Aplicaciones de la pcr en la detección de alimentos transgenicos

1. APLICACIONES DE LA PCR EN LA DETECCIÓN
DE ALIMENTOS TRANSGÉNICOS
Integrantes:
UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE BIOLOGIA
POYECTO DE INVESTIGACION

2. ÍNDICE DE CONTENIDO
I. Introducción
II. Antecedentes
III. Material y método
IV. Resultados
V. Discusión
VI. Conclusión

3. I. INTRODUCCIÓN
 Los alimentos transgénicos son organismos modificados genéticamente mediante el
uso de la ingeniería genética.
 Últimamente los alimentos transgénicos son un problema que molestan a la
sociedad debido a que los consumidores no saben discernir entre los alimentos
que han sido modificados genéticamente de los que no lo han sido.
 Siendo nuestro objetivo general conocer los mecanismos de identificación de
alimentos transgénicos con el uso de la PCR; y nuestro objetivo específico es
identificar los alimentos transgénicos con las diferentes aplicaciones de una PCR

4. II. ANTECEDENTES
Jiménez, (2003)
Realizó un estudio en la
detección de los alimentos
y cultivos modificados
genéticamente
Escogió al azar alimentos procesados que contuvieran soya o
maíz como base de su fabricación y cultivos que circulan en
Costa rica
Para la extracción de ADN empleó un método estándar basado
en purificaciones con cloroformo y precipitación diferencial con
alcohol y analizó también otro método por columnas con matriz
de sílice. Luego mediante PCR se amplificó el ADN.
Concluyó en la existencia de al menos una de las bandas en
varias de las muestras analizadas tales como harina, leche, carne
de soya, torta de maíz, entre otros

5. Carvajal, (2017)
Determinaron la presencia de
secuencias de ADN derivadas de
maíz y soya GM, en una gama de
piensos y alimentos, sin procesar y
procesados, comercializados en
Costa Rica.
Emplearon el método cualitativo estándar, de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) en punto final, para la detección
de material GM a partir las regiones comunes del
promotor 35S y el terminador NOS.
Los resultados demostraron que existen alimentos y piensos
derivados de cultivos GM en el mercado local.

6. Oviedo et al, (2020)
Identificaron la presencia de
transgenicidad en alimentos procesados
para consumo humano y animal, así
como en semillas provenientes de
algodón.
Utilizaron la técnica de PCR tiempo real dirigida a la secuencia
promotora 35S, derivada del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV), como marcador para detectar presencia de transgenes
en alimentos procesados para consumo humano y animal y en
semillas de algodón.
Concluyeron que la presencia de trazas de OGM en alimentos
procesados muestra la importancia de continuar este monitoreo
para proveer elementos de discusión en cuanto a trazabilidad
alimentaria y potencial flujo de transgenes en material vegetal
silvestre.

7. III. MATERIALES Y MÉTODOS
PARA LA ELABORACIÓN DE ESTE PROYECTO
Artículos obtenidos en sistemas de investigación científica: Redalyc, Pubmed, y revistas de
investigación: “Detección molecular de secuencias de ADN transgénico en alimentos de
consumo humano y animal en Costa Rica” (Carvajal, Ureña, Umaña, Sancho, Solano,
Arleo, Martínez y Umaña, 2017); “PCR technology for screening and quantification of
genetically modified organisms (GMOs)” (Holst-Jensen, Ronning, Loveseth y Berdal,
2003). “Detección del promotor 35S mediante PCR tiempo-real: indicador de
transgenicidad en alimentos y Gossypium sp.1” (Oviedo, García, Solano, Martínez, Sancho
y Umaña, 2020).
Informe de práctica de especialidad desarrollada en el año 2003: “Detección de Alimentos y
de cultivos modificados genéticamente. Cartago.” (Jiménez, 2003).

