Este documento proporciona protocolos para el análisis de muestras de plantas, suelo y otros materiales en un laboratorio de fitopatología. Explica cómo tomar muestras de manera adecuada, identificarlas, procesarlas e inspeccionarlas para realizar un diagnóstico fitosanitario. Describe procedimientos como la esterilización, siembra, purificación de cultivos, preparación de montajes microscópicos y más, con el fin de aislar e identificar patógenos de manera efectiva.

2. Laboratorio de Servicios de
Fitopatología
Protocolos en Servicios de
Micología
. Betty Paz
Fitopatóloga

3. UN BUEN DIAGNÓSTICO Y CONTROL
FITOSANITARIO COMIENZA CON UN
ADECUADO MUESTREO EN LA FINCA

4. Servicios de Micología
• 1- A Quien está dirigido
Este servicio está dirigido a
productores, técnicos, estudiantes,
empresas semilleristas, entre otros.
• 2- Tipo de muestras:
Tejido vegetal, suelo y sustrato, en
casos especiales se analiza humus.

5. EXTRAER LA MUESTRA CUANDO LA
LESIÓN SE ENCUENTRE EN SU FASE
INICIAL
TOMA DE MUESTRAS VEGETALES
• Elegir una planta en donde se observe el problema
• Para cultivos anuales o perennes pequeños sacar la
muestra y/o planta entera
• Para cultivos grandes, y síntomas localizados en: flores,
ramas, frutos, raíces, hojas, tomar la muestra con 1 ó 2
órganos afectados completos

6. • En cuanto a las muestras
vegetales deben envolverse por
separado en papel, se colocan
en bolsa de polietileno limpias y
se mantienen al resguardo del
calor y la sequedad.

7. Es importante enviar la muestra al
laboratorio a la mayor brevedad
posible

8. Identificación de la muestra
• Nombre de la finca
• Ubicación (localidad, mcpio, estado)
• Fecha de colección
• Nombre del colector y teléfono
• Tipo de cultivo
• Condiciones del terreno
• Riego
• Temperatura promedio, humedad y otros de
importancia para el interesado

9. Muestras de suelo
• Debe ser una muestra compuesta por sub-muestras
simples tomando en cuenta la
uniformidad del lote.
• La muestra de suelo para su análisis se
procede a secarla al ambiente, durante
unos 2 a 4 días dependiendo de la
humedad que presente.

10. Representación gráfica de la toma
de muestras de suelo

11. Ingreso de la muestra al laboratorio
• Es importante que el ingreso de las
muestras al laboratorio de fitopatología
debe realizarse a más tardar 24 horas
después de haber sido extraída del
campo y así garantizar que los síntomas
que se observen en el laboratorio sean
los mismos que se observaron en
campo.

12. Procedimientos de Análisis
• Esterilización.
En el laboratorio del INIA-Mérida se realiza
mediante el empleo del método físico con
calor húmedo; para ello se emplea autoclave
el cual debe cumplir con los siguientes
parámetros en la esterilización:
15- 20 lb/pulg2 = 120°C
Tiempo= 15-20min
Debe esterilizarse: cajas petri, papel toalla,
papel filtro, vasos de vidrio, tubos de ensayo,
pipetas, agua destilada.

13. El medio de cultivo que se usa en la
mayoría de los casos es el PDA, con
adición de ácido láctico para lograr
un Ph de 5-6, ideal para la mayoría
de los hongos.

14. Plantas enfermas
Observación de síntomas y dependiendo de ellos
se toma la decisión del empleo del método
más adecuado o del uso de varios de ellos:
realización de cortes, raspados del tejido,
Inducción al desarrollo miceliar, inducción a
esporulación
Luego se procede a Lavar el material enfermo
con agua corriente y secar.

15. Seleccionar al tejido vegetal afectado
procurando que los trocitos queden de
0.3 a 0.5 cm de longitud.
Desinfectar los trocitos.
Enjuagar los trocitos en 3 pasos de agua
destilada estéril y secarlos
perfectamente, al secar bien,
disminuyen las contaminaciones.
Pasar 4 a 5 secciones a una caja de Petri
con PDA, sellado de la caja con cinta
adhesiva e incubación de 20 a 25 oC.

16. Cuando ingresan tejidos con
manchas foliares, chancros y
pudriciones radiculares, tallos
se realizan preparaciones
microscópicas de las
estructuras, con lactofenol

17. Cámara húmeda
Para tejidos con ausencia de señas de
patógenos
Se preparan cajas de Petri o cubetas con tapa,
con 1 o 2 hojas de papel toalla estéril y
humedecerlo con agua destilada estéril
(cámara húmeda).
Se pasa la sección del tejido infectado a la
cámara Húmeda.
Después de 24-72 hrs, se observa con el
microscopio estereoscópico, e toman las
esporas con agujas de disección y se
transfiere a una caja de Petri con PDA.

