 %
Sólidos en suspensión 35 mg/l 90 %
Concentración Porcentajes de Reducción
h-e<100.000 P total 2 mg/l 80 %
N Total 15 mg/l 70-80 %
h-e>100.000 P Total 1 mg/l 80 %
N Total 10 mg/l 70-80 %

15
1.2.- Tratamiento de las aguas residuales
Una EDAR se encuentra habitualmente compuesta por las siguientes etapas de
tratamiento en serie (Bouzas, 2010):
Pretratamiento: separación de materiales voluminosos (mediante enrejados y
tamices), de arenas (mediante un desarenador) y de aceites y grasas (mediante una
trampa de grasas). Se eliminan los materiales que pueden perjudicar instalaciones
posteriores (por ejemplo: obstruyendo bombas, etc.).
Tratamiento primario: eliminación de materia en suspensión y de los
contaminantes asociados.
Tratamiento secundario o biológico: eliminación de materia orgánica
biodegradable por la acción de la biomasa presente.
Tratamientos avanzados o terciarios: eliminación de patógenos así como de parte
de los contaminantes que no se hayan eliminado en etapas anteriores (materia
orgánica, sólidos suspendidos, nitrógeno y fósforo).
1.2.1.- Fangos activos
Existen diferentes tipos de tratamientos para las aguas residuales, la elección de
uno u otro está en función, sobre todo, de las características del agua y de la exigencia
de calidad del efluente.
El tipo de tratamiento más utilizado es el de fangos activos, desarrollado en
1913-1914 en Inglaterra por Mr. Edward Ardern y Mr. William Lockett. Se trata de un
tratamiento biológico de cultivo en suspensión donde una masa activa de
microorganismos se encarga de estabilizar un residuo orgánico por vía aerobia (García,
1996). Con la siguiente reacción se representa el mecanismo de depuración en este tipo
de sistemas:
Materia orgánica + Microorganismos + O2 → Microorganismos + CO2 + H2O + Energía
Las etapas del tratamiento biológico son: oxidación biológica (en el reactor
biológico con aireación mecánica), separación (habitualmente por gravedad en un
decantador) y recirculación de parte de los lodos al reactor biológico para conseguir el
tiempo de retención celular necesario, asegurando la efectividad del tratamiento.
Este tratamiento supone el desarrollo de un cultivo microbiológico capaz de
degradar y flocular la materia orgánica presente en el agua residual (González, et al.,
2006).

16
1.2.2.- El flóculo
El flóculo es la unidad ecológica y estructural de los fangos activos. Se
encuentra formado por una población heterogénea de microorganismos, que cambia
continuamente con el tiempo como respuesta a la variación de la composición del agua
residual y a las condiciones ambientales y operacionales (Soddell y Seviour, 1990).
Para que el proceso de depuración sea llevado a cabo con éxito, en el tanque de
aireación o reactor biológico debe formarse un flóculo con el tamaño suficiente para
soportar las turbulencias del agua del sistema de agitación y sedimentar
posteriormente en el decantador secundario, para obtener un sobrenadante fluido y
claro.
Los microorganismos del flóculo se mantienen unidos gracias a una matriz
extracelular de naturaleza variable, que contiene material polisacárido, altos niveles de
proteínas, DNA y sustancias húmicas y fúlmicas (Kerley y Foster, 1995; Frölund et al.;
1995). Estos polímeros extracelulares (EPS) son segregados por las denominadas
bacterias formadoras de flóculos.
Estos agregados están formados por microorganismos (bacterias, hongos,
protozoos y algún metazoo), materia inorgánica y orgánica (≈ 60-90% de la misma es
volátil) y pueden alcanzar tamaños de entre 0,05 y 1,0 mm. Además de bacterias
formadoras de flóculos, también se encuentran bacterias filamentosas que, aunque no
contribuyen a la formación del flóculo, en pequeñas proporciones dan fuerza a su
estructura para evitar su disgregación. Las bacterias filamentosas actúan como un
entramado que da consistencia al flóculo de manera que se pueden formar flóculos
grandes y compactos que resisten la turbulencia del sistema de agitación. La presencia
moderada de filamentos también ayuda a capturar y mantener atrapadas pequeñas
partículas durante la sedimentación.
A continuación se citan los microorganismos que forman la estructura del
flóculo:
Las bacterias, que comprenden el 95% de la biomasa. Principalmente
intervienen en la eliminación de materia orgánica y en la eliminación de
nutrientes. Además, tanto las bacterias formadoras de flóculo como las
filamentosas son imprescindibles para la correcta sedimentación del fango y la
consecuente obtención de un efluente clarificado y de calidad.
El segundo grupo más numeroso son los protozoos, constituyendo el 5% de la
biomasa. Son necesarios en los fangos activos ya que eliminan coliformes y
patógenos, además de otras bacterias, ayudando a clarificar el efluente y
contribuyen a la floculación de la biomasa (Ferrer y Seco, 2007).

17
Además podemos encontrar, aunque en raras ocasiones, hongos que pueden
proliferar, pero que no suelen competir con las bacterias por la utilización de
materia orgánica disuelta, por tanto no se consideran relevantes para el proceso
de depuración.
Las algas son organismos fotosintéticos y el papel que pueden jugar en los
sistemas de depuración es el de proporcionar oxígeno en los sistemas
extensivos. Pero hay que tener en cuenta que, al tratarse de organismos
autótrofos no consumen materia orgánica, si no que incrementan su contenido
(Ferrer y Seco, 2007).
El último grupo son los metazoos, como los rotíferos, que junto con los
nematodos, constituyen la cima de la cadena trófica en el sistema de fangos
activos. Elevadas cantidades de rotíferos en el sistema indican una alta edad del
fango.
Existen dos niveles de estructura en los flóculos del fango activo (Sezgin et al.,
1978):
Microestructura: la confieren procesos de agregación microbiana y
biofloculación. Esta es la base de la formación del flóculo.
Macroestructura: la proporcionan microorganismos filamentosos. Estos
organismos forman una red o espina dorsal sobre la que se fijan los flóculos
dando lugar a flóculos más grandes y resistentes.
Cuando las bacterias formadoras del flóculo y las filamentosas crecen en
equilibrio se forma el flóculo ideal, que es compacto, denso, grande y sedimenta bien,
permitiendo obtener un sobrenadante claro y un fango concentrado. En cambio, si se
produce un crecimiento masivo de filamentosas se impide el acercamiento de los
flóculos, dificultando su compactación y sedimentación, esto se conoce como
hinchazón de fangos o “Bulking”. Si, por el contrario, la proporción de filamentosas es
demasiado baja los flóculos son pequeños y débiles por lo que no sedimentan bien,
dando lugar a un sobrenadante turbio, esta situación se denomina “flóculo punta de
alfiler”, en el siguiente apartado se explican los diferentes problemas que pueden darse
cuando no se produce ese equilibrio en el crecimiento de las bacterias.
1.2.3.- Problemas de separación en los fangos activos originados por
microorganismos
En la mayoría de EDAR se produce la separación de los sólidos del agua tratada
mediante sedimentación en un decantador. Este proceso puede presentar importantes
problemas, comprometiendo la calidad del efluente, y se deben principalmente a fallos
en la formación de la microestructura o de la macroestructura del flóculo. En la
siguiente tabla se describen los diferentes problemas que se pueden dar:

