Sem etiquetado implementando el etiquetado en montevideo

1
Claudio Martínez Debat / Mailén Arleo
LaTraMA ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular Alimentaria
Seccion Bioquímica. Facultad de Ciencias.
Comisión Directiva Espacio Interdisciplinario.
Universidad de la República. Montevideo. Uruguay.
clamim@gmail.com
https://www.facebook.com/claudio.martinez.debat
Transgenicidad en alimentos de
consumo masivo.
ImplementaNdo el etiquetado en
Montevideo

2
Detección, Identificación
y Cuantificación de OGMs
F Alfonso, M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández,
F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez

Alimento transgénico
El término “alimento transgénico” hace referencia a aquel que contiene,
está compuesto, o ha sido producido a partir de OGMs.
Un alimento puede ser “transgénico” porque:
está formado por materiales derivados de un OGM (harina de maíz GM),
en su fabricación se emplearon microorganismos GM (yogurt)
contiene ingredientes que provienen de OGM (aceites, aminoácidos, ácidos
orgánicos, enzimas)

Fuente: http://www.mgap.gub.uy/portal/hgxpp001.aspx?7,1,144,O,S,0,MNU;E;2;2;12;5;MNU

Situación legal de los OGMs en Uruguay:
“Coexistencia Regulada”
Decreto 353/008: el etiquetado de los alimentos
que contienen OGMs es “voluntario "GM" o "no
GM", aplicable a aquellos alimentos en los que
se pueda comprobar mediante análisis del
producto final la presencia de ADN o
proteínas genéticamente modificados”

Nuevo marco regulatorio referente a OGMs
…”los alimentos que han sido manipulados genéticamente o que contienen
uno o más ingredientes provenientes de éstos que superen el 1% de los
componentes individualmente considerados, deberán ser etiquetados”…
 Alcance: Alimentos conformados por materiales derivados de OGMs
x Excluidos: Alimentos producidos a partir de microorganismos GM, o que contienen aditivos
producidos por OGM.
 Umbral 1%: presencia accidental o técnicamente inevitable
de transgénicos (contaminación en la producción, transporte
o almacenamiento).
Decreto Departamental N° 34.901 (Montevideo)

TRAZABILIDAD MOLECULAR ALIMENTARIA
Donde hubo Vida… ADNS QUEDAN
LaTraMa ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular Alimentaria
P Abete, M Amilibia, M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández, A Miller, E Miquel,
F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, Florencia Afonso, Luis Jurado, C Martínez Debat
Sección Bioquímica, Instituto de Biología,
Facultad de Ciencias, Universidad de la República.
Montevideo. Uruguay.

Análisis de componentes animales en alimentos
MeDeA ::: Método de Determinación de Especies Animales

Ejemplo: Detección de
contaminaciones/adulteraciones de
quesos de cabra con leche de vaca,
mediante técnicas moleculares
MeDeA
A Miller/ M Amilibia / J Correa

Descripción del problema
• Adulteración con Manzana (Malus
domestica) en matrices alimentarias
altamente procesadas. Ejemplo: Dulce de
Membrillo (Cydonia oblonga).
Lic. Mailén Arleo/José Pereyra
DeVas
Determinación de Especies Vegetales
en Alimentos

Análisis de Transgenicidad en
Alimentos de Consumo Masivo
LaTraMa ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular Alimentaria
M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández, E Miquel,
F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez
Sección Bioquímica, Instituto de Biología,
Facultad de Ciencias,
Universidad de la República.
En colaboración con
el Labo de Bromatología, Intendencia de Montevideo
el Labo de Genética Molecular, Desarrollo y Evolución de
Plantas del Instituto de Ecología de la UNAM, México DF.

