Este documento describe un estudio que caracteriza la variabilidad genómica de la región 5'UTR-C de los serotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 mediante la técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Los investigadores amplificaron la región 5'UTR-C de muestras virales y analizaron los patrones de fragmentos generados por diferentes enzimas de restricción. Encontraron homogeneidad en DENV-1, DENV-3 y DENV-4, pero dos grupos en DENV

1. VARIABILIDAD GENÓMICA DE LA REGIÓN 5´UTR-C DE DENV-1, DENV-2, DENV-3 Y
DENV-4 MEDIANTE LA TÉCNICA POLIMORFISMO EN LA LONGITUD DE LOS
FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN LARDIDEV
D.E. Camacho1 , E. Ferrer1, J.L. Triana-Alonso1, G. Comach1, F. Triana-Alonso†1
1 Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Carabobo “Dr. Francisco Triana-Alonso”/Universidad de Carabobo Sede Aragua, Maracay, Venezuela.
INTRODUCCIÓN A. 1 2 3 4 5 6 7 8 B. 1 2 3 4 5 6
Las infecciones por virus Dengue (DENV) son causadas por cualquiera de los serotipos de DENV (DENV-1, DENV-2, DENV-3,
DENV-4). El genoma es un ARN simple, de sentido positivo y 11.000 nt de longitud. Consta de una región no traducible 5´ (UTR,
Untranslated Region), un marco abierto de lectura (ORF, Open Reading Frame) que codifica proteínas estructurales y no
estructurales, y una región 3´UTR. Las regiones terminales del genoma determinan su replicación y síntesis de proteínas (Deas et
al., 2005). La variabilidad en las características antigénicas y genéticas del genoma de DENV ha sido reportada (Henchal et al., 300 pb
1986; Rico-Hesse, 1990; Chungue et al., 1993; Lewis et al., 1993; Lanciotti et al., 1994; Chungue et al., 1995; Lanciotti et al., 1997) y 300 pb 212 pb
su análisis ha provisto información relacionada con procesos evolutivos e interacciones entre factores biológicos y 212 pb
epidemiológicos. Los estudios filogenéticos han sido útiles para dilucidar aspectos de la vigilancia epidemiológica y desarrollo
de vacunas (Rico-Hesse et al., 1997) y para caracterizar regiones del genoma antes de ejecutar investigaciones de la asociación 88 pb
de tales fragmentos con propiedades y/o funciones biológicas. El ensayo ideal es la secuenciación nucleotídica, pero presenta
limitaciones asociadas a costos, acceso al servicio y tiempo de ejecución, lo que sugiere el uso de otras técnicas como el Figura 2. Electroforesis en gel de Agarosa al 2% correspondiente a los fragmentos producto de la restricción enzimática con
la enzima Pst I de la región 5´UTR-C de DENV-2. A. 1: 100 pb DNA step ladder (Axygen), 2: 1666, 3: 1802, 4: 2124 IQT, 5:
Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP, Restriction Fragment Lenght Polymorphism) cuya 1699, 6: 2252, 7: 1913. B. 1: NG”C”, 2: 16681 3: 2124 IQT 4: Control positivo sin digerir, 5: Control negativo, 6: 100 pb
aplicación ha permitido reconocer subgrupos para DENV-2 y DENV-3 (Vorndam et al., 1994; Mota et al., 2002). En este trabajo se DNA step ladder (Axygen).
muestra la amplificación mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR, Reverse Transcriptase-Polymrase Chain
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Reaction) de la región 5´UTR-C correspondiente a secuencia completa de 5´UTR y aproximadamente 200 nucleótidos de la región
que codifica la cápside. Los fragmentos obtenidos se analizaron mediante RFLP para determinar variabilidad en 5´UTR-C de cada
serotipo viral. Los 5´UTR-C, serían empleados para evaluar el mecanismo de síntesis de proteínas en sistemas eucariotas in vitro.
Figura 3. Electroforesis en gel de
MATERIALES Y MÉTODOS
Agarosa al 2% correspondiente a los
fragmentos producto de la restricción
enzimática con la enzima Hae III de
274 pb la región 5´UTR-C de DENV-3. 1: 100
Serotipo Enzima de Productos 213 pb pb DNA step ladder (Axygen). 2:
viral restricción 17890, 3: 28926, 4: 23639, 5:
24247, 6: H-87, 7: 15394, 8: 19040,
• EDICION DE SECUENCIAS DENV-1 Sal I 155,120 61 pb 9: 20277, 10: 25730, 11: 28926,
NUCLEOTÍDICAS: ELABORACION MAPA DE 12: Control Positivo sin digerir.
• DENV-1(Nº de acceso 001477.1) RESTRICCIÓN DE 5´UTR-C DENV-2 Pst I 212, 88
• DENV-2(Nº de acceso: 001474.2) DE DENV (RestrictionMapper A. 1 B. 1 C. 1 2 3 4 5 6 7
DENV-3 Hae III 213,61 2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7
• DENV-3 (Nº de acceso: 001475.2) versión 3.0.)