18
Tabla 5.Problemas típicos en los fangos activos causados por microorganismos. Fuente: Ferrer, J. y Seco,
A., 2007.
Crecimiento disperso No se produce la biofloculación, por lo que los microorganismos
quedan dispersos, dando lugar a un efluente turbio.
“Bulking” viscoso Fallo en la microestructura por un exceso de polímeros
extracelulares. Los microorganismos aparecen entre grandes
cantidades de materia extracelular, lo que confiere al fango
activo una consistencia gelatinosa, produciéndose problemas de
compactación y sedimentación.
Flóculo punta de alfiler Fallo en la macroestructura por ausencia o baja proporción de
microorganismos filamentosos. Los flóculos son frágiles
produciéndose ruptura de los mismos, por lo que no sedimentan
y salen con el efluente.
“Bulking” filamentoso Fallo en la macroestructura por un exceso de microorganismos
filamentosos impidiendo la compactación y sedimentación de los
flóculos.
“Foaming” o formación de
espumas
Normalmente asociado a bacterias filamentosas, como Nocardia
spp y Microthrix parvicella. La hidrofobicidad de estos
microorganismos hace que grandes cantidades de sólidos del
fango activo floten formando espuma en la superficie de los
elementos del tratamiento, pudiendo salir con el efluente.
1.3.- Parámetros operacionales del proceso de depuración
Los parámetros más utilizados para el control de las depuradoras de aguas
residuales son la carga másica (CM) y la edad del fango (EF) (Zornoza et al., 2011).
La carga másica es un parámetro con el que se representa la relación existente
entre la carga orgánica alimentada al reactor y los microorganismos presentes en él.
Dada la dificultad de cuantificar los microorganismos presentes, suele definirse como
la relación entre la DBO5 y los sólidos suspendidos volátiles del licor mezcla diarios en
el reactor, o incluso puede definirse relacionando dicha DBO5 con los sólidos
suspendidos totales del licor mezcla, por ello es muy importante al hablar de carga
másica establecer a qué concentración de sólidos está referida (Ferrer y Seco, 2007).
La edad del fango relaciona la masa de fango en el reactor con la masa de
fangos eliminada diariamente, por lo que depende principalmente del régimen de
purgas. Para la determinación de ambos parámetros es necesario tener en cuenta la
inercia del sistema de fangos activos, es decir, la inercia de las poblaciones microbianas
y la estructura flocular. Ambos parámetros han estado relacionados de forma
proporcional e inversa, pero recientemente se ha demostrado que esta relación no
siempre tiene lugar en una EDAR a escala real (Zornoza et al., 2011).

19
1.4.- Importancia de las bacterias filamentosas
En todos los tipos de EDAR con procesos de fangos activos están presentes las
bacterias filamentosas y se ha demostrado que son responsables de la mayoría de
problemas de bulking y foaming (Jenkins et al., 2003; Seviour y Nielsen, 2010). La
excesiva abundancia de estas bacterias puede producir problemas en la operación de la
planta y actualmente no existe una estrategia universal que permita limitar o prevenir
este comportamiento (Eikelboom, 2000; Jenkins et al., 2003; Kragelund et al., 2010).
Se han identificado más de 30 morfotipos filamentosos en EDAR de aguas
residuales urbanas (EIkelboom, 2000). En plantas que reciben agua de origen industrial
este número es todavía mayor (Eikelboom y Geurkink, 2002; Eikelboom, 2006).
Las bacterias filamentosas están involucradas en la degradación de la materia
orgánica, son por tanto un miembro más de la comunidad biológica de los fangos
activos.
Las bacterias filamentosas que con más frecuencia generan problemas de
bulking son Alphaproteobacteria (“Nostocoida”-like), Gammaproteobacteria (Thiothrix y
Tipo 021N), Actinobacteria (Candidatus “Microthrix”, Mycolata) y Chloroflexi (Tipo 1851,
Tipo 0041 y Tipo 0092) (Nielsen et al., 2008). Además, M. parvicella y Nocardia son los
tipos de filamentosas que más comúnmente producen fenómenos de foaming, junto
con otros tipos de filamentosas como son Nostocoida Limicola II, III, Tipo 021N, Tipo
0092, Tipo 0041/0675, Tipo 0581 y Tipo 0803 (Aygun, et al., 2013).
A continuación se describen los microorganismos filamentosos objeto de este
estudio: Candidatus Microthrix parvicella, Candidatus Microthrix calida y Tipo 0581.
1.4.1.- Candidatus Microthrix parvicella
Microthrix parvicella es un filamento muy común en los fangos activos, estando
presente en diferentes condiciones de operación y en distintas configuraciones de la
planta. Son muchos los estudios que han demostrado que este organismo se relaciona
frecuentemente con los problemas de bulking y foaming (Jenkins et al., 2003; Wanner
et al., 1994; Martins et al., 2003). Pasveer (1969) fue el primer investigador en describirlo.
Esta bacteria solamente se ha detectado en fangos activos, ya que otras bacterias
similares a Microthrix parvicella presentes en ambientes como sedimentos marinos,
suelos y ambientes marinos presentan menos de un 92% de similitud en la secuencia
16S rRNA, por lo que solo están lejanamente relacionadas con Microthrix (Rossetti et al.,
2005).

20
Morfología
Se trata de un filamento largo (longitud 100-400 µm), fino (diámetro 0,6-0,8
µm), no ramificado y sin vaina, ni septos visibles, que no presenta movimiento. No
suele tener crecimiento adherido y puede encontrarse libre en la fase líquida, dentro de
los flóculos o alrededor de los mismos, aunque normalmente está dentro del flóculo. Su
apariencia enrollada y su reacción Gram positiva hacen que sea fácil de reconocer
mediante microscopio. Además, presenta filamentos con gránulos que tienen una
reacción gránulo-Neisser fuertemente positiva (Zornoza et al., 2006). A pesar de ello,
hay que tener en cuenta que la morfología de esta bacteria varía en función de los
sustratos utilizados (Zonronza et al., 2006). Este polimorfismo está muchas veces
relacionado con la capacidad de adaptación de la especie (Margalef, 1998) y hace que
puedan existir variantes de esta bacteria que en realidad sean la misma especie,
definidas por Eikelboom como “distintos ecotipos”.
Taxonomía
Debido a la falta de una caracterización fenotípica detallada, M. parvicella no es
un nombre taxonómicamente válido. Por lo que desde un punto de vista taxónomica se
describe como Candidatus M. parvicella, aunque se suele emplear M. parvicella porque
es el nombre que se utiliza en la industria del tratamiento del agua para referirse a este
microorganismo (Rossetti et al., 2005).
Se ha conseguido aislar en cultivos puros en muy pocas ocasiones (Van Veen,
1973; Eikelboom, 1975; Slijkhuis, 1983; Blackall et al., 1994; Tandoi et al., 1998). El
análisis filogenético de algunos de ellos muestra que Candidatus M. parvicella se asocia
a un miembro de una profunda ramificación de la clase Actinobacteria dentro del
phylum de Actinobacteria.
Características de crecimiento
La velocidad de crecimiento de M.parvicella es de entre 0,3-1,4 d-1, por lo que se
necesitan elevados tiempos de retención celular para su supervivencia en la EDAR. Es
por ello que para disminuir su presencia es importante evitar la recirculación de las
espumas en el sistema (Rossetti et al., 2005).
Se ha comprobado que la fuente preferente de nitrógeno para estas bacterias es
el amonio (Tsai et al., 2003). Por otra parte, la concentración de oxígeno disuelto afecta
de forma importante al crecimiento de M. parvicella. Se trata de un organismo
microaerófilo que prolifera en EDAR convencionales con bajas concentraciones de
oxígeno disuelto (OD), espaciales o temporales, y en plantas con eliminación de
nutrientes, operando con zonas anóxicas y aerobias. De hecho, se demostró que la
continua aireación de los fangos activos elimina M. parvicella cuando se alcanzan

21
concentraciones de OD de 2-3 mg/l (Ekama et al., 1996), pudiendo ser tóxicas para estas
bacterias concentraciones de OD mayores a 6 mg/l (Slijkhuis, 1983).
Esta bacteria presenta un crecimiento mayor a bajas temperaturas, de hecho se
elimina a 29ºC (Rossetti et al., 2005). Por ello, es más frecuente su presencia en invierno
y primavera que en verano y otoño (Kruit et al., 2002). Los rangos de carga másica en
los que es más frecuente encontrar este morfotipo son 0,2-0,05 kg DBO/kgSSVLMd
(Jenkins et al., 2003).
Algunos estudios muestran que los filamentos de M. parvicella son más
hidrofóbicos que los de la mayoría de las demás bacterias del fango activo (Nielsen et
al., 2002). Una superficie hidrofóbica puede atraer lípidos, ácidos grasos de cadena
larga (LCFA) y otras sustancias no polares, lo que resulta ventajoso cuando se compite
por este tipo de sustrato (Rossetti et al., 2005). Esta bacteria posee actividad lipasa en
su superficie celular (Nielsen et al., 2002), lo que permite mejorar su habilidad para
tomar productos de lisis y LCFA de los lípidos asociados con la superficie celular. Es
capaz de usar LCFA y sus esteres como fuente de carbono y de energía y el exceso de
carbono se almacena como gránulos de lípido. Sin embargo, no utiliza ácidos orgánicos
o azúcares para su crecimiento (Martins, 2003). Por otra parte, no pueden tomar fósforo
en condiciones aerobias, lo que excluye esta bacterias del grupo de las PAO (Wagner et
al., 2002). Su versatilidad metabólica favorece su proliferación en los sistemas de fangos
activos (Rossetti et al. ,2005).
Es importante destacar que M. parvicella es el primer organismo presente en los
fangos activos que tiene la habilidad fisiológica de acumular lípidos, por lo que puede
ser descrita como un organismo acumulador de lípidos (LAO) (Nielsen et al., 2002). En
la figura 1 se muestra un esquema con la hipótesis de utilización de LCFA por
M.parvicella en plantas de fangos activos con alternancia de fases anaerobia-aerobia.
Esta bacteria toma los LCFA tanto en condiciones aerobias como anaerobias,
empleando el material almacenado para crecer cuando el nitrato o el oxígeno están
disponibles como aceptores de electrones (Andreasen and Nielsen 1997; Rossetti et al.,
2005; Nielsen 2008). Esto representa una ventaja competitiva para Microthrix parvicella
respecto a las formadoras de flóculo, que sólo pueden tomar los LCFA en condiciones
aerobias.