Resultado de detección e identificación de eventos transgénicos para 20 muestras de harina de maíz (código M1 –
M20) que se encuentran en el mercado nacional. De las 20 muestras 18 arrojaron resultados positivos en cuanto
a la presencia del promotor 35S indicando presencia de maíz GM. Estas 18 muestras son variables en cuanto al
contenido de eventos particulares encontrándose todas las combinaciones posibles (solo Bt11, solo Mon810 o mezcla de
ambas). Cabe destacar que las muestras que dieron resultado negativo para 35S se mantuvieron coherentes para el

PRODUCTO ORIGEN DECLARA PRESENCIA DE MAÍZ PRESENCIA DE
TRANSGENICOS
EVENTO
Endógeno de maíz
(HMGA)
35S t-NOS MON810 BT11 GA21 TC1507
Cheetos Torciditos México Maíz + + - + - - -
Topitos queso México Maíz + - - - - - -
Tortillas naturales
(tlayudas)
México Maíz + - - - - - -
Tortillas naturales
(tlayudas)
México Maíz + - - - - - -
Doritos recargados México Maíz 100% natural + + + + + + +
Crujitos queso y chile México Maíz + + - + - - -
Rancheritos México Maíz 100% natural + + + + + + +
Fritos chile y limón México Maíz 100% natural + + + + + + +
Doritos pizzerolas México Maíz 100% natural + + + + + + +
Doritos Francia Maíz + - - - - - -
Tortillas chili Francia Maíz + - - - - - -
3D Francia Maíz + - - - - - -
Tortillas de Maíz Francia Maíz + - - - - - -
Nachitas USA Maíz + + - + - - +
3D barbacoa Argentina Maíz + + - + - - -
Fritos España Maíz + - - - - - -
Mix Bugles 3D´s España Maíz + - - - - - -
Mix Cheetos España Maíz + - - - - - -
Mix Doritos España Maíz + - - - - - -
Mix cheetos 2 España Maíz + - - - - - -
Resultado del rastreo del promotor 35S y t-Nos y de la identificación de los eventos Mon810, BT11, GA21, TC1507
para las 20 muestras de alimentos a base de maíz (snacks). El resultado se representa de la siguiente manera: - resultado negativo, + resultado positivo.
De las 20 muestras analizadas, ocho resultaron positivas para la presencia de transgénicos, con distinto perfil en el contenido de eventos.

Resultado del rastreo del promotor 35S y t-Nos y de la identificación del evento MON40-3-2
para las hamburguesas de carne (con presencia de soja), hamburguesas y milanesas de soja.
El resultado se representa de la siguiente manera: - resultado negativo, + resultado positivo.
PRODUCTO ORIGEN DECLARA PRESENCIA DE
SOJA
PRESENCIA DE
TRANSGÉNICOS
EVENTO
ENDOGENO DE
SOJA
35S t-NOS MON40-3-2
Hamburguesa de carne
(1)
Uruguay proteína vegetal + + + +
(3)
s/declaración sin declaración + + + +
(5)
Uruguay proteína de soja + + + +
(6)
Uruguay proteína de soja + - - -
(7)
Uruguay proteína de soja + + + +
Hamburguesa de soja
(1)
Uruguay soja certificada no
transgénica
+ + + +
Hamburguesa de soja
(2)
s/declaración sin declaración + + + +
Milanesa de soja (3) Uruguay soja certificada no
transgénica
+ - - -
Milanesa de soja (4) Argentina soja + + + +
Milanesa de soja (5) s/declaración sin declaración + + + +
Tofu (6) s/declaración sin declaración + + + +
Panchos de soja (7) Uruguay proteína de soja + - - -

2011-2013: “Flujo de Transgenes entre
Cultivos Comerciales de Maíz en Uruguay”.

