1. Estandarización del protocolo de inmunohistoquímica para el marcaje de
la 3α-hidroxiesteroide oxidoreductasa utilizando un anticuerpo policlonal
Pernía M.1, Alcalá K.1, Mosca W.2, Campos Y.2, Gago N.1
1Laboratorio
de Neuroendocrinología Comparada, Esc. de Medicina J. M. Vargas e Instituto de Medicina
Experimental, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela
2Laboratorio de Fisiopatología, Instituto de Biomedicina, Escuela de Medicina J.M. Vargas, Universidad Central de
Venezuela, Caracas, Venezuela
INTRODUCCION RESULTADOS
Los neuroesteroides son esteroides sintetizados en el sistema nervioso, Tabla 1. Resultados de inmunofluorescencia en las distintas condiciones probadas
de novo a partir del colesterol o a partir de precursores circulantes, y Dilución del Tiempo de
ejercen efectos autocrinos y/o paracrinos. Ciertos neuroesteroides actúan Tejido Tipo de corte suero anti-3α- incubación con el Resultado
HSOR suero anti-3α-HSOR
por vía de modular la actividad de los receptores para neurotransmisores.
Hígado congelado 1:250 toda la noche -
Este es el caso de la 3,5-tetrahidroprogesterona o alopregnanolona
Hígado congelado 1:500 toda la noche -
(3,5-THP), un metabolito de la progesterona (PROG). La PROG es
Hígado flotante 1:250 toda la noche +
metabolizada a 5α-dihidroprogesterona por una 5α-reductasa y luego se
Hígado flotante 1:500 toda la noche +
forma la 3α,5α-THP gracias a la actividad de la 3α-hidroxiesteroide Cerebro congelado 1:250 toda la noche -
oxidoreductasa (3α-HSOR) (Fig. 1). La 3α,5α-THP ejerce importantes Cerebro congelado 1:500 toda la noche -
efectos biológicos debido a que actúa como un modulador alostérico Cerebro flotante 1:250 toda la noche +
positivo de los receptores GABAA . Recientemente, se estableció en el Cerebro flotante 1:500 toda la noche +
laboratorio la distribución de la 3α-HSOR en el cerebro de rata utilizando un Cerebro flotante 1:500 2 horas +
anticuerpo no comercial desarrollado por Penning y colaboradores (1984,
Biochem. J. 222: 601-611). Para continuar con este estudio, produjimos un A 3α-HSOR 3α-HSOR 3α-HSOR
nuevo anticuerpo contra la 3α-HSOR inmunizando conejos con un péptido
sintético, análogo a una región antigénica, predicha por métodos
bioinformáticos. La especificidad del anticuerpo generado fue evaluada por
inmunodot (Fig. 2).
P 450SCC O
3-HSD O B DAPI DAPI DAPI
A
HO HO O
Con el antisuero Figura 3. Inmunofluorescencia para la 3α-
Colesterol Pregnenolona Progesterona HSOR (alexa 488) y tinción con DAPI en
( PREG ) ( PROG ) cortes flotantes de hígado de rata adulta.
5-reductasa 5 µg 2 µg 1 µg Las fotografías fueron tomadas con
O
microscopía confocal y se muestra un mismo
B Con el suero preinmune
campo a tres niveles diferentes. (A) Se
O C 3α-HSOR + DAPI 3α-HSOR + DAPI 3α-HSOR + DAPI observa inmunoreactividad para la 3α-HSOR
H
en las células endoteliales y en las células
5-DHPROG 5 µg 2 µg 1 µg
adyacentes. (B) Se observan los núcleos de
3-HSOR 3-HSOR todas las células marcados con DAPI. (C)
O O Superposición de la imagen obtenida para el
marcaje de la 3α-HSOR con la imagen
obtenida de la tinción con el DAPI.
HO HO Figura 2. Inmunodot del antisuero
H H
contra el péptido sintético de la 3α-
3,5-THPROG 3,5-THPROG
HSOR. (A) Inmunoreactividad del
Figura 1. Biosintesis de la 3α,5α-tetrahidroprogesterona (3α,5α-THP) antisuero contra el péptido sintético. De A
en el sistema nervioso. 3α-HSOR: 3α-hidroxiesteroide oxidoreductasa. izquierda a derecha, las cantidades
3α,5β-THP: 3α,5β-tetrahidroprogesterona. 3β-HSD: 3β-hidroxiesteroide empleadas del péptido fueron 5, 2 y 1 μg.
deshidrogenasa/Δ5-Δ4 isomerasa. 3β-HSOR: 3β-hidroxiesteroide (B) Control negativo utilizando el suero
oxidoreductasa. 5α-DHP: 5α-dihidroprogesterona. P450scc: citocromo preinmune. No se observa ninguna
P450scc inmunoreactividad.