22
Ilustración 1.hipótesis de utilización de LCFA por M.parvicella en plantas de fangos activos con
alternancia de fases anaerobia-aerobia. Nielsen et al., 2002.
1.4.2.- Candidatus Microthrix calida
Hace relativamente poco tiempo, se aisló Candidatus Microthrix calida,
procedente de un fango activo industrial (Levantesi et al., 2006).
Morfología
La morfología de esta bacteria es muy similar a la de M. parvicella, tratándose de
filamentos enrollados no ramificados y muchas veces enmarañados. La longitud de los
filamentos es variable, los septos no son visibles y no presenta movilidad ni vaina. El
diámetro de la célula suele estar comprendido entre 0,3-0,7µm (Levantesi et al., 2006) y
normalmente no muestra un crecimiento adherido significante. Puede encontrarse libre
en la fase líquida, dentro de los flóculos o alrededor de los mismos, aunque su
ubicación más habitual es dentro del flóculo. Son Gram positivas, aunque con una
reacción más débil que M. parvicella (Levantesi et al., 2006) presentando una respuesta
negativa o ligeramente positiva (cuando contienen pequeños gránulos de polifosfato) a
la tinción Neisser.
Taxonomía
Se encuentra dentro de las Actinobacteria, aunque tres de sus cepas se han
asociado con el género Acidimicrobium (Nielsen et al., 2008). Y, tal y como ocurre con
M. parvicella, no existe una caracterización fenotípica detallada, por lo que se nombra
como Candidatus Microthrix calida.
El análisis de la secuencia 16S rRNA revela un máximo de similitud del 96.7%
entre M. parvicella y M. calida (Nielsen et al., 2008) y, según Stackebrandt y Goebel

23
(1994), una identidad de secuencia por debajo del 97% indica que se trata de especies
distintas.
Crece a una temperatura superior a M. parvicella, presentando un crecimiento
adecuado entre los 15-36,5ºC y a un pH superior o igual a 7.8. No se desarrolla en los
medios de cultivo utilizados normalmente para M. parvicella (Levantesi et al., 2006).
Algunas de las propiedades cinéticas y metabólicas son comunes para ambas
especies (M. calida y M. parvicella): velocidad de crecimiento lenta, utilización de LCFA
y elevada capacidad de almacenamiento. La principal diferencia es, como se ha
comentado anteriormente, el rango de temperatura para su crecimiento, lo que explica
su diferente distribución (Levantesi et al., 2006).
Algunos estudios sugieren que Candidatus Microthrix calida no es muy común y
que probablemente no provoca problemas de bulking. La falta de información es
debida a que, al contrario que ocurre con M.parvicella, no hay estudios in situ con esta
bacteria que muestren su ecofisiología.
A continuación, se muestra el árbol filogenético del género Microthrix, basado
en análisis comparativos de las secuencias del gen 16S rRNA.
Ilustración 2.Árbol filogenético del género Microthrix. Levantesi et al., 2006.
Actualmente se dispone de sondas FISH para todas las especies conocidas de
Microthrix (Levantesi et al., 2006). Al principio, solamente estaba disponible la sonda
MPA645 para M. parvicella (Erhart et al., 1997), pero al descubrirse la presencia de

24
filamentos similares a M. parvicella en fangos industriales que muchas veces no
hibridaban con dicha sonda, se desarrollaron dos sondas más: MPAall-1410, que es una
prueba más general de Microthrix y MPA-T1-1260, especifica para Candidatus
Microthrix calida. Además, se desarrollaron también las sondas MPA60, MPA223 que,
junto con la MPA645, son sondas altamente específicas para los filamentos
identificados morfológicamente como M. parvicella en los fangos activos, mientras que
otra sonda, la MPA650 necesita utilizarse junto a dos sondas competidoras para
alcanzar la especificidad adecuada.
1.4.3.- Tipo 0581
El tipo 0581 se encuentra entre las bacterias filamentosas responsables de
problemas de bulking y foaming cuya filogenia y ecología se desconocen, aún a pesar de
tratarse de un microorganismo frecuente en los fangos activos.
Morfología
Se ha demostrado que el morfotipo 0581 está relacionado con los fenómenos de
foaming (Soddell, 1999) y bulking (Blackall, 1999) en las EDAR con fangos activos. De
hecho, según Lemmer et al. (2004) es la filamentosa dominante en el 10% de las EDAR
con problemas de espumas en Alemania.
Presenta una gran similitud morfológica con Microthrix parvicella, por lo que
mediante microscopia convencional solamente es posible diferenciarlas por su distinta
respuesta a las tinciones: este morfotipo es Gram negativo, a diferencia de Microthrix
parvicella, Gram positiva y, respecto a la tinción Neisser, es débilmente positiva para el
tipo 0581 y positiva para M .parvicella (Araújo dos Santos et al., 2011; Zornoza et al.,
2006). Sin embargo, según Rossetti et at. (2005) se podrían generar cambios en la
superficie celular de algunas bacterias filamentosas frente a vertidos químicos, dando
lugar a reacciones anómalas a las tinciones, lo que se traduce en una mayor dificultad a
la hora de diferenciar estos morfotipos visualmente idénticos. Por lo que, en estos
casos, la determinación filogenética es clave para diferenciar ambos morfotipos
(Zornoza et al., 2006).
Se trata de un filamento fino (0,5-0,8 µm) curvado y enrollado, con una longitud
de entre 100 y 200 µm. Puede situarse dentro del flóculo o libre en el espacio
interflocular. Tal y como ocurre con M. parvicella, no presenta septos visibles, ni vaina,
ni crecimiento adherido y carece también de movilidad (Jenkins et al., 2003). Esta gran
similitud con M. parvicella hace plantearse la hipótesis de si el Tipo 0581 ha pasado
desapercibido hasta ahora por haber sido confundido con Microhtrix (Zornoza et al.,
2006).

25
Taxonomía
Se ha identificado el morfotipo 0581 dentro del phylum Chloroflexi (Zornoza et
al., 2006) y, a pesar de presentar unas características morfológicas similares a M.
parvicella, el morfotipo 0581 no está relacionado con los Actinomicetos (que son los
clásicos formadores de foaming), incluidos en el phylum Actinobacteria (Alonso et al.,
2009). En estudios más recientes se ha encontrado que algunos morfotipos 0581
presentan una señal positiva al hibridar con sondas (Mix LGC
(LGC354A+LGC354B+LGC354C)) del phylum Firmicutes, indicando que pueden existir,
al menos, dos tipos diferentes de la Tipo 0581 (Araújo dos Santos et al., 2011). Sin
embargo, esto difiere de los resultados obtenidos con el estudio llevado a cabo por
Zornoza et al. (2006), donde el morfotipo 0581 no hibridó con las siguientes sondas que
se utilizan para caracterizar bacterias a nivel de phylum: Firmicutes, Proteobacteria,
Actinobacteria, , Planctomycetes, Verrumicrobia, Bacteoidetes y TM7, en cambio, sí
hibridó con las sondas del phylum Chloroflexi (Zonronza et al., 2006). Por lo tanto,
todavía no está bien definida la clasificación de la Tipo 0581. Además las bacterias que
pertenecen al phylum Firmicutes son Gram positivas y los filamentos del Tipo 0581 son
Gram negativos.
Actualmente no se dispone de ninguna sonda específica para la Tipo 0581, por
lo que los estudios con la técnica FISH de este morfotipo se están haciendo con
hibridación a nivel de phylum.
Dado que la bibliografía respecto a este filamento es escasa, no se tiene apenas
información sobre su metabolismo ni condiciones favorables para su crecimiento. Lo
que sí se ha podido comprobar es que el rango de carga másica en el que es más
frecuente encontrar este morfotipo es entre 0,1-0,05 kg DBO/kgSSVLMd (Jenkins et al.,
2003) y se encuentran en condiciones de alternancia de oxígeno. Estas características
coinciden con las del morfotipo M. parvicella, por lo que cabe esperar que compitan por
el mismo nicho ecológico (Zornoza et al., 2006).
1.5.-Identificación de morfotipos filamentosos
La detección de los microorganismos filamentos presentes en el sistema de
fangos activos es importante para la identificación de los problemas que pueda haber y
para encontrar posibles soluciones.
1.5.1.- Microscopía convencional
Los métodos clásicos se basan en la observación microscópica de las muestras
para determinar las características morfológicas, así como en el uso de tinciones que
ponen de manifiesto algunas de las características diferenciales de los