En 3 de 6 situaciones se detectó presencia del
transgen en la progenie de cultivos no OGM.
El evento detectado corresponde al del
presunto origen de contaminación
Se detectó interpolinización a distancias de 20,
100 y 330m

Construcciones génicas de distintos
eventos de maíz aprobados en Uruguay
p-35S Intrón hsp70 cry 1 A (b)
t-Noscry 1 A (b) patp-35S p-35S intrón 1 adh t-Nosintrón 6 adh
p-1 ract intrón 1 ract CP4 EPSPS t-Nos
OTP
MaízMON810
MaízNK603
MaízGA21
MaízTC1507
p-ubiq mz intrón 1 ubq cry 1 F t-ORF 25 p-35S pat t-35Sexón 1 ubq
p-ract1 intrón 1 ract CTP2 CP4 EPSPS t-Nos intrón hsp70 CP4 EPSPS t-Nosp-35S CTP2
MaízBt11
MaízMon89034
p-e35S intrón 1 ractL-Cab Cry 1A.105 t-HSP17 intrón hsp70 Cry 2Ab2 t-Nosp-FMV TS-SSU
MaízMir162
p-ubiq mz T-35S p-ubiq mz pmi t-Nosvip3Aa20 intrón 9 PEPC

Sistema de detección de OGMs
 Detectar el DNA transgénico
insertado.
 Detectar la nueva proteína
expresada.
 Detectar el producto de una
reacción enzimática.
 Fin: Garantizar la trazabilidad de los productos GM y el cumplimiento
de las normas de etiquetado.
 Estrategia: Explotar las diferencias entre el organismo transgénico y la
variedad no modificada.

Métodos cualitativos
Determinan la presencia o ausencia de material transgénico en
materias primas o alimentos procesados.
Detección de proteínas
(Elisa, Strips)
Detección de ADN
(PCR, microarreglos)

Técnicas Inmunológicas
Tiras reactivas (Strip)ELISA
 Rápidos, sencillos.
 Requieren poco equipamiento.
Sirven únicamente como rastreo primario de OGMs, no son específicos de
evento.
 No son apropiados para utilizar en alimentos con alto grado de procesamiento.

Microarreglos
Se basa en la
hibridación del ADN
de la muestra, sobre
un gran número de
sondas fluorescentes
adheridas en una
matriz sólida.
 Permite el rastreo simultáneo de un gran número de fragmentos de ADN
diferentes en una mezcla.
 Incrementa la facilidad y velocidad del análisis.
 Actualmente en desarrollo.

PCR
 La PCR es una técnica de amplificación enzimática in vitro que permite
amplificar un fragmento específico de ADN, situado entre dos regiones de
secuencia conocida.
 Usa ciclos sucesivos de calentamiento y enfriamiento de las muestras para
producir copias de la molécula de ADN blanco.

reacción de PCR
1era
etapa – Desnaturalización del ADN molde
Temperatura = 92- 97 ºC Temperatura = De acuerdo a la composición de
las bases del par de cebadores (55-65°C)
2da
etapa – Apareamiento de los cebador
5´
5´3´
3´
OH
OH
ADN pol
ADN pol
dNTPs
dNTPs
Temperatura = 68 - 72 ºC
(depende de la enzima)
3era
etapa – Extensión

Ciclado
 Muy sensible, permite la detección de secuencias transgénicas a nivel de
trazas.
 Específica, capaz de detectar la secuencia blanco de ADN dentro de una
mezcla compleja.
 Apropiados para detectar e identificar eventos de transformación.
CICLADO – genera una
amplificación exponencial
del fragmento de ADN
deseado

PlantaPlanta PromotorPromotor PotenciadorPotenciador Gen de interésGen de interés TerminadorTerminador PlantaPlanta
RastreoRastreo
Específica de genEspecífica de gen
RastreoRastreo
Específica de construcciónEspecífica de construcción
Estrategias de Detección
e Identificación de transgenes
por PCR
Existen cuatro niveles de especificidad para los análisis de transgénesis por PCR,
dependiendo del blanco al cual estén dirigidos los cebadores. (De arriba hacia abajo va
aumentando el nivel de especificidad).
Específica de eventoEspecífica de evento Específica de eventoEspecífica de evento

Normas Internacionales
y protocolos validados
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/
ISO 17025

Flujo de trabajo
Medidas para evitar la contaminación
1. Organización física del laboratorio y flujo de trabajo

Control de la contaminación
2. Buenas prácticas de laboratorio
 Descontaminar el área de trabajo con hipoclorito 10%, EtOH 70% y H20mq.
 Usar túnica y guantes sin talco.
 Realizar alícuotas de los reactivos de PCR.
 Usar materiales descartables.
 Usar puntas con filtro para evitar dispersión de aerosoles.
3. Uso de medidas específicas para la
descontaminación
 Radiación Ultravioleta.

