Este documento presenta información sobre normas generales y métodos de esterilización en un laboratorio de microbiología. Explica los pasos para limpiar y esterilizar material de laboratorio como pipetas, cajas de Petri y tubos de ensayo usando métodos como autoclave, horno y soluciones químicas. También describe métodos de esterilización como calor seco, calor húmedo y filtración, así como la preparación y clasificación de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos.

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Microbiología Enológica 1
Práctica de
▐ Prácticas de Laboratorio Laboratorio
Primera parte
Normas generales para la práctica en un laboratorio de microbiologia
Objetivos:
-Reconocer el material de laboratorio y los elementos de limpieza
empleados.
-Desempeñarse con higiene y precaución en el ámbito del laboratorio.
-Conocer los métodos de esterilización más usados en un laboratorio
de microbiología.
-Comprender los fundamentos físicos y químicos de los métodos de
esterilización.
-Conocer la forma de preparación de medios de cultivo.
Limpieza y esterilización del material empleado
En las prácticas microbiológicas es fundamental que todos los objetos
sucios se recojan en recipientes para proceder a la limpieza y esterilización.
Las pipetas se separan del resto del material, recogiéndolas en
recipientes con solución desinfectante en los que permanecerá hasta
el lavado. Previo al lavado, se les saca, valiéndose de un alambre, el
trozo de algodón que ha actuado como filtro en el extremo superior.
Las cajas de Petri y los tubos de ensayo se destapan y se los coloca
boca abajo y se los hierve en agua jabonosa a fin de que escurran
todo el medio de cultivo que contienen.
Todo el material debe tratarse con precaución para evitar roturas.
El material que tiene colorantes se los separa del resto y se lo trata con
soluciones especiales, ya sea con HCl, HNO3 o mezcla sulfocrómica.
Si bien en Microbiología Enológica no se trata con microbios
patógenos todo material sucio debe tratarse con precaución y en los
casos realmente serios se debe esterilizar en autoclave antes de lavar.
Preparación del material para ser esterilizado
Una vez limpio el material debe prepararse convenientemente para
que una vez esterilizado conserve estas condiciones.
Las cajas de Petri se las envuelve en papel de diario, madera o de
seda y se esterilizan en horno a 170ºC.
A las pipetas se les coloca un trozo de algodón que actúa como filtro.
Se las envuelve en papel o se las coloca en estuches metálicos y se
esterilizan en horno a 170ºC.
Los tubos de ensayo, erlenmeyers o frascos se los esteriliza
previamente acondicionados en horno a 170 ºC, excepto cuando
Actividad
contengan medios de cultivo para lo cual se debe usar el autoclave.

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Microbiología Enológica 2
Teórico – Práctico: Práctica de
Laboratorio
▐ Esterilización
Definimos esterilización como la destrucción o eliminación de
cualquier forma de vida. Comprende a aquellos tratamientos que
dejan al objeto tratado libre de todo organismo vivo.
▐ Métodos de Esterilización
A.- Calor B.- Filtración
1.- Calor seco a.- Radiaciones
2.- Calor húmedo d.- Agentes químicos
3.- Calor directo
▐ A.- Calor
Los objetos pueden ser esterilizados por calor seco en horno o por
calor húmedo que proporciona el vapor caliente.
La esterilización por calor seco requiere más tiempo e intensidad por
dos razones:
- la conducción es menos rápida en el aire que en el vapor.
- las bacterias pueden sobrevivir en estado de desecación y así la
resistencia al calor casi se asemeja al de una endospora.
1.- Calor seco:
Se usa para esterilizar vidrios y otros materiales sólidos estables al
calor. Los objetos envueltos en papel son expuestos en un horno o
estufa a una temperatura de 170ºC durante 90 minutos. Se observa
que el envoltorio de papel adquiere un color ligeramente tostado.
2.- Calor Húmedo:
Se utiliza para esterilizar soluciones acuosas como medios de cultivo
o soluciones nutritivas.
a) El tratamiento se lleva a cabo en un autoclave, que puede llenarse
de vapor a una presión mayor a la atmosférica.
Debido a que la temperatura de ebullición del agua aumenta con la
presión podemos lograr mayores temperaturas dentro del autoclave.
Actividad