26
microorganismos. Eikelboom (1975), estableció una nomenclatura basada en la
observación microscópica de las características morfológicas, que actualizaron
posteriormente otros autores (Jenkins et al., 2004).
Los caracteres morfológicos en los que se basa la clasificación de Eikelboom
(1975), y de Jenkins et al., (2004) son: presencia o ausencia de ramificaciones, movilidad,
forma del filamento (curvo, irregular, enrollado, etc.), ubicación respecto al flóculo,
existencia de crecimiento epifítico, vaina, septos, constricciones celulares, dimensiones
celulares, dimensiones del filamento, forma celular (cuadrada, rectangular, ovalada,
etc.), presencia de biopolímeros de azufre y gránulos de polifosfato, reacciones de
tinción (Gram y Neisser) y formación de rosetas y gonidios.
Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de
microorganismos en plantas de tratamiento de aguas residuales. Sin embargo, no dan
información fiable sobre la identidad exacta de los filamentos observados, por este
motivo, los filamentos son designados con los términos “tipo” o “morfotipo” en vez de
especie. Hoy en día se sabe que un morfotipo específico puede incluir varias especies y
también puede ocurrir lo contrario, que varios morfotipos puedan representar una sola
especie.
La identificación y cuantificación mediante las técnicas convencionales presenta
algunas dificultades:
El método convencional es subjetivo y depende del nivel de entrenamiento y de
la experiencia del que realiza la cuantificación e identificación.
Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer
iguales.
Los filamentos que se encuentran en el interior de los flóculos son difíciles de
identificar y cuantificar.
Estructura abierta de los flóculos.
Elevada población de filamentos.
Los métodos clásicos complementan a las técnicas moleculares, ya que
proporcionan información de interés sobre las características del flóculo y la presencia
de protozoos y otros microorganismos asociados. La microscopía convencional es
considerada una herramienta indispensable para el control del proceso de depuración,
pero a nivel microbiológico realmente solo unas pocas bacterias filamentosas han
podido ser identificadas según sus características morfológicas, por ello actualmente se
sabe que la identificación de las bacterias del fango activo no puede llevarse a cabo
utilizando sólo el método convencional (Nielsen et al., 2009).

27
1.5.2.- Técnica FISH para la identificación de bacterias filamentosas
Para la identificación y cuantificación de microorganismos filamentosos se
emplean métodos moleculares (Blackall, 1994; Wagner et al., 1994; Bradford et al., 1996;
Erhart et al., 1997; Kanagawa et al., 2000;), en particular, la técnica de hibridación in situ
con sondas 16S DNA marcadas con fluoróforos (FISH) se considera la más apropiada
para una correcta identificación de las bacterias filamentosas en las muestras de fangos
activos (Nielsen et al., 2009).
La mayoría de los morfotipos filamentosos de Eikelboom no han sido
nombrados siguiendo las reglas del Código Internacional de Nomenclatura de
Procariotas y muchos reciben una identificación alfanumérica. Ello se debe
principalmente a que muchos de estos microorganismos muestran una morfología
celular diferente a la que presentan en los fangos activos. Esta situación está cambiando
gracias al empleo de técnicas moleculares de caracterización y secuenciación del gen
16S rDNA, que empiezan a clarificar la posición taxonómica de los morfotipos de
bacterias filamentosas.
La hibridación in situ con sondas u oligonucleótidos 16S rDNA/23S rDNA
marcadas con fluoróforos (FISH) es una técnica común para la detección e
identificación de microorganismos en diferentes ambientes microbianos, entre los que
se incluyen comunidades de bacterias como las presentes en los sistemas biológicos de
depuración con fangos activos (Amann et al., 1995). Esta técnica se basa en la
hibridación directa de la bacteria diana con una sonda complementaria de una región
del gen 16S o 23S rRNA. El elevado número de moléculas de rRNA (103-105) es una
ventaja en la aplicación de la técnica de hibridación al aumentar su sensibilidad
(Amann, 1994). Una secuencia de DNA (sonda) puede unirse con una secuencia de
RNA complementaria (16S rRNA o 23S rRNA) y se produce un híbrido DNA: RNA. La
sonda está marcada con una molécula fluorescente de tal forma que los híbridos
formados se pueden detectar fácilmente con un microscopio de epifluorescencia.
La especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles
taxonómicos como son: dominio, phylum, clase, familia, género o especie, para la
identificación de las bacterias presentes en el fango activo. Estas sondas deben ser lo
suficientemente específicas para unirse únicamente a la bacteria que se quiere detectar.
Para asegurar la especificidad, los dos parámetros determinantes son la temperatura y
la concentración de formamida en el tampón de hibridación (Alonso et al., 2009). La
formamida hace que disminuya la temperatura de unión de las sondas mediante el
debilitamiento de los puentes de hidrógeno, es decir, disminuye la temperatura de
fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72ºC por cada 1% de formamida utilizada y
permite realizar la hibridación a 46ºC (Alonso et al., 2009).

28
La sonda que se utiliza en la técnica FISH está formada por una pequeña
secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, cuyo extremo, normalmente 5’, se marca
con un fluoróforo, como puede ser rodamina o fluoresceína. En la figura 3 se muestra
un esquema simplificado del proceso de hibridación in situ con sondas 16SrDNA con
fluoróforos.
La técnica FISH, presenta una serie de ventajas (tabla 6) frente a otras técnicas
de detección e identificación, como la microscopia por contraste de fases. A
continuación se comentan dichas ventajas:
Tabla 6. Ventajas de la técnica FISH.
No se han detectado sustancias inhibidoras que interfieran en la reacción de
hibridación.
No necesita cultivo previo de la bacteria ni la extracción de los ácidos nucleicos
(Nielsen et al., 2009).
Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años).
Se mantiene la morfología de la célula y del flóculo (Nielsen et al., 2009).
La hibridación inespecífica con otros microorganismos presentes en la muestra no
es habitual, por lo que no se dan resultados falsos positivos.
La especificidad de las sondas permite detectar varias especies o genes en una
misma muestra, utilizando una sonda para cada especie, género o grupo, marcada
con fluoróforos distintos, para la identificación de las bacterias en sus diferentes
comunidades naturales.
Puede utilizarse junto con la tinción DAPI para determinar si las células estudiadas
están vivas o no, muy útil para la monitorización del estado de la microbiota
durante la adicción de tóxicos para el control del “bulking” y del “foaming”.
Además de todas las ventajas de la técnica molecular FISH anteriormente
citadas, se aprecian ciertas limitaciones:
Tabla 7.Limitaciones de la técnica FISH.
La identificación a través de FISH es solo posible si la sonda requerida está
disponible.
Se han desarrollado sondas para varias especies filamentosas importantes, pero aún
no para todas las especies que puedan aparecer en el fango activo.
Su mayor limitación reside en la sensibilidad de la penetración de la propia sonda y
de la matriz donde estemos hibridando, que depende del contenido de ribosomas
existente en las bacterias filamentosas, si este contenido es bajo no darán una señal
fluorescente clara con la sonda; en muchos casos es necesario un tratamiento
previo.
Puede ocurrir que una sonda específica para una especie de una señal fluorescente
con otras especies, si sus secuencias de rRNA son muy parecidas. Tales resultados
positivos falsos pueden ser prevenidos mediante la aplicación de sondas
competidoras.
La accesibilidad de la sonda rRNA es distinta según la molécula de rRNA de que se
trate y la zona del mismo de la que sea complementaria, esto hay que tenerlo en
cuenta para el diseño de la sonda.