Procedimiento general para
la detección de OGMs
Muestra de ADN
negativo
positivo
Si No
>1% GM
Requiere etiquetado
< 1% GM
No requiere etiquetado
Detección / screening
Identificación
Evento autorizado?
Cuantificación
Materia prima o
alimento
Homogenización
Extracción ADN
Cuantificación
SiNo
Prueba de inhibición
Amplificación de un gen
endógeno de la especie
*
*

Muestreo
Toma de muestra en
el campo
Manejo de
la muestra
Homogenización
Toma de sub-muestra
Extracción de ADN
Amplificación por PCR
DETECCIÓN
Toma de sub-muestraComo asegurar la certeza de los resultados:
Obtener muestras representativas y homogéneas del
material para realizar la detección.
Optimizar los métodos de extracción de ADN.
Optimizar los protocolos de amplificación por PCR.
Establecer y optimizar los límites de detección.

Extracción de ADN
 Protocolos validados
1.Lisis en presencia de detergentes y sales (CTAB, NaCl, EDTA, temperaturas elevadas)
2. Separación de proteínas y lípidos (Extracción con solventes orgánicos, centrifugación)
3. Precipitación del ADN (etanol 100%)
4. Lavado del ADN (EtOH 70%)
5. Disolución (H20mq)
 Kits comerciales
 Basados en la absorción de ADN a matrices de sílica
Doyle J. J., and Doyle J. L. (1987). A rapid DNA isolation procedure for
small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11–15.

Cuantificación del ADN extraído
 Análisis espectrofotométrico del ADN (Absorbancia a 260nm)
Espectrofotometría de miscrovolúmenes (Nanodrop)
100ng ADNg.
PCR convencional
50ng ADNg.
qPCR

Amplificación por PCR
Es necesario utilizar controles en todos los análisis:
 Control Interno positivo (CIP): Este control permite verificar que se ha extraído
correctamente el ADN de la muestra y que no hubo inhibición. Generalmente se
utiliza un gen endógeno de la especie.
 Control positivo GM: Consiste en una muestra (o control) que contiene la secuencia
diana buscada. Confirma que la PCR funcionó correctamente.
 Control negativo de PCR : Consiste en un tubo que contiene H20 en lugar de
muestra. Permite detectar la presencia de contaminantes en los reactivos.
 Control Negativo (no-GM): Reacción que se lleva a cabo sobre ADN extraído de un
organismo vegetal, no GM. Permite detectar la existencia de falsos positivos.
Utilizado generalmente como control de contaminación de la extracción de ADN.

Análisis de la PCR - Electroforesis
M
uestra
G
en
endógeno
C
ontrol –
C
ontrol +
M
uestra
G
en
endógeno
C
ontrol –
C
ontrol +
POSITIVO NEGATIVO
Muestra C – (PCR) C + GM CIP C (no-GM) Resultado
+ - + + - Positivo
- - + + - Negativo
+ - + + + Inconcluso
- - + - - Inhibición
- - - - - Inconcluso

Variantes de la PCR utilizadas para la
detección de OGMs
PCR Multiplex
 Detección simultánea de varias secuencias diana (utilizado para detectar varios
eventos de transformación a la vez).
 Utiliza múltiples pares de cebadores
- Tm similar entre todos los pares
- Muy específicos
- No deben formar dímeros entre sí
 Los segmentos de ADN a amplificar, deben diferir en tamaño
para poder ser resueltos mediante electroforesis.
(PCR convencional)
PCR en Tiempo Real

Métodos Cuantitativos
Determinan la cantidad de material transgénico presente en
materias primas o alimentos procesados.
 PCR en Tiempo Real o qPCR
El fundamento de la Real Time PCR es el
mismo que el de la PCRconvencional.
Se basa en la detección del producto
amplificado ciclo a ciclo.
La PCR se acopla a la detección de un
reportero fluorescente, cuya señal aumenta
en proporción a la cantidad de producto de
PCR generado en cada ciclo.