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Microbiología Enológica 3
Práctica de
Presion Temperatura Tiempo
Laboratorio
1 atm. 121ºC 15 min.
3/4 atm. 115ºC 20 min.
Estas temperaturas sólo se logran en un ambiente saturado en vapor
por lo que al iniciarse la operación todo el aire debe ser expelido y
reemplazado por vapor. Si queda algo de aire, la presión parcial de
vapor será inferior a la que marca el manómetro y por lo tanto la
temperatura lograda será inferior. Por eso conviene tener medidor
de vapor y temperatura independientes.
Funcionamiento del autoclave:
d
Se coloca agua hasta el falso fondo
Manómetro b
(a) que se encuentra en su interior.
c Se coloca el material a esterilizar
convenientemente preparado, se
cierra la tapa (b) ajustando en cruz
los tornillos (c) y se deja la espita (d)
abierta. Se encienden los mecheros
y se calienta el autoclave hasta
desprendimiento de vapor. Esto
indica que todo el aire que contenía
a el autoclave ha sido eliminado, es
decir que se ha purgado el aparato.
Se cierra la espita (d). Se observa en
el manómetro el aumento de presión.
A partir del momento en que llega a la presión escogida, se controla
el tiempo de esterilización. Luego se cierra la fuente de calor y se deja
enfriar (el manómetro vuelve a cero). Recién ahora se puede abrir la
espita y luego la tapa.
b) Tindalización: La esterilización por autoclave no puede ser
aplicada a soluciones que contengan sustancias que son afectadas por
el calor (termolábiles). Por ejemplo la leche, cuyo azúcar la lactosa,
se carameliza a 100ºC, a la vez que las proteínas se desnaturalizan.
En este caso conviene el calentamiento discontinuo o tindalización. Se
utiliza el autoclave a vapor fluente, es decir con la espita abierta, para
que la presión sea igual a la atmosférica y la temperatura no supere
los 100ºC. Esto se realiza durante 30 min. y en 3 días consecutivos.
Estos lapsos de 24 h. permiten a las esporas germinar y luego estas
células son destruídas en el siguiente calentamiento.
Actividad

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Microbiología Enológica 4
3.- Calor Directo: Práctica de
Esta forma de esterilización consiste en exponer directamente el
Laboratorio
objeto a la acción de la llama como por ejemplo: esterilización de
anzas (calentamiento al rojo), bocas de tubos (flameado) esterilización
de morteros (alcohol encendido).
▐ B.- Filtración
Se usa para aquellas sustancias que son alteradas en sus condiciones
físicas o químicas por acción del calor. Por ejemplo: sueros, soluciones
de enzimas, toxinas bacterianas, etc. Este método es muy usado en la
industria farmacológica.
Los filtros pueden ser de porcelana, yeso, vidrio incrustado, siendo los
más comunes los de membrana formado por una película de celulosa.
Los filtros se ubican en un portafiltros y se realiza la filtración por
succión y succión más presión. Las bacterias son eliminadas de las
soluciones debido al efecto de colador que ejercen los poros y por
la adsorción a las paredes de los poros por las diferencias de cargas
eléctricas entre microorganismos y poros.
Actividad

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Microbiología Enológica 5
Teórico – Práctico: Práctica de
Laboratorio
▐ Medios de cultivo
▐ Introducción
Se llama medio de cultivo al conjunto de sustancias nutritivas que
permiten el crecimiento y multiplicación de los microorganismos.
Los constituyentes de los medios de cultivo son:
Fuente de Carbono:
Este elemento aporta a los microorganismos esqueletos carbonados,
y de su catabolismo le brindan energía para su crecimiento y
multiplicación.
Puede ser suministrado a través de diferentes fuentes, como
hidratos de carbono (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, dextrosa,
xilosa, manita, almidón, etc.).
Fuente de Nitrógeno:
Se pueden suministrar en forma de NO3K, (NH4)2SO4.
Muchos medios de cultivo presentan en un solo compuesto las
fuentes de nitrógeno y carbono; como aquellos que combinan
peptonas, aminoácidos, algunas proteínas como la caseína, etc. El
más utilizado en microbiología es el extracto de levadura.
Sales minerales:
Estas son fuente de macroelementos (K, Na, S, P, Ca, Fe) y de
microelementos ( Mn, Zn, Co, Cu, Ni).
Factores de crecimiento:
Son aquellos elementos esenciales para el desarrollo de los
microorganismos, ya que estos no lo pueden sintetizar a partir de
compuestos más simples. Ej.: vitaminas, coenzimas, aminoácidos.
Para hacer selectivo un medio de cultivo se puede proceder de la
siguiente manera:
a. Aportando los compuestos nutritivos que un determinado
microorganismo necesita y no lo que otros necesitan.
b. Inhibiendo el desarrollo de algunos microorganismos no
deseados, a través del pH, que limite su desarrollo, o incorporando
sustancias inhibidoras, como por ejemplo colorantes (eosina, azul de
metileno), metales pesados (bismuto), agentes antimicrobianos
(pimaricina, gentamicina, cloranfenicol), sustancias químicas
(sales en concentraciones que inhiben el desarrollo).
Actividad