3α-HSOR 3α-HSOR 3α-HSOR
El objetivo del presente trabajo fue el de estandarizar las condiciones de B
Figura 4. Inmunofluorescencia para la 3α-
inmunohistoquímica para el marcaje de la 3α-HSOR, utilizando este nuevo HSOR (alexa 488) y tinción con DAPI en
cortes flotantes de cerebro de rata de 15
anticuerpo policlonal desarrollado contra un péptido sintético de la enzima. días. Las fotografías fueron tomadas con
microscopía confocal y en las dos primeras
DAPI DAPI DAPI columnas se muestra un mismo campo a dos
niveles diferentes. En la última columna se
MATERIALES Y METODOS C observa un zoom del campo anterior. (A) Se
observa inmunoreactividad para la 3α-HSOR
en las células endoteliales. (B) Se observan los
La estandarización del protocolo la inmunohistoquímica contra la 3α-HSOR se núcleos de todas las células marcados con
realizó en cortes congelados y flotantes de hígado de rata Sprague-Dawley (SD) adulta, DAPI. (C) Superposición de la imagen obtenida
y posteriormente, se probaron las condiciones en cerebro de rata SD de 15 días de para el marcaje de la 3α-HSOR con la imagen
3α-HSOR + DAPI 3α-HSOR + DAPI 3α-HSOR + DAPI obtenida de la tinción con DAPI.
nacidas.
Se emplearon dos diluciones del anticuerpo primario (suero anti-3α-HSOR), 1:250
y 1:500. El anticuerpo secundario utilizado fue un anti-IgG de conejo, hecho en cabra, .
CONCLUSIONES
acoplado a Alexa 488 de Interchim Molecular Probes (GAR-488, dilución 1:100). Ambos • El anticuerpo producido contra un péptido sintético de la 3α-HSOR
anticuerpos fueron diluidos en PBS con 0,3% de Tritón X-100 (PBST).
Los animales fueron anestesiados con ketamina (100mg/ml) y fijados por perfusión
permite el marcaje de la enzima por inmunofluorescencia en tejido de
intracardíaca empleando paraformaldehído al 4% (PFA) en buffer fosfato. Los cerebros e hígado y de cerebro de rata.
hígados fueron disecados y postfijados en PFA. La mitad del material fue congelado • La inmunohistoquímica debe realizarse en cortes flotantes.
para la realización de cortes en criostato de 14 μm de espesor y la otra mitad se • Una incubación con el suero anti-3α-HSOR de toda la noche o de 2
almacenó a 4oC para la realización de cortes flotantes de 30 μm de espesor en horas da resultados similares.
vibratomo. Los cortes fueron incubados con suero normal de cabra al 5% en PBST por • No se obtuvieron diferencias significativas en cuanto a las diferentes
30 minutos. Luego, se incubaron con el suero anti-3α-HSOR por 2 horas o durante toda diluciones empleadas del suero anti-3α-HSOR (1:250 y 1:500).
la noche. Posteriormente, se lavaron con PBS y se incubaron por 2 horas con el
anticuerpo secundario. Se lavaron en PBS y se incubaron con DAPI (0,1 µg/ml) por 30
• Se observó una fuerte expresión de la 3α-HSOR en las células
min para marcar los núcleos. Finalmente, los cortes fueron montados en un medio de endoteliales de hígado y de tejido nervioso.
montaje para fluorescencia. Se realizaron controles negativos sustituyendo la incubación • Se observó un marcaje de la 3α-HSOR tanto citoplasmático como
con el suero anti-3α-HSOR por una incubación con PBST. Los análisis se realizaron con nuclear en las células hepáticas.
un microscopio invertido de epifluorescencia axiovert 25 y se tomaron fotografías con un
Financiamiento: CDCH PG 09-00-6794-2007
microscopio confocal marca Olympus. Agradecimientos: a Héctor Rojas del Instituto de Inmunología por la realización de las fotografías confocal