29
2.- OBJETIVOS
Para conseguir un control efectivo de muchos de los problemas en el proceso de
depuración es necesaria la identificación de los microorganismos que los causan, de
modo que se puedan limitar las condiciones que favorecen su crecimiento. Un excesivo
crecimiento de las bacterias filamentosas puede interferir en el correcto funcionamiento
del sistema de fangos activos, dando lugar a problemas como la deficiente
sedimentación del fango o la formación de espumas.
El desarrollo de este trabajo tiene como objetivo principal la identificación y
cuantificación de la población de bacterias filamentosas no ramificadas (Microthrix y
tipo 0581) formadoras de espumas presentes en el fango activo de la EDAR de la
Cuenca del Carraixet. Además, se estudiarán las posibles relaciones entre las variables
operacionales y físico-químicas que pueden afectar a su actividad y crecimiento.
Se plantean los siguientes objetivos específicos:
Aplicar la técnica FISH a las muestras para determinar la presencia de
diferentes morfotipos filamentosos del género Microthrix. En el caso del tipo
0581, al no existir una sonda específica para su hibridación, se aplica una sonda
para poder identificar las bacterias del phylum Chloroflexi, al que pertenece este
morfotipo.
Determinar la abundancia de las bacterias filamentosas detectadas por FISH
mediante la aplicación de la escala subjetiva de Eikelboom.
Comparar la abundancia obtenida mediante la técnica FISH con la resultante de
la aplicación de la microscopía convencional (contraste de fases), utilizando en
ambos casos la escala subjetiva de Eikelboom.
Estudiar las relaciones existentes entre los parámetros operacionales y físico-
químicos de la EDAR y la abundancia de los diferentes morfotipos filamentosos
estudiados.

30
3.- MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.- Descripción de la EDAR
Se tomaron muestras del licor mezcla de la EDAR de la Cuenca del Carraixet
con una frecuencia quincenal durante un año. A continuación se muestra el esquema
de funcionamiento y algunos datos de interés.
La planta de depuración de la Cuenca del Carraixet se ubica en la comarca de
La Ribera Alta, en el municipio de Alzira, en la Comunidad Valenciana, es capaz de
tratar agua procedente de 4 municipios consiguiendo unos rendimientos del 98 % para
sólidos en suspensión (SS), del 95 % para DBO5 y del 91 % para DQO, según la
información publicada por la EPSAR en el año 2012.
Cuenta con dos líneas aerobias de tratamiento biológico, línea A+B y línea C+D,
ambas con una zona anóxica (Ilustración 4). El caudal tratado es de 33.584 m3/d, con
una carga de 96.230 habitantes equivalentes (he).
Ilustración 3. Línea de tratamiento de agua y fango de la EDAR del CARRAIXET. EPSAR

31
En la tabla 8 se puede observar la ficha técnica de la instalación:
Tabla 8. Ficha técnica de la instalación. Fuente: EPSAR.
Línea de agua Línea de fango
Pretratamiento Espesador (gravedad y mecánico)
Reja de gruesos Estabilización anaerobia
Tamizado Deshidratación (centrífuga)
Desarenador Generación eléctrica (cogeneración)
Desengrasador
Tratamiento primario
Decantación primaria
Tratamiento secundario
Fangos activos
Eliminación de nitrógeno y fósforo
3.2.- Muestreo
Las muestras utilizadas para el desarrollo de este proyecto fueron
proporcionadas por el Instituto Universitario de Ingeniería del Agua y Medio
Ambiente (IIAMA) de la Universidad Politécnica de Valencia (UPV).
El muestreo se realizó siempre en el mismo punto, generalmente a la salida del
reactor biológico. Se tomaron 1,5 L de licor mezcla con un recipiente de plástico, de
estas muestras se tomaron unas alícuotas para su fijación que se realizó antes de las 24
horas.
Los muestreos se realizaron cada quince días durante el año 2009. El muestreo
comenzó en Diciembre de 2008 y finalizó en Diciembre de 2009. Las muestras fueron
simples realizadas de forma puntual. Se tomaron un total de 46 muestras, 23 en cada
línea.
Para el transporte y conservación de las muestras fue necesario mantener las
condiciones aerobias de la muestra, lo cual se logró con la cámara de aire que queda
sobre el licor mezcla en el recipiente de recogida.
En el Anexo I encontramos la relación de fechas de muestreo.
3.3.- Variables físico-químicas y parámetros operacionales
En las tablas expuestas en el anexo II se encuentran los parámetros físico-
químicos analizados, su nomenclatura y unidades. En el anexo III las tablas con todos
los parámetros donde aparecen los rangos, media y desviación estándar en cada
depuradora. Estos parámetros se determinaron siguiendo los procedimientos

32
normalizados (APHA, 2005) en las muestras de las distintas EDAR. El Índice
Volumétrico de Fango (IVF) se calculó según el procedimiento descrito por Jenkins et al.
(2004).
En el presente trabajo los valores de oxígeno disuelto (OD) en el reactor fueron
distribuidos en tres intervalos: < 0,8 oxígeno disuelto bajo (ODb), 0,8 – 2 oxígeno
disuelto medio (ODm) y > 2 ppm oxígeno disuelto alto (ODa).
3.4.- Hibridación in situ con sondas marcadas con fluoróforos
(FISH)
3.4.1.- Preparación de reactivos para FISH
La técnica FISH requiere que se fijen previamente las bacterias. Este primer
paso es necesario para que la estructura celular se mantenga rígida y estática y se
conserve su morfología favoreciendo la penetración de las sondas.
Para la fijación de las muestras se utilizó un reactivo diferente según la pared
celular de la bacteria (Gram-positivo, Gram-negativo, Mycolata). Para las bacterias
Gram-negativas, como el tipo 0581, se emplea paraformaldehído (PFA). En cambio las
bacterias como Microthrix que son Gram-positivas se fijan con etanol. Para
permeabilizar mejor la pared celular de Microthrix se ha realizado un tratamiento
enzimático con mutanolisina (Schuppler et al., 1998).
Ilustración 4.Esquema simplificado del proceso de hibridación in situ con sondas marcadas con
fluoróforos.
En la ilustración 5 se describen los pasos a realizar en cada caso:

33
Ilustración 5. Pasos a realizar para la fijación de muestras según su pared celular.
3.4.2.- Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Teflón
Todos los portaobjetos utilizados en la técnica FISH se han de lavar y
desengrasar. Previamente a su empleo se les debe dar un baño en una solución de
gelatina y de sulfato potásico y cromo para favorecer la adhesión de la muestra. A
continuación se detallan los pasos a seguir para el tratamiento de los portaobjetos.
Lavar con solución de limpieza
Enjuagar con agua destilada
Secar al aire(dejar escurrir todo 1 día, protegiendo del polvo ambiental cubriendo
los portas con papel aluminio)
Cubrir con gelatina por inmersión en la solución 0,1% con cromato sulfato potásico
0,01% (preparada en el momento, temperatura 60ºC)
Secar al aire

34
3.4.3.- Aplicación de las muestras a los portaobjetos
Los pasos para la aplicación de las muestras a los portaobjetos son diferentes
para Chloroflexi (gram -) y para Microthrix (gram +) ya que, como se ha comentado
anteriormente, Microthrix necesita un tratamiento adicional con enzimas, en este caso
se utiliza la mutanolisina:
Etapas para la aplicación de las muestras a hibridar con Chloroflexi:
Poner un volumen entre 3 y 5 µl de muestra fijada en el portaobjetos FISH. En este
caso se ha colocado un volumen de 4 µl en cada pocillo del portaobjetos
Secar al aire
Deshidratar en etanol 50% durante 3 minutos por inmersión
Secar al aire
-Etapas para la aplicación de las muestras a hibridar con Microthrix:
Poner un volumen entre 3 y 5 µl de muestra fijada en el portaobjetos FISH. En este
caso se ha colocado un volumen de 4 µl en cada pocillo del portaobjetos
Secar al aire
Secar al aire
Aplicar 10 µl de mutanolisina en cada pocillo y dejar actuar durante 20 minutos.
Poner un trozo de papel celulosa dentro de un tubo Falcon con 1 mL de agua
miliQ, para crear una atmósfera húmeda e introducir cada porta en un tubo
Falcon.
Incubar a 37ºC durante 20 minutos.
Limpiar los porta con agua miliQ
Secar al aire
Secar al aire
3.5.- Sondas utilizadas
Las diferentes sondas utilizadas en las hibridaciones, así como su secuencia de
nucleótidos del extremo 5’ al 3’ y el porcentaje de formamida óptimo a utilizar se
muestran en la tabla 9.