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Microbiología Enológica 6
Indicadores de pH: Práctica de
Cumplen la función de visualizar fácilmente si en un medio hay o no Laboratorio
crecimiento o si acidifica o basifica el medio. Ej: azul de bromotimol,
rojo neutro, rojo de fenol, púrpura de bromocresol, etc.
■ Los medios de cultivo se clasifican de la siguiente manera:
1. Por su composición:
- Naturales:
-de origen animal: leche, carne.
-de origen vegetal: mosto de malta, agua de levadura,
papa, zanahoria, interiores de frutos.
- Artificiales:
-químicamente definido: cuando se conoce exactamente
la composición de cada uno de los elementos que lo
constituyen.
-mixtos: constituidos por sustancias químicamente
definidas y sustancias naturales, como por ejemplo
levadura glucosada, agar papa glucosado, caldo extracto
de carne, caldo nutritivo, etc.
2. Por su función:
- Generales: son aquellos en cuales hay desarrollo de la flora
microbiana mas variada. Ej.: agar nutritivo standard (ANS), agar
papa glucosado (APG), caldo nutritivo.
- Diferenciales: son aquellos que debido a su composición química le
dan características especiales a los diferentes géneros bacterianos por
el aspecto de sus colonias. Ej.: agar levadura glucosado con Creta.
- Selectivos: son complejos, y sirven no solo para diferenciar entre
géneros, sino que además tienen acción selectiva sobre otros
microorganismos. Ej.: caldo nutritivo con ClNa 10%, agar nutritivo
tamponado a pH 5.
■ Los microorganismos tienen distintos requerimientos de pH
para su crecimiento y desarrollo, y de acuerdo a su pH óptimo se
clasifican en:
- Acidófilos: Dentro del pH 3.5 a 5.5 se encuentra la gran mayoría
de los microorganismos. Ej.: hongos y levaduras, bacterias lácticas
y acéticas.
Actividad

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Microbiología Enológica 7
- Neutrófilos: Desarrollan dentro del rango de pH 6.5 a 7.5. Ej.:
Práctica de
Bacillus, Azotobacter.
Laboratorio
- Basófilos: El pH óptimo de crecimiento y desarrollo es mayor a 7.5.
Ej.: nitritadores, Micrococcus ureae, Bacillus pasteurii, Sarcina urea.
Ajuste de pH
Cuando se construye un medio de cultivo, se debe llevar el pH al
óptimo para el desarrollo del microorganismo que nos interesa.
Para ello el pH se corrige adicionando soluciones ácidas o básicas
de acuerdo al punto al que deseemos llegar.
El solidificante más utilizado en la microbiología es el agar – agar,
es un poligalactósido extraído de algas marinas, fluidifica a 85 ºC.
No modifica sensiblemente el pH de los medios y no es atacado
por la mayoría de los microorganismos.
Distribución en tubos
- Tubos en estría o pico de flauta: llevan de 7 a 8 ml de medio solidificable.
Luego de ser esterilizados se los deja enfriar inclinados. Uso: para
mantenimiento de cepas.
- Tubos en punción: llevan de 10 a 15 ml de medio solidificable.
Se dejan enfriar en forma vertical. Uso: para preparar cajas de
petri, siembra en profundidad para microorganismos anaerobios
facultativos.
Actividad

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Microbiología Enológica 8
Trabajo Práctico: Práctica de
Laboratorio
▐ Preparación de medios de cultivo
▐ Objetivos
.Comprender el rol de los medios de cultivo en el estudio de los
microorganismos.
.Identificar los constituyentes de los medios de cultivo.
.Diferenciar los solidificantes usados en microbiología.
▐ Actividades
1. Preparación de medios de cultivo preformulados.
2. Preparación de medios de cultivo a partir de sus constituyentes.
Ajuste de pH.
3. Esterilización de los medios de cultivo.
4. Análisis de la constitución de los medios de cultivo. Evaluación de
las características de cada uno de los medios de cultivo empleados
en Microbiología Enológica
Actividad