Fundamento de la qPCR
A medida que progresa la reacción, se recogen los datos de fluorescencia (Rn) y se construye
un gráfico, respecto al tiempo de reacción (n° ciclos).
La cuantificación se realiza en la fase exponencial, donde la eficiencia es constante y existe
buena correlación entre el producto amplificado y la concentración inicial de moléculas
diana.

Cinética de amplificación
 Cuanto más bajo es el valor de Ct, mayor es la cantidad inicial de ADN genómico en la muestra
Ciclo umbral (Ct)
n° de ciclo en el cual la intensidad
de fluorescencia se eleva por
encima del ruido de la técnica y es
proporcional al número de copias
iniciales de la reacción.
Eficiencia de amplificación del 100%
Ct

Ventajas de la qPCR frente
a la PCR convencional
 Mayor precisión, y resolución.
 Mayor especificidad.
 Mayor sensibilidad (LOD =0.01% GM ~ 2-10 copias de ADN ).
 Se pueden realizar ensayos cualitativos y cuantitativos.
 No se requiere ningún proceso post-PCR
 Se ahorra tiempo y se minimiza la contaminación.
 Sistemas de detección de fluorescencia:
• Agentes intercalantes (SYBR Green)
• Sondas específicas marcadas con fluorocromos (TaqMan)

Agente intercalante SYBR Green
El colorante se une al surco menor del ADN bicatenario.
Como consecuencia de esta unión, se produce un
incremento de la señal fluorescente. A medida que
aumenta la cantidad de ADN sintetizado tras cada ciclo
del PCR, aumenta el número de moléculas de ADNdh y
así la emisión de fluorescencia.
Desventaja: No es específico de secuencia.
Debe recurrirse al análisis de la curva de disociación

Análisis de la curva de disociación
Melting curve.
Se traza la primera derivada negativa (-
d(Rn)/dt) de la intensidad de fluorescencia
frente a la temperatura de reacción. Se genera
un pico característico a cada amplicón,
conocido como temperatura de disociación
(Tm). Mediante la comparación de Tm de los
productos de PCR, se puede detectar la
presencia de la secuencia de ADN buscada, y
discriminarla de la presencia de un amplicón no
objetivo adicional.

Características del SYBR Green
Ventajas:
Versátil
Bajo costo
Alta sensibilidad
Ideal para ensayos de presencia-ausencia GM
(screening, identificación de eventos)
Desventajas:
Fluorescencia inespecífica
Ajustar muy bien el sistema de amplificación
Evitar fragmentos inespecíficos y dímeros de
cebadores.

Sondas de hidrólisis (TaqMan)
La sonda de hidrólisis es un
oligonucleótido de 20 bases de longitud,
que contiene un colorante fluorescente
en el extremo 5´, y un colorante
inhibidor (quencher) en el 3´. La
actividad nucleasa de la enzima ADN
polimerasa, cliva a la sonda de hidrólisis
durante la etapa de extensión del
amplicón, lo que produce una emisión
de fluorescencia en cada ciclo de PCR.
Esta emisión es proporcional a la
cantidad de producto formado.

Ventajas de la utilización de sondas
TaqMan
Detección de productos de
manera específica.
No requieren el análisis de
la curva de melting.
Diseño de sondas para cada sistema de
análisis.
Detección simultanea de múltiples
productos de amplificación (multiplex).