35
Tabla 9. Sondas utilizadas.
Sonda Secuencia (5’-3’) Organismo % FA1 Referencia
MPA 645 CCGGACTCTAGTCAGAGC M. parvicella2 20 Erhart et al.
(1997b)
Mpa-T1-1260 TTCGCATGACCTCACGGTTT M. calida3 25 Levantesi et
al. (2006)
Mpa-all-1410 GGTGTTGTCGACTTTCGGCG Microthrix 35 Levantesi et
al. (2006)
MPA-60 GGATGGCCGCGTTCGACT M. parvicella2 20 Erhart et al.
(1997b)
GNSB941 CCATTGTAGCGTGTGTGTMG Chloroflexi 35 Gich et al.
(2001)
CFX1223 CCGTCAATTCCTTTATGTTTTA Chloroflexi 35 Björnsson et
al.(2002)
Fuente: Alonso et al., 2009. 1Concentración óptima de formamida; 2Candidatus Microthrix parvicella;
3Candidatus Microthrix calida.
3.6.- Hibridación “in situ”
Los pasos y reactivos del proceso de hibridación se describen en detalle a
continuación:
En primer lugar se prepara la solución de hibridación con formamida en un
microtubo de 2 ml. La cantidad de reactivos dependerá del porcentaje óptimo de
formamida que a su vez dependerá de la sonda utilizada (tabla 10).
Tabla 10. : Solución de hibridación según porcentaje de formamida.
Reactivo
% de Formamida
10 20 25 30 35 40 45
NaCl 5M 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl 360 µl
HCL-Tris 1M 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl 40 µl
Formamida 200 µl 400 µl 500 µl 600 µl 700 µl 800 µl 900 µl
H2O MiliQ 1398 µl 1198 µl 1098 µl 988 µl 898 µl 798 µl 698 µl
SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl
Volumen
Final
2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl
Poner 9 µl de la solución de hibridación + 1 µl de sonda en cada pocillo y repartir
homogéneamente por todo el campo. En el caso de que junto con la sonda se tenga
que añadir sondas competidoras se deberá hacer una combinación de todos ellos
con la sonda hasta alcanzar la cantidad total de 1 µl de sonda. A partir de la puesta
en contacto con la sonda hay que evitar el contacto con la luz para evitar la pérdida
de fluorescencia del fluoróforo
Poner un trozo de papel celulosa dentro de un tubo Falcón de 50 ml y verter sobre
el papel la solución de hibridación restante sin sonda, este paso es necesario para
crear una atmósfera húmeda en el tubo Falcón y favorecer la hibridación.

36
Introducir el portaobjetos en posición horizontal dentro del tubo Falcón de 50 ml
Incubar a 46ºC durante al menos 1 hora y 30 minutos para Gram-, 3 horas en el
caso de Mycolata.
Para eliminar el exceso de sonda que no ha hibridado y la formamida de los
portaobjetos se prepara 50 ml de solución de lavado mezclando los reactivos
presentes en la siguiente tabla dependiendo del porcentaje de formamida que ha
sido utilizado en la solución de hibridación (Tabla 11).
Tabla 11. Solución de lavado según porcentaje de formamida.
Reactivo % de Formamida
10 20 25 30 35 40 45
NaCl 5M 4500 µl 2150 µl 1490 µl 1020 µl 700 µl 460 µl 300 µl
EDTA 0,5 M - 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
HCL-TRIS
1M
1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl
H2O MiliQ 44,45 ml 46,3 ml 47,94 ml 47,43 ml 47,75 ml 47,06 ml 48,15 ml
SDS 10% 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl
Volumen
Final
50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml l
Sacar de la estufa y rápidamente lavar los portaobjetos e introducirlos dentro del
tubo con la solución de lavado, los tubos se forran con papel de aluminio para
protegerlos de la luz. Incubar en un baño a 48ºC durante 15 – 20 minutos.
Lavar con agua Mili-Q
Secar al aire en la oscuridad
Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a -20ºC
3.7.- Observación al microscopio
Una vez realizada la hibridación in situ con las sondas específicas se procede a
la observación con el microscopio y a la toma de imágenes.
A la hora de observar las muestras con el microscopio de epifluorescencia se
precisa utilizar un líquido de montaje (Vectashield) para evitar la pérdida de
fluorescencia. Se añaden unas gotas de este líquido en la zona central del portaobjetos
y se coloca encima un cubreobjetos, con ayuda de una punta se ejerce una pequeña
presión sobre éste para que el líquido de montaje se extienda de forma uniforme por
toda la muestra, a continuación se observa el pocillo a 600X.
El microscopio utilizado para la observación de las muestra ha sido un
Olympus BX 50. Las fotografías en color se realizaron con una cámara digital Olympus
DP 10 acoplada al microscopio con los filtros: U-MWIB (Fluoresceína, FAM) y U-
MWIG (Rodamina, TAMRA).

Trabajo Final de Máster
Para la cuantificación de los microorganismos se realizó un barrido de todos los
pocillos del portaobjetos con el objetivo de 60X, una v
hibridación in situ.
Se realizó la valoración de la abundancia de las bacterias filamentosas
utilizando la escala subjetiva de Eikelboom (2000, 2006).
La escala de valoración de los organismos filamentos se muestra
Tabla 12. Escala de valoración de organismos filamentosos.
Índice
filamento
Abundancia
0 “Ninguno”
1 “Pocos”
2 “Algunos”
3 “Comunes”
4
“Muy
comunes”
5 “Abundantes”
En la Ilustración 6 se muestra la escala utilizada para valorar la abundancia de
las bacterias filamentosas.
pocillos del portaobjetos con el objetivo de 60X, una vez realizado el proceso de
utilizando la escala subjetiva de Eikelboom (2000, 2006).
La escala de valoración de los organismos filamentos se muestra
. Escala de valoración de organismos filamentosos.
Abundancia Descripción
“Ninguno” Ningún filamento presente
“Pocos” Pocos filamentos y de forma ocasional en el flóculo
“Algunos”
Filamentos en aproximadamente la mitad de los
flóculos
“Comunes”
Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1
5/flóculos)
comunes”
Filamentos en todos los flóculos con densidad media(5
20/flóculos)
“Abundantes”
Filamentos en todos los flóculos con alta densidad
(>20/flóculos)
se muestra la escala utilizada para valorar la abundancia de
Ilustración 6. Índice de filamentosas
37
ez realizado el proceso de
La escala de valoración de los organismos filamentos se muestra en la tabla 12.
Pocos filamentos y de forma ocasional en el flóculo
aproximadamente la mitad de los
Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1-
Filamentos en todos los flóculos con densidad media(5-
alta densidad
se muestra la escala utilizada para valorar la abundancia de

38
3.8.- Técnicas de Análisis Estadístico para muestras ambientales
3.8.1.- Análisis bivariante
Las técnicas de análisis bivariante expresan el grado de relación entre dos
variables. Pueden considerarse, en algunos supuestos, como casos especiales o
simplificados de algunas técnicas de análisis multivariante. Por ello es recomendable
realizar una exploración previa mediante este tipo de análisis antes de abordar la
aplicación de cualquier técnica multivariante. Las técnicas de correlación son usadas
con frecuencia para resumir la fuerza de la asociación entre dos variables métricas.
Coeficiente de correlación lineal de Pearson.
El coeficiente de correlación de Pearson es un coeficiente estadístico que se
suele emplear para medir la intensidad de la relación entre dos variables linealmente
relacionadas X e Y, y es calculable siempre que ambas variables se distribuyan
normalmente. Se calcula con la fórmula expresada en la Ecuación 1.
‫ݎ‬ ൌ
∑ ሺ‫ݔ‬௜ െ ‫ݔ‬ҧሻ௡
௜ୀଵ ሺ‫ݕ‬௜ െ ‫ݕ‬തሻ
ඥ∑ ሺ‫ݔ‬௜ െ ‫ݔ‬ҧሻଶ௡
௜ୀଵ ∑ ሺ‫ݕ‬௜ െ ‫ݕ‬തሻଶ௡
௜ୀଵ
Ecuación 1. Cálculo del coeficiente lineal de Pearson.
El coeficiente de correlación de Pearson está comprendido entre -1 y +1, donde
los valores positivos indican una dependencia lineal creciente y los valores negativos
indican una dependencia lineal decreciente. El valor absoluto del coeficiente de
correlación indica el grado de la relación lineal entre las variables. Valores absolutos
grandes indican las relaciones más fuertes. Cuando los valores del coeficiente sean
pequeños, significativos de una pequeña dependencia lineal, se debe cambiar el
modelo lineal por otro tipo de curva a fin de tener una mejor aproximación.
Coeficiente de Correlación de Spearman
El coeficiente de Correlación de Spearman es una versión no paramétrica del
coeficiente de correlación de Pearson. Este parámetro estadístico es adecuado para
datos ordinales, o de intervalo, que no satisfagan el supuesto de normalidad, como es
el caso de los resultados de este estudio. La correlación de Spearman se basa en los
rangos de los datos en lugar de los valores reales, y compara dichos rangos para cada
grupo de variables (Conover, 1998). El uso de este coeficiente estadístico es aconsejable
cuando tenemos un número relativamente alto de categorías.
El coeficiente de correlación de Spearman requiere que las variables sean
aleatorias continuas, o por lo menos una de ellas, de forma que los objetos o individuos
puedan colocarse en series ordenadas (Siegel, 1983).