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Microbiología Enológica 9
Teórico - Práctico Práctica de
Laboratorio
▐ Microscopia
Objetivos
-Describir el microscopio óptico y conocer su manejo.
-Adquirir habilidad para entender y aplicar las técnicas de coloración
y realizar observaciones al microscopio.
Introducción
El microscopio es de gran importancia en el desarrollo de la
Microbiología como Ciencia, siendo una herramienta básica en la
investigación de rutina.
El microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes: el
objetivo, situado cerca del objeto que se observa, y el ocular por
donde se observa.
La imagen aumentada que forma el objetivo es transmitida al ocular
que realiza el aumento final, de manera que el aumento total del
microscopio compuesto es el producto del de su objetivo por el de
su ocular.
Microscopio compuesto:
Esquema
Actividad

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Microbiología Enológica 10
Descripción de las partes Práctica de
■ Se distinguen:
Laboratorio
a. Parte mecánica:
Consta del estativo, el revolver portaobjetivos, el cabezal mono o
binocular y un sistema de enfoque macro y micrométrico.
b. Sistema de iluminación:
Formado por:
- Condensador: es un sistema de lentes que cumple la función de
concentrar el haz de luz formando un cono de luz con ángulo
suficiente para llenar la abertura del objetivo. Posee un diafragma
iris que controla el díametro del círculo de luz que incide en el
condensador. Al usar el objetivos a seco (10x a 40x) el diafragma solo
se usa parcialmente abierto, puesto que la definición y detalles son
mas claros con mediana iluminación. Con el objetivo de inmersión
(100x) se debe abrir el diafragma.
- Fuente de luz: puede ser una lámpara incorporada al microscopio o
provenir de una fuente externa que se enfoca hacia la platina (previo
paso por el condensador) a traves de un espejo plano.
c. Sistema óptico:
Formado por:
- Prisma: es un elemento que en los microscopios binoculares divide
el haz de luz que proviene del objetivo haciendo que lleguen dos a
los respectivos oculares. El prisma tiene un aumento que debe ser
multiplicado por el aumento total del microscopio.
- Oculares: pueden tener aumentos de 5x, 10x o 15x.
- Objetivos: en ellos vienen indicados el aumento propio del objetivo,
la apertura numerica, la distancia del objetivo al ocular en mm y en
algunos casos el espesor del cubreobjetos a utilizar.
Si es un objetivo especial de contraste de fase tambien viene indicado.
Clases de objetivos:
- A seco: son los de menor aumento, pueden ser 4x, 10x, o
40x. Se llaman así porque entre el objetivo y el preparado
que se observa hay aire.
- De inmersión: entre el objetivo y lo observado debe
haber un líquido de índice de refracción mayor que el del
aire (puede ser aceite de cedro o aceite sintetico). Estos
objetivos tienen aumentos de 90x o 100x.
Actividad

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Microbiología Enológica 11
Aumento del microscopio
Práctica de
Es el producto entre el aumento del ocular y el del objetivo.
Laboratorio
Por ejm.: ocular 10x y objetivo 100x. El aumento total es 1000.
Si el microscopio es binocular hay que considerar el aumento del
prisma, inscripto en el cabezal.
En la instancia presencial haremos la descripción del microscopio óptico
y sus partes, como así también lo utilizaremos para observar diferentes
microorganismos.
Actividad