Límite de detección y
cuantificación
 Límite de detección (LOD): Menor concentración de ADN GM que puede ser
detectada en 95% de las determinaciones (LOD Relativo en % m/m, LOD absoluto
en n° de copias)
Técnica de qPCR: LOD Absoluto 2-10 copias GM
LOD Relativo 0,01% material GM
 Límite de cuantificación (LOQ): Menor concentración de ADN GM que puede
detectarse cuantitativamente con un nivel aceptable de precisión y exactitud.
Técnica de qPCR: LOQ Absoluto 100 copias GM
LOQ Relativo 0,1% material GM

 El contenido relativo de OGM (porcentaje) se determina normalizando la cantidad de
secuencias específicas del OGM con respecto a la cantidad de un gen específico de la
planta.
 Se realizan dos curvas patrón para realizar la cuantificación relativa:
Gen endógeno:
• Específico de la especie a analizar
• Presente en todas las variedades
• Copia única por genoma haploide
Secuencia transgénica
• Región común a distintas variedades (P-35S)
• Región específica (evento específico)
 Cálculo del porcentaje:
Cuantificación Relativa de OGMs
% GM = ADN GM x 100
ADN Referencia
Soja: Lectina
Maíz: Zeína, invertasa, hmga

Materiales de Referencia
Certificados (MRC)
 Herramienta indispensable para asegurar la calidad de los métodos de
análisis.
 Elementos con propiedades estables y uniformes autenticadas por una
institución reconocida especializada.
 Cada uno se certifica en relación a la fracción másica o la cantidad de
copias de ADN de un evento específico (expresado en porcentaje GM).
 Material homogéneo con cigosidad conocida.

Interpretación y reporte de
resultados
Expresión de un resultado negativo:
x Nunca debe expresarse como …. “la muestra no contiene OGM”…
Puede aparecer en el reporte …..”no se detectó la presencia la secuencia x”
“no se detectó el evento x”
Expresión de un resultado positivo:
…”Se detectó la presencia de la secuencia x”…
….”Se detectó la presencia del evento x”…
Cuantificación del contenido GM:
El contenido de OGM (especificar el OGM) según lo determinado por la detección de
(especificar la secuencia diana buscada) derivado de (especificar especie) es X ±
incertidumbre%. "(Especificar unidad utilizada.)

Etiquetado de alimentos
 Alimento que contiene <1% material GM: No se etiqueta
 Alimento que contiene >1% material GM: Se etiqueta
…..”Alimento genéticamente modificado”
…..”alimento producido a partir de (nombre de la especie)

Monitoreo de productos
comercializados en Uruguay
 Fueron muestreados varios productos a base de maíz, tales como:
Tortillas de maíz – 12 muestras
Productos de copetín (snacks) – 19 muestras
Cereales de maíz – 19 muestras
 Screening de OGMs: Promotor 35S, Terminados nos
 Identificación de eventos: Mon810, Bt11, Ga21, TC1507 y Bt176.
 Cuantificación: CAMVP-35S

Resultados
n° muestras
analizadas
presencia de CAMVP-
35S y T-nos
Contenido
GM> 1%
tortillas 12 8 4
snacks 19 16 10
cereales 19 8 4
Total 50 32 18
porcentaje 100% 64% 36%
Bt 11 Mon810 Ga21 TC1507 Bt176
positivos 24/32 21/32 10/32 4/32 0/32
porcentaje 75% 65,6% 31,2% 12,5% 0%

Formación de un Núcleo Interdisciplinario
UdelaR Agronomía, Química, Ciencias,
Medicina, Nutrición, Abogacía, Sociología,
RETEMA, …
MSP Ministerio Salud Pública
MTVOT-DINAMA Dirección Medio Ambiente
CNFR Comisión Nacional de Fomento Rural
Red de Semillas Criollas
ONGs Slow Food, Redes Amigos de la Tierra
etc ..

59
Agradecimientos: SB-FC, UdelaR; LB-IM; Beatriz Paulino (BePé);
Andrés Carrasco (RIP); Elena Álvarez-Buylla (UNAM)
Muchas gracias por vuestra atención
Claudio Martínez Debat, QF, PhD
LaTraMA ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular Alimentaria
Sección Bioquímica. Facultad de Ciencias.
Universidad de la República. Montevideo. Uruguay.
clau@fcien.edu.uy
https://www.facebook.com/claudio.martinez.debat

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