18. Cámara húmeda

19. Purificación de cepas
Es raro que al hacer una siembra o aislamiento,
se obtenga solo al hongo deseado,
normalmente también crecen microorganismos
contaminantes de los cuales es necesario
apartar al organismo de interés. Este proceso
se denomina purificación y normal mente
consiste en cortar puntas de micelio del borde
de la colonia en crecimiento, mediante aguja
de disección flameada. Esta pequeña porción
del hongo y agar se deposita en otras cajas
con medio de cultivo estéril y de esta forma se
obtienen cultivos puros.

20. Purificación de cultivos

21. Desinfección
Los tejidos enfermos contienen normalmente
diversidad de organismos que invaden los
tejidos muertos por el patógeno. Estos
contaminantes dificultan el aislamiento, por
lo que generalmente es necesaria una
desinfección previa a la siembra.

22. Desinfectantes más usados
Hipoclorito de sodio. El desinfectante más
usado es el blanqueador de uso domestico
(cloralex), basta mezclar una parte de esta
sustancia en cinco partes de agua destilada
para obtener el producto deseado ya que el
blanqueador viene al 5-6%, es decir que
normalmente se usa hipoclorito al 1-2%, el
tiempo de exposición varía de 30 a 90
segundos; el material viejo o muy
contaminado se puede tratar por 2 a 3 minutos
siempre que no se elimine el patógeno.
Alcohol etílico. Se usa generalmente al
70% por periodos de 30 segundos.

23. Para su observación al
microscopio compuesto, los
hongos requieren ser
preparados y montados en
portaobjetos. En estudios
preliminares o de rutina se
hacen preparaciones
temporales desechables

24. MONTAJE MEDIANTE CINTA
ADHESIVA
Colocar una gota de agua u otro medio de
montaje en el centro de un portaobjetos.
Cortar un trozo de cinta, 1 o 2 cm más grande
que la longitud del portaobjetos. Se Toma la
cinta por los extremos con dos de los dedos,
se deposita suavemente la parte engomada
sobre la superficie del hospedante o
crecimiento del hongo en medio de cultivo,
sin presionar demasiado, para evitar tomar
material en exceso u otras estructuras de las
plantas, diferentes a lo que queremos
muestrear y se procede a observar al
microscopio con los objetivos 10x y 40x.

25. CORTES DE CUERPOS FRUCTIFEROS
Se coloca el material enfermo bajo el
microscopio de disección, se separa una
porción superficial del tejido enfermo
mediante un corte longitudinal procurando no
dañar los cuerpos fungosos, esto facilitara los
cortes de los cuerpos ya que solo
manejaremos una pequeña porción de tejido,
el tamaño de la muestra puede variar, pero se
trata de dejar tiras de +/- 1 a 3 cm de largo por
+/- 1 a 3 mm de ancho, con un grosor de +/- 0.5
a 2 mm; esto depende de muchos factores
tales como el tamaño de los cuerpos a cortar,
consistencia del tejido etc.

26. MEDIOS DE MONTAJE
Agua destilada. Útil para
montajes temporales.
Lactofenol. Aunque existen otros
medios, este es uno de los más
usados por su fácil preparación
y alta eficiencia.
•

27. Procedimiento de lavado y
desinfección de tejidos
Desinfección de tejidos
con alcohol al 70% o con
NAcl 1% por 2 min
Cortar con bisturí
flameado en alcohol al
70%, sobre toalla de
papel
Lavado con
agua destilada
estéril y escurrir
Sembrar en placa con
medio bacteriostático
E. French

28. Cortes de tejidos

29. Muestras de suelo
En muestra seca:
Se toman 10 gr de suelo
Se colocan en 70 ml de agua destilada
estéril
Se lleva a agitaci{on por 2 horas
Se toma el suelo con espátula y se
siembra en medio de cultivo PDA
Incubación
Aislamiento con aguja de disección de
las colonias que crecen del suelo
Observación al microscopio compuesto
Identificación de géneros con las
claves (Barnett y Hunter)

30. Metodología para determinación de
Esclerocios
-Secar las muestras 3-4 días.
-Pasar el suelo por un tamiz N° 10 (2mm) y almacenar 1/2
Kg.- Tomar 3 vasos de precipitado.
-- Pesar 10 gr de suelo.- Agregar 60 ml de agua destilada,
agitar con varilla de vidrio durante 90 segundos.
- Agregar 10 ml de cloro al 10% , agitar 15 segundos y
dejar reposar por 45 segundos.
-- Pasar el sobrenadante por tamiz N° 30, lavar bien con
agua destilada recolectando las partículas más finas en el
tamiz 80 y descartando el restante.- Recuperar las
partículas del tamiz 80 mediante un lavado con agua
destilada dejando caer estas partículas en un beaker con
capacidad de 60 ml y papel filtro N° 1.
-- Dejar secar por 24 horas.

31. POR SU AMABLE
ATENCIÓN