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Microbiología Enológica 12
Teórico - Práctico Práctica de
Laboratorio
▐ Coloración de Microorganismos
Introducción
La morfología de las bacterias se puede examinar de dos maneras:
observando los microorganismos vivos sin teñir o bien observando
las células muertas teñidas con colorantes. Debido al índice de
refracción de los microorganismos, cercano al del agua, y a la falta
de color de la mayoría de ellos, se hace conveniente colorearlos.
Las coloraciones tienen como objeto visualizar además de la
morfología, las estructuras internas como vacuolas, cuerpos
nucleares, etc.
Aunque las bacterias no parecen muy distintas del medio que las
rodean, difieren mucho químicamente. Esta diferencia es la que
permite distinguir las bacterias por tinción, pues generalmente el
colorante reacciona con la célula bacteriana y no con el medio externo.
Los colorantes son compuestos orgánicos capaces de combinarse
con el protoplasma o determinadas estructuras celulares
cediéndoles color.
Los preparados que se usan en bacteriología son soluciones
acuosas. En muchos casos se disuelve primero el colorante en
alcohol y luego se diluye en agua.
En cambio el mordiente puede definirse como una sustancia
que forma un compuesto insoluble con el colorante fijándolo a la
estructura coloreada. Ej.: lugol.
- Coloración simple, en donde se utiliza un solo colorante. Ej.:
coloración con fucsina fenicada, azul de metileno, cristal
violeta, etc.
- Coloración compuesta, que utiliza más de un colorante. Ej.:
coloración de esporas y coloración de Gram (esta coloración es
también diferencial, ya que permite diferenciar dos grupos de
microorganismos).
- Coloraciones especiales, son las coloraciones de pared celular,
flagelos, etc. Estas pueden ser simples o compuestas.
- Coloración negativa, en donde se aplica un colorante que rodea la
célula pero no la tiñe. Para ello se usa una sustancia opaca que no
tiene afinidad por los constituyentes celulares (tinta china, nigrosina).
Actividad

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Microbiología Enológica 13
Trabajo Práctico Práctica de
Laboratorio
▐ Coloraciones de Microorganismos
▐ Objetivos
-Comprender la importancia de las coloraciones en las prácticas
microbiológicas.
-Desarrollar habilidad en la preparación de frotis y coloraciones.
▐ Actividades
Antes de aplicar las distintas técnicas de coloración es necesario
hacer el frotis del cultivo que se quiere observar.
A.Preparación del frotis
Consiste en fijar el material que se va observar, es decir “pegar el
material al portaobjetos”. El objetivo es matar los microorganismos,
coagular el protoplasma de la célula y adherirla al portaobjeto para
evitar que se lave el preparado durante el proceso de tinción.
1. Desengrasar el portaobjetos con alcohol o acetona.
2. Preparar en un tubo de ensayo una suspensión lechosa del
cultivo a observar.
3. Flamear el ansa, tomar una gota de la suspensión y transferirla
al centro del portaobjetos.
4. Distribuir esta gota en una superficie de 1 a 2 cm.
5. Secar la preparación en columna de aire caliente.
6. Fijar el extendido pasándolo tres veces por la llama. De esta
manera por la acción del calor la pared celular se adhiere al vidrio
del portaobjetos.
B.Coloración
B1.Coloración Simple
1. Poner en contacto el colorante (fucsina fenicada, cristal violeta,
azul de metileno, etc.) con el frotis, aproximadamente 1 min.
2. Lavar con agua para quitar el exceso de colorante.
3. Dejar secar. Puede acelerarse el secado en la columna de aire
caliente del mechero.
4. Observar el preparado con objetivo de inmersión.
Actividad

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Microbiología Enológica 14
B2.Coloración de Gram Práctica de
1. Colorear el frotis por 1 min. con cristal violeta y lavar con agua. Laboratorio
2. Tratar con solución de lugol por 1 min. y luego lavar y escurrir bien.
3. Decolorar por 15 segundos con alcohol 95º y lavar.
4. Colorear con safranina durante 1 min. y lavar con agua.
5. Dejar secar.
6. Observar el preparado con objetivo de inmersión.
B3.Coloración negativa
Para esta coloración no se prepara frotis previo, sino que se
procede así:
1. Depositar una gota de tinta china para bacteriología en el centro
del portaobjetos.
2. Mezclar con ella otra gota procedente de un cultivo líquido o de
una dilución hecha con un cultivo de medio sólido y agua estéril.
3. Extender sobre el portaobjetos y dejar secar al aire. Observar el
preparado con objetivo de inmersión.
Actividad