39
El coeficiente de Spearman se calcula con la fórmula expresada en la Ecuación 2
‫ݎ‬௦ ൌ 1 െ
6 ∑ ݀௜
ଶ
ܰଷ െ ܰ
di: la diferencia entre los rangos X e Y (di=rxi-ryi).
N: Número de valores de muestra
Ecuación 2. Cálculo del coeficiente de correlación de Spearman.
Los valores de los rangos se colocan según el orden numérico de los datos de la
variable estudiada.
Su interpretación es semejante al coeficiente de correlación de Pearson. Índices
cercanos a +1 indican una fuerte correlación creciente mientras que valores cercanos a -
1 indican una fuerte correlación decreciente, los valores próximos a 0 indican que no
hay correlación entre las variables (Siegel, 1983).
La prueba de significación asociada a ambos coeficientes únicamente prueba la
hipótesis nula de que el coeficiente pueda ser igual a 0, es decir, que no exista ninguna
relación lineal entre ambas variables. El nivel de significación “p” representa la
probabilidad de error que se comete al aceptar el resultado observado como válido.
Cuanto mayor sea este nivel de significación mayor error se comete al aceptar que las
correlaciones observadas entre las variables de la muestra son indicadoras de la
relación entre las respectivas variables de la población.
En el presente estudio, se emplea el coeficiente de correlación de Spearman para
hacer el análisis bivariante de los resultados ya que se trata de datos ordinales.
Previamente a la determinación de Spearman se comprobó la distribución de la
normalidad de los datos obtenidos de las distintas variables mediante los test de
Curtosis y Asimetría. Las variables cuyos datos no siguieron una distribución normal
se transformaron a través de un cálculo logarítmico (variable = Ln [variable + 1])
(Esteban et al., 1991).
La correlación de Spearman se obtuvo mediante el programa IBM SPSS
Statistics versión 19. En este programa se introdujo una matriz con los parámetros
operacionales y las especies de bacterias filamentosas objeto de este estudio y se realizó
un análisis estadístico correspondiente a la correlación Spearman.
El programa genera como salida de este estudio una tabla con los valores de las
correlaciones y los p-valores de cada una. Estos últimos indican la bondad estadística
del modelo ajustado. Por ejemplo p-valores iguales o inferiores a 0,05 indican una
relación estadísticamente significativa al 95%.

40
3.8.2.- Análisis Multivariante
El análisis multivariante es la parte de la estadística y del análisis de datos que
estudia, analiza , representa e interpreta los datos que resultan de observar más de una
variable estadística sobre una muestra de individuos. Las variables observadas son
homogéneas y correlacionadas, sin que alguna predomine sobre las demás. Dentro de
los Análisis Multivariante se encuentra la técnica de Análisis canónico la cual se
describe a continuación:
El análisis de correspondencias canónicas (ACC) es una técnica de ordenación
directa, a diferencia del análisis de componentes principales. El ACC asume un modelo
unimodal en la respuesta de los organismos sobre combinaciones de un conjunto de
variables, considerando simultáneamente la información biológica y la información
ambiental. En el ACC, los ejes que explican la respuesta biológica están forzados a ser
una suma ponderada de las variables estudiadas (terBraak and Smilauer, 1998).
En los análisis canónicos se extrae toda la varianza de la matriz respuesta que
está relacionada con la matriz explicativa.
La ordenación de la matriz respuesta se precisa de forma que los vectores de
ordenación resultantes son combinaciones lineales de las variables de la matriz
explicativa.
El proceso se explica a continuación:
Sean X= (X1, …, Xp), Y=(Y1, …, Yq) dos vectores aleatorios de dimensiones p y q.
Se pretende encontrar dos variables compuestas, U = Xa = a1X1+ … + apXp, V = Yb = b1Y1
+ … + bqYq, siendo a = (a1, …, ap), b = (b1, …, bq)´, tales que la correlación entre ambas
sea máxima. Se indicarán por S11, S22 las matrices de covarianzas (muéstrales) del
primer y segundo conjunto, es decir, de las variables X, Y, respectivamente, y sea S12 la
matriz p x q con las covarianzas de las variables X con las variables Y.
· ܺ ܻ
ܺ ‫ݏ‬ଵଵ ‫ݏ‬ଵଶ
ܻ ‫ݏ‬ଶଵ ‫ݏ‬ଶଶ
Donde: S12=S21
Ilustración 7.Matriz de covarianzas ACC.
Entonces podremos suponer que var (U) = a´S11a =1 , var (V) = b´S22b = 1,
reduciendo el problema a maximizar a´S12b restringido a a´S11a =1, b´S22b = 1.
Los vectores de coeficientes a, b que cumplen esta condición son los primeros
vectores canónicos. La máxima correlación entre U, V es la primera correlación
canónica r1.

41
La posibilidad de comprobar si existe una relación estadísticamente
significativa entre la composición de la comunidad y una matriz de variables
ambientales permite pasar de un uso meramente descriptivo de las ordenaciones a
emplearlas como herramientas para el contraste de hipótesis formuladas a priori. La
hipótesis nula de un ACC es que no existe relación alguna entre la matriz de variables
respuesta y la matriz de variables explicativas. La significación de esta hipótesis nula se
puede evaluar mediante permutaciones. En este caso, el estadístico es la suma de todos
los valores propios canónicos y su significación se evalúa mediante un test de F. La
hipótesis alternativa establece que la suma de todos los valores propios canónicos es
mayor que la que se obtiene de matrices en las que se han permutado sus filas de
datos. La suma de todos los valores propios canónicos dividida por el total de
variación de la matriz Y permite obtener la proporción de la variación de Y explicada
por X, que es análoga al coeficiente de determinación de las regresiones múltiples.
Para realizar el análisis de correspondencias canónicas se utilizó el programa
XLSTAT versión 2013.4.05, donde se introdujo la matriz de datos y se especificaron las
variables para realizar el análisis.
En primer lugar se comprobó si existían relaciones lineales entre las variables o
bien unimodales, para ello se evaluaron los resultados de las pruebas de permutación,
que indican la aceptación o rechazo de la hipótesis nula.
Como se comentaba anteriormente, la hipótesis nula establece que no existe
relación lineal entre la matriz de variables respuesta (organismos) y la matriz de
variables explicativas (variables del proceso). En los casos que se acepta la hipótesis
nula no es posible llevar a cabo el ACC y se debe proceder a la realización del análisis
de redundancia. En este caso todos los datos analizados dieron como resultado el
rechazo de la hipótesis nula, por tanto se utilizó el ACC.
El resultado del ACC consiste principalmente en un diagrama de ordenación
(biplot o triplot) formado por un sistema de ejes o dimensiones, los cuales son
combinación lineal de las variables explicativas, en ellos es posible representar los
sitios, las especies y las variables ambientales.
Este diagrama representa un análisis directo del gradiente. La longitud de las
variables explicativas, representadas por vectores, indica su variabilidad. Cuanto
menor es el ángulo entre ellas más directa es la relación entre las variables, si forman
un ángulo de 90º significa que las variables no están relacionadas, y a medida que este
se va a aproximando a un ángulo de 180º la relación que indica es decreciente. Cuanto
más alto corte la perpendicular de la variable respuesta con la variable explicativa
mayor será el grado de relación entre ambas.