8. Jiménez, (2003)
Productos y cultivos de maíz
y algodón que pudieran ser o
contener material modificado
genéticamente, ya sea
procesados, enlatados, frescos
o sin procesar
Utilizaron: el sistema GMO Screen Advanced Screening.
Materiales utilizados por los investigadores
 Buffer lisi
 Buffer C4
 Buffer CQW
 Buffer C5
 Incubadora
 Agitador orbital (shaker
orbital precision scientific)
 Vórtex
 Un mortero con nitrógeno líquido
 Tubo de reacción
 Proteinasa K
 Isopropano
 Cloroformo
 Alcohol al 75 %
 Agua estéril desionizada
 Etanol
Buffers
Materiales Equipos

9. Carvajal, et al (2017)
36 alimentos sólidos de
consumo humano y animal  Disruptor mecánico
 Espectrofotómetro (nanodrop 2000)
 Hipoclorito de sodio comercial al 10%
 Ctab
 Cloroformo: octanol, isopropanol frío
 Geles de agarosa al 1,0%
 Solución tris/borato/EDTA (TBE) 1X
 Exonucleasa I
 Fosfatasa alcalina termosensible fastap
 Etanol 95%
 Acetato de sodio 3M.
Materiales
Equipos

10. Oviedo et al, (2020)
Utilizaron
24 muestras de alimentos sólidos de consumo tanto humano
como animal, con o sin ingredientes de maíz o soya en su
fabricación.
Espectrofotómetro, termocilcador, fluoróforo SYBR-green y el
kit FastStart Essential DNA Green Master (Roche Diagnostics),
entre otros.
También tuvieron muestra de tortillas tostadas orgánicas, así
como el maíz y la masa utilizada para su manufactura y por
último utilizaron muestras de semillas de plantas de algodón

11. Se realizó también la técnica de PCR y el método de detección de proteínas en
donde se realizaron cuadros con la muestra, su caducidad y su procedencia.
Jiménez
, (2003)
Las muestras se escogieron al azar
Para la extracción del DNA se realizó un método estándar, utilizando el sistema
GMOScreen Advanced Screenin
Un método de Extracción mediante columnas propuesto por la prueba
GENESpin para el aislamiento de ADN de alta calidad.
Para la cuantificación se realizó por electroforesis en gel de agarosa, en donde la estimación
de la cantidad de ADN presente en la muestra se realizó comparando la fluorescencia
emitida por esta y por el ADN estándar; y por espectrofotometría, en donde se utilizó
espectrofotómetro GeneQuant RNA/DNA calculator (Pharmacia Biotech, 80- 2105-20)
utilizando un rango de luz UV.
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Metodología empleada por los investigadores

12. Los productos de PCR purificados lo secuenciaron en ambas direcciones en un analizador
genético multicapilar. Las secuencias recuperadas las editaron con el programa
bioinformático Geneious R9.
Carvajal, et al
(2017)
La extracción de ADN total lo realizaron según el protocolo de Doyle y Doyle (1987)
La concentración e integridad de los ácidos nucleicos recuperados lo determinaron en un
espectrofotómetro y el perfil de ADN total lo visualizaron en geles de agarosa al 1,0% en
solución TBE 1X
Las muestras de ADN lo analizaron con el uso de cebadores. La reacción de amplificación
lo realizaron en un termociclador por: 4 min a 94°C, seguida de 33 ciclos de 30 s a 94°C,
30 s a 60°C y 30 s a 72°C, seguido de una extensión final a 72°C por 7 min.
Para visualizar los productos de PCR realizaron una electroforesis en gel de agarosa al 3%
en TBE 1X, con un tiempo de movilidad electroforética de 100 min a 80V.
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13. Para las amplificaciones emplearon un termociclador Light Cycler 96 (Roche) y utilizaron el
programa LightCycler® para obtener los valores de Ct de cada muestra.
Oviedo et
al, (2020)
1 Para la extracción y cuantificación del ADN total aislaron y purificaron el ADN según el
protocolo Doyle y Doyle (1987)
Además mediante la cuantificación espectrofotométrica a una longitud de 260, 280 y 230 nm
determinaron la concentración y pureza del ADN.
Finalmente, mediante electroforesis observaron el perfil del ADN para la evaluación de la
integridad del ADN y posible ARN remanente.
Detectaron secuencias transgénicas derivadas de OGM por el método SYBR-green PCR
tiempo real.
Para la reacción de PCR tiempo real utilizaron el fluoróforo SYBR-green y el kit FastStart
Essential DNA Green Master (Roche Diagnostics).
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14. IV. RESULTADOS
Tabla 1: Evaluación de la ausencia/presencia por PCR punto final de trazas de genes endógenos de maíz/soya y de la
detección de secuencias específicas de transgenicidad y eventos específicos de OGM en 36 alimentos de consumo humano y
animal. Carvajal, et al (2017).