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Microbiología Enológica 15
Teórico – Práctico Práctica de
Laboratorio
▐ Cultivo de microorganismos
▐ Introducción
El trabajo en microbiología se basa en el estudio de poblaciones
microbianas; debido a la dificultad en la manipulación y la
limitación en la información que se puede obtener a partir del
examen de los individuos.
Una ciencia que colabora en este estudio es la TAXONOMÍA. La
misma se ocupa de las leyes de clasificación de los microorganismos
basándose en el conocimiento de todos sus caracteres.
La unidad taxonómica o de clasificación que comúnmente se utiliza
es la ESPECIE. Esta categoría del sistema jerárquico se define como
el conjunto de poblaciones clonales de elevada similitud fenotípica
que a su vez difieren de otras poblaciones clonales. Se entiende
por clon a una población de células bacterianas derivadas del
crecimiento de una sola célula parental convenientemente aislada.
También cabe aclarar que se entiende por fenotipo al conjunto
de caracteres hereditarios que se expresan, mientras que toda la
información contenida en el genoma de los individuos, que no
necesariamente se expresa, de una determinada especie constituye
el genotipo.
Como en un corto período de tiempo ocurren aumentos de
las poblaciones microbianas, los cambios genéticos pueden
establecerse y adquirir continuidad muy rápidamente, lo que hace
problemático diferenciar especies bacterianas sobre la base de un
pequeño número de caracteres.
Lo ideal sería una descripción completa de su fenotipo (expresión
de los caracteres) o mejor aún por su genotipo (información
genética). Como metodología habitual se utilizan criterios de fácil
determinación como los morfológicos, por su practicidad, algunos
de los cuales son: forma y tamaño, movilidad, reproducción,
tinción a colorantes especiales como la tinción de gram, presencia
o ausencia de estructuras como esporas, cápsulas y flagelos,
características de estructuras como paredes celulares y capas
mucosas, crecimiento en medios gelificados donde se puede
observar forma, tamaño, color y aspecto de las colonias producidas
por el desarrollo de los microorganismos, y en medios líquidos
donde se puede observar la turbidez, etc.
Sin embargo este criterio ofrece elementos de juicio insuficientes
para la caracterización definitiva y por lo tanto se tienen en cuenta
Actividad
otros criterios como son los mecanismos fisiológicos y bioquímicos,

16. Página
Microbiología Enológica 16
entre los cuales se incluyen información sobre crecimiento, muerte
Práctica de
y supervivencia en diferentes condiciones de cultivo (temperatura
Laboratorio
de crecimiento, pH, humedad relativa, etc.), ausencia o presencia
de determinadas enzimas (catalasa), como toman, utilizan y/o
almacenan la energía.
Estos criterios de identificación son utilizados para separar
microorganismos a nivel de especie, pero existe otro que es utilizado
para identificar diferentes cepas de una misma especie, (como ocurre
con las bacterias y virus fitopatógenos y en rizobiología), y es el
serológico, que se fundamenta en la interacción específica entre un
antígeno y su respectivo anticuerpo, para lo cual se utilizan técnicas
como son las placas de inmunodifusión y los test ELISA.
Todos estos son los criterios tenidos en cuenta en el proceso analítico
y que son utilizados en el proceso de síntesis para catalogar a los
microorganismos.
Existen dos maneras diferentes de agrupar estos criterios analíticos,
que dan lugar a la taxonomía clásica y la taxonomía numérica.
■ La taxonomía clásica utiliza criterios analíticos que ordena en
forma subjetiva empleando un sistema de prioridades en el uso
de los mismos: las características morfológicas y estructurales son
más importantes que las características fisiológicas y bioquímicas
(unos criterios tienen mas valor que los otros).
■ La taxonomía numérica preconiza la caracterización de los
organismos por la observación de un gran número de caracteres
independientes entre sí (arriba de 200 o 300), otorgándoles a cada
uno de ellos el mismo peso o valor. Los datos se procesan con
ayuda de una computadora y la afinidad entre dos poblaciones
queda determinada por un coeficiente de similitud o uno de
comparación.
En la práctica habitual de laboratorio no hace una clasificación
taxonómica de los microorganismos sino que se realiza la
IDENTIFICACIÓN. Este es el mecanismo que se sigue para
determinar la identidad de un microorganismo. Hasta donde es
posible, se dilucidan sus características por observación y ensayos
adecuados. El microorganismo se identifica adecuadamente
cuando se encuentra que la descripción de una especie es idéntica
con las características observadas.
La esencia de la identificación la integran dos clases de operaciones:
el aislamiento, que es la separación de un microorganismo
determinado de las poblaciones mixtas (cultivo con mas de una
clase de microorganismo) que existen en la naturaleza, y el cultivo,
que es el crecimiento de las poblaciones microbianas en ambientes
Actividad