42
4.- RESULTADOS
Los resultados obtenidos durante la realización del proyecto corresponden, tal
como se explicó en el apartado de materiales y métodos, a la realización de las
hibridaciones mediante la técnica FISH de 46 muestras (23 de cada línea) tomadas
quincenalmente en el fango activo de las dos líneas de la depuradora de la cuenca del
Carraixet durante un periodo de un año. Las hibridaciones se realizaron con el fin de
detectar y cuantificar las bacterias filamentosas del género Microthrix así como del
phylum Chloroflexi (al cual pertenece el tipo 0581) presentes en el licor mezcla del
reactor biológico.
Seguidamente se llevó a cabo un análisis cualitativo y cuantitativo de las
bacterias que dieron resultado positivo en las hibridaciones. Por último, se realizó un
análisis estadístico bivariante y un análisis de correspondencias canónicas (ACC) para
determinar las relaciones entre la dinámica poblacional de estas bacterias y las
variables físico-químicas y operacionales de la EDAR.
4.1.- Cuantificación e identificación de bacterias filamentosas del
género Microthrix y Tipo 0581
4.1.1.- Microscopía convencional
Los resultados de abundancia según el método convencional fueron extraídos
del proyecto “Estudio Integrado del Proceso de Fangos Activos” y se muestran en las
tablas 1,2,3. Las bacterias filamentosas del morfotipo Microthrix se identificaron gracias
a características morfológicas distintivas. De ahora en adelante en todo el documento
se hará referencia a las bacterias del género Microthrix identificadas por microscopía
convencional como Microthrix (convencional).
Cabe mencionar que los valores de la media de abundancia se muestran
solamente para tener una idea de la cantidad de bacterias filamentosas en las muestras,
pero no pueden sumarse las medias de los diferentes organismos (por ejemplo, la suma
de las medias de las abundancias detectadas con las distintas sondas de Microthrix no
se corresponde con la media de la abundancia detectada con la sonda general de
Microthrix) , ya que lo importante es el rango de valores que toma la abundancia y la
variación de la misma en las diferentes muestras.
Tabla 13, Valores mínimos y máximos (rango), media y desviación estándar de la abundancia de las
bacterias identificadas por microscopía convencional en la línea A+B de la EDAR Carraixet..
Parámetro Rangos
Media ±
desviación
Microthrix (Convencional) 0 – 5 3 ± 2
Tipo 0581 0 - 5 2 ± 2

43
Tabla 14. Valores mínimos y máximos (rango), media y desviación estándar de la abundancia de las
bacterias identificadas por microscopía convencional en la línea C+D de la EDAR Carraixet.
Parámetro Rangos
Media ±
desviación
Microthrix (convencional) 0 - 5 3 ± 2
Tipo 0581 0 - 5 2 ± 2
Tabla 15. Valores mínimos y máximos (rango), media y desviación estándar de abundancia de las
bacterias identificadas por microscopía convencional en el conjunto de las dos líneas de agua de la
EDAR Carraixet.
Parámetro Rangos
Media ±
desviación
Microthrix (convencional) 0 - 5 3 ± 2
Tipo 0581 0 - 5 2 ± 2
A continuación se muestran ilustraciones (Ilustraciones 8 y 9) con la
observación mediante microscopía convencional de Microthrix y tipo 0581, en la
ilustración 9 se observa su diferente respuesta a la tinción gram:
Ilustración 8: Imágenes con contraste de fases. A la izquierda Microthrix, a la derecha Tipo 0581.
Aumento 1000x. Se observa la similitud morfológica entre ambas bacterias.
Ilustración 9: Imágenes con contraste de fases de la reacción a la tinción Gram. A la izquierda
Microthrix, gram positiva; a la derecha Tipo 0581, gram negativa. Aumento 1000x. Mediante la tinción
Gram es posible diferenciar estas bacterias por microscopía convencional.

44
Como se ha comentado anteriormente, la similitud morfológica entre las
bacterias del género Microthrix y el Tipo 0581 (Ilustración 8) hace que su identificación
mediante la técnica molecular FISH sea clave para poder diferenciar ambos
organismos, ya que hibridarán con sondas distintas y de phylum diferentes, Microthrix
pertenece al phylum Actinobacteria y Tipo 0581 al phylum Chloroflexi.
Además, el hecho de que muchas veces estas bacterias se encuentren dentro del
flóculo también dificulta su identificación por microscopía convencional, resultando
visibles utilizando FISH, como se aprecia en la ilustración 10:
Ilustración 10.A la izquierda vista convencional y a la derecha FISH con la sonda GNSB941+CFX1223
del mismo campo de la muestra. En el caso de la imagen FISH sí puede apreciarse la presencia de los
filamentos dentro del flóculo. Aumento: 1000x.
4.1.2.- Técnica molecular FISH
Como se comentó en el apartado de materiales y métodos, se emplearon un
total de 5 sondas, 4 para la identificación de bacterias del género Microthrix y una de
ellas para el phylum Chloroflexi, dado que actualmente no existe ninguna sonda
específica para el morfotipo 0581.
Con la sonda general MPAall-1410 se identificaron los filamentos pertenecientes
al género Microthrix. En primer lugar se realizó la observación mediante el microscopio
de epifluorescencia y se tomó la imagen. Seguidamente se fotografió el mismo campo
con contraste de fases, de forma que se pueden comparar ambas imágenes. En la
imagen con contraste de fases se observa una mayor cantidad de filamentos que en la
imagen FISH, esto puede dar lugar a confusiones a la hora de contabilizar los
filamentos, ya que no todos pertenecen al género Microthrix. Con la imagen FISH se ve
como solamente destacan por su fluorescencia algunos de los filamentos, justamente
los que sí pertenecen a Microthrix, que han hibridado con la sonda MPAall-1410. De
modo que utilizando la técnica FISH se puede realizar el recuento de microorganismos
de una forma más fiable. En la Ilustración 11 se muestra un ejemplo de filamento
hibridado con la sonda general.

45
Ilustración 11.A la izquierda vista con contraste de fases y a la derecha vista FISH del mismo campo con
la sonda MPAall-1410. Aumento: 1000x
Para la detección e identificación de filamentos pertenecientes al morfotipo
Candidatus Microthrix parvicella se emplearon las sondas MPA645 y MPA60, que
hibridan dos regiones de nucleótidos diferentes. El morfotipo Candidatus Microthrix
calida se detectó e identificó utilizando la sonda específica MPA-T1-1260. En la figura
se muestra el árbol filogenético del phylum Actinobacteria, al que pertenecen M.
parvicella y M. calida.
Ilustración 12.Árbol filogenético del phyllum Actinobacteria. Nielsen et al,2008.

46
Por último, se empleó la sonda GNSB941+CFX1223 para la identificación de los
filamentos del phylum Chloroflexi, del que se muestra el árbol filogenético en la figura:
Ilustración 13.árbol filogenético del phyllum Chloroflexi. Nielsen et al, 2008.
En la tabla16 se presentan los resultados de abundancia para cada muestra con
cada sonda:

47
Muestra Línea A+B Línea C+D
Nº Fecha MPAall1410 MPA645 MPA60 MPA1260 GNSB941+CFX1223 MPAall1410 MPA645 MPA60 MPA1260 GNSB941+CFX1223
(IF) (IF) (IF) (IF) (IF) (IF) (IF) (IF) (IF) (IF)
1 10-12-08 5 2 0 0 4 5 4 0 0 4
2 23-12-08 4 4 0 0 4 5 5 0 0 3
3 7-1-09 5 5 0 0 3 5 5 0 0 3
4 21-1-09 5 5 0 0 3 5 5 1 0 2
5 4-2-09 5 5 0 0 2 5 5 0 0 3
6 18-2-09 5 5 0 0 3 5 4 0 0 4
7 4-3-09 5 4 3 0 3 5 3 4 0 2
8 1-4-09 5 5 0 1 4 5 5 2 1 4
9 29-4-09 5 5 5 4 3 5 5 5 5 1
10 13-5-09 5 5 5 4 2 5 5 5 4 4
11 27-5-09 5 4 5 0 3 5 5 5 1 5
12 10-6-09 5 3 4 1 3 5 5 5 0 5
13 24-6-09 5 4 5 1 4 5 5 5 0 4
14 8-7-09 5 3 1 1 5 4 4 3 0 5
15 22-7-09 3 3 0 1 5 1 3 3 1 5
16 16-9-09 2 2 0 1 5 1 0 0 1 5
17 30-9-09 3 1 0 1 5 0 1 0 0 5
18 14-10-09 1 1 0 1 5 1 0 0 0 5
19 27-10-09 3 1 0 1 5 0 0 0 0 5
20 11-11-09 2 1 0 1 5 0 0 0 1 5
21 25-11-09 4 0 0 0 5 1 0 0 0 5
22 9-12-09 3 0 0 0 5 0 0 0 0 5
23 21-12-09 5 0 0 0 5 2 0 3 0 5
Tabla 16: Resultados de abundancia con las diferentes sondas FISH para las dos líneas de la EDAR Carraixet.
Como puede observarse, todas las sondas presentan señal positiva en más de una muestra, lo que indica que, en algún momento, han
estado presentes estas bacterias en la EDAR. Las diferencias en la abundancia de unas y otras se comentan más adelante, tras realizar los
análisis estadísticos.

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