16. En la figura 1, se evidencia los productos de amplificación de genes endógenos de maíz (HMGA), soya
(Le1) y ensayos de detección de OGM (35S y t-nos) en un rango de peso molecular entre los 79 pb y
105 pb. Productos de amplificación de eventos transgénicos específicos de maíz (MON810, Bt11,
NK603, GA21) y el evento GTS 40-3-2 en soya con un rango de peso molecular entre 70pb a 113pb.
Los códigos en los carriles corresponden a las muestras de la tabla 1. Los controles negativos (C-) son
controles de reacción PCR sin ADN. Escalera de peso molecular GeneRuler 1 Kb (Thermo Scientific).
Figura 1: Productos de PCR visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa. Carvajal, et al (2017).

17. Tabla 2: Detección por PCR tiempo real de una secuencia específica del promotor 35S derivado de OGM en
veintisiete muestras de alimentos de consumo humano y animal. Oviedo, et al (2020)

18. Figura 2. Cuantificación de ADN mediante geles de agarosa. Jiménez, (2003).
En la figura 2 se observa que en el Carril 1: Marcador de peso molecular (DNA Length Standard); Carril 2: Control de
cantidad (DNAAmount Standard); Carril 3 y 4: Maíz para palomitas método de extracción estándar (GMOScreen);
Carril 5 y 6: Harina de soya, extracción estándar; Carril 7: Palomitas para maíz, extracción por columnas (GENESpin

19. Se observa en la figura 3 que en el Carril 1: Marcador de peso molecular (DNA Length Standard); Carril 2-4:
región del cloroplasto, 35S y NOS de maíz para palomitas respectivamente
Figura 3. Análisis electroforético de una amplificación por PCR. Jiménez, (2003).

20. En la figura 4 se observa una PCR modificada con dos bloques de 20 ciclos cada uno con temperaturas de
hibridación de 62°C y 58°C respectivamente, su resultado: en el Carril 1: Región común del cloroplasto; Carril
2: Región 35S y Carril 3: Región NOS.
Figura 4. Análisis electroforético de los productos de amplificación del ADN del arroz transgénico experimental
(Control positivo). Jiménez, (2003).

21. En la figura 5 observamos que el Carril 1-3: Región cloroplasto, 35S y NOS Arroz Transgénico
(Control Positivo) respectivamente; Carril 4-6: Región cloroplasto, 35S y NOS tortillas tostadas de
maíz respectivamente; Carril 7-9: Región cloroplasto, 35S y NOS harina de soya respectivamente
y Carril 10-12: Región cloroplasto, 35S y NOS Algodón Transgénico (Control positivo).
Figura 5. Análisis electroforético de los productos de amplificación. Jiménez, (2003).

22. V. DISCUSIÓN
Según los resultados de las investigaciones consultadas, muestran que el trabajo
realizado por Carvajal, et al (2017), mediante la técnica de PCR en punto final
demostraron que un 86% de las 36 muestras de alimentos analizados contiene
secuencias transgénicas, en comparación al trabajo realizado por Jiménez (2003),
donde utilizando la misma técnica de PCR demostró que 56% de las 16 muestras
analizados dieron positivo para secuencias transgénicas. En cambio Oviedo et al,
(2020) mediante la técnica PCR en tiempo real, demostrando que de las 30 muestras
analizadas, 17 dieron positivas para la presencia del promotor transgénico 35S,
encontrando una alta incidencia de fragmentos 82 pb.

23. VI. CONCLUSIÓN
1. Se determinaron los tipos de PCR utilizados para la investigación de alimentos
transgénicos como la PCR en tiempo real y PCR punto final.
2. Otro método utilizado para la identificación de alimento transgénicos es el
método de detección por proteínas, en el cual se realiza bandas de flujo lateral
que determina cualitativamente proteínas específicas.
3. Los alimentos como la soya, maíz y algodón fueron identificados como
alimento transgénicos según las investigaciones consultadas.