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Microbiología Enológica 17
artificiales (medios de cultivo), bajo condiciones de laboratorio. Práctica de
Estas operaciones son las mismas independientemente de la clase Laboratorio
de microorganismo con el que se trabaje.
Para comenzar la identificación se parte un cultivo puro (cultivo
que contiene una sola clase de microorganismo). Esto implica no
solo el aislamiento de un determinado microorganismo a partir
de una población microbiana natural mixta (por ej. leche, suelo),
sino también el mantenimiento del individuo aislado y de su
descendencia, en un ambiente artificial que impide el acceso de
otros microorganismos. Este ambiente se puede crear en un tubo
de ensayo o caja de petri.
Para obtener un cultivo puro se utilizan técnicas como: el
enriquecimiento selectivo y la siembra en placas.
El aislamiento de cultivos puros por métodos de siembra en
placa implica la separación e inmovilización de los organismo
individuales sobre un medio nutritivo solidificado con agar.
Cada organismo viable da origen, al crecer, a una colonia cuya
transferencia puede hacerse fácilmente. La manipulación del
inoculo (material microbiano utilizado para sembrar) se realiza con
hilo de metal o ansa que se esteriliza en llama antes de utilizarse.
En este punto es necesario hacer notar la necesidad de evitar
contaminación externa, observando que el material inicial debe
estar estéril y que después de la inoculación debe estar protegido.
En el lugar de trabajo se deben evitar las corrientes de aire.
La siembra en estría para la purificación de cultivos es el método
mas empleado. El inoculo es tomado con el ansa y se va diluyendo
progresivamente con cada sucesiva estría, de manera tal que si las
estrías iniciales proporcionan un crecimiento confluente a lo largo
de la últimas estrías se van desarrollando colonias bien aisladas.
Al aislar a partir de una población natural mixta es posible obtener
desarrollo de colonias bien separadas unas de otras. Si entonces se
toma material de una de estas colonias y se transfiere a un medio
apropiado a esto no se le puede llamar cultivo puro, ya que por
cada colonia visible en la primera placa puede haber células de
otros microorganismos que quedaron depositados en el agar y
no lograron dar un crecimiento macroscópico a pesar de que son
viables. Por lo tanto nunca se debe tomar la colonia de la primera
placa para preparar un cultivo puro. Sino que se debe sembrar por
estría en una segunda placa. Si todas las colonias de esta segunda
placa resultan idénticas, una colonia bien aislada puede utilizarse
para establecer un cultivo puro.
La incorporación al medio de cultivo de sustancias inhibidoras
selectivas son útiles para este fin (por ej. antibióticos).
Actividad

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Microbiología Enológica 18
Práctica de
Laboratorio
Método de la siembra por estría para obtener cultivos
puros. a) Se toma del tubo un asa llena de inóculo, luego
se hacen estrías sobre una placa estéril de agar esparciendo
los organismos. Finalmente en la caja estriada después de la
incubación, se observa la presencia de colonias aisladas. De
estas colonias bien aisladas de donde usualmente se pueden
obtener cultivos puros.
Crecimiento confluente al
inicio de la estría
Colonias aisladas al
final de la estría
Actividad

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Microbiología Enológica 19
Trabajo Práctico Práctica de
Laboratorio
▐ Aislamiento de
microorganismos aerobios
▐ Objetivos:
- Comprender los pasos de una marcha bacteriológica para la
identificación de microorganismos.
- Desarrollar habilidades en el cultivo y aislamiento de microorga-
nismos
▐ Procedimiento:
Antes de realizar la identificación es necesario obtener el cultivo
puro para lo cual se procede de la siguiente manera.
1. A partir de una suspensión que contiene diferentes tipos de
microorganismos se realiza, con ayuda de un anza, una siembra
en estría en placa con agar nutritivo, con el objetivo de obtener
colonias aisladas. Se lleva a estufa durante 24 hs a una temperatura
de 25 ºC.
2. Describir el tipo de colonias que se obtienen, señalando la forma,
tamaño, coloración, irregularidades que presente, consistencia,
aspecto, etc.
3. A partir de una colonia bien aislada se hace otra siembra en
estrías en otra placa de petri que contenga agar nutritivo. Llevar a
estufa por 24 hs a 25 ºC.
4. Es importante que entre cada rotación de caja, cuando se haga la
siembra, se esterilice el anza a la llama antes de tomar el inoculo.
5. De aquella colonia bien aislada se siembra en tubo con agar
nutritivo pico de flauta para lograr la multiplicación del mismo.
Actividad