• DENV-4 (Nº de acceso: 002640.1) Mbo I 104,86,84
DENV-4 Mbo I 251,88
Msp I 202,137
Hpa II 202,137
339 pb
202 pb 251 pb
202 pb
TRANSCRIPCIÓN REVERSA ACOPLADA A REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RT- 137 pb 137 pb 88 pb
PCR) DEL FRAGMENTO 5´UTR-C DE 09 DENV-1, 10 DENV-2, 10 DENV-3 Y 06 DENV-4.
Figura 4. Electroforesis en gel de Agarosa al 2% correspondiente a los fragmentos producto de la restricción enzimática con las
enzimas Msp I, Hpa II y Mbo I (A,B,y C respectivamente) de la región 5´UTR-C de DENV-4. A. 1: 100 pb DNA step ladder
(Axygen). 2: 2431, 3: 2361, 4: 4332, 5: 3485, 6: 40195, 7: 8887, 8: Control Positivo sin digerir. B. 1: 2431, 2: 2361, 3: 4332,
4: 3485, 5: 40195, 6: 8887, 7: Control Positivo sin digerir. C. 1: 2431, 2: 2361, 3: 4332, 4: 3485, 5: 40195, 6: 8887, 7:
ARN (+)
Control Positivo sin digerir.
POLIMORFISMO EN LA LONGITUD DE LOS
H2O
DISCUSIÓN
FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN (RFLP)
Inhibidor de RNAsas dNTPs
Wizard ® SV Gel and PCR
Taq Polimerasa Buffer
Clean-Up System (Promega
Reverso Transcriptasa
Corporation, Madison, La determinación del patrón de restricción enzimática de la secuencia del genoma viral, específicamente de 5´UTR-C
Oligonucleótidos
Wisconsin, USA) permitió la caracterización genómica de la misma mediante el uso de la RFLP, como una técnica rápida y confiable. La
Agarosa 2% caracterización de 5´UTR-C sería de gran utilidad para emplear tales regiones en el análisis de mecanismos de síntesis de
proteínas, así como mecanismos de replicación viral debido al rol que 5´UTR tiene en tales procesos. Por las
Serotipo Aislado viral características de conservación esperadas se observó homogeneidad absoluta para tres de los serotipos virales (DENV-1,
ADNc
Buffer de reacción
DENV1 16007, 23996, 4199, 2212, 1817, 28974,
(DENV) DENV-3 y DENV-4) al presentar patrones de restricción enzimática acordes con lo que sugerían los mapas de restricción.
Hawaii, 29598, 1658
H2O Enzima de
Sin embargo, DENV-2 segregó en dos grupos, el primero de ellos conformado por virus locales, cuya secuencia
DENV2 1666, 1802, 2124 IQT, 1699, 2252, restricción nucleotídica no se afectó por la acción de la enzima seleccionada; estas cepas correspondían al genotipo
1913, NG”C”, 16681
DENV3 17890, 28926, 23639, 24247, H-87, Asiático/Americano (Uzcátegui et al., 2001). El segundo grupo se constituyó por virus foráneos, clasificados
15394, 19040, 20277, 25730 filogenéticamente como genotipos Asiáticos (16681, NG”C”) (Gruenberg et al.,1988; Kinney et al., 1997) y Americanos
DENV4 2431, 2361, 4332, 3485, 40195, 8887
(2124 IQT) (Vasilakis et al., 2008). De acuerdo a estos resultados, los virus de circulación local no presentaban la misma
diana de restricción, lo que sugiere la posibilidad de comportamientos biológicos diferentes.
Agarosa 2% RFLP es una técnica que presenta limitaciones en su interpretación, sin embargo dependiendo de la región genómica a
analizar y las enzimas seleccionadas, representa una herramienta molecular alternativa y útil para caracterizar fragmentos
genómicos, de igual forma podría emplearse para definir genotipos virales, particularmente para aquellas localidades que
37°C x 3 horas no cuentan con servicios de secuenciación (Vorndam et al., 1994; Mota et al., 2002). En el caso de este reporte, RFLP
permitió la caracterización genómica de 5´UTR-C de cepas de diferente clasificación filogenética.
R E F E R E N C I A S B I B L I O G R Á F I C AS
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RESULTADOS •
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Figura 1. Electroforesis en gel de Agarosa al 2% • Mota J, Ramos-Castañeda J, Rico-Hesse R, Ramos C. Phylogenetic analysis of the envelope protein (domain lll) of dengue 4 viruses. Salud Pública Mex 2002; 44: 228–236.
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restricción enzimática con la enzima Sal I de la
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región 5´UTR-C de DENV-1. 1: 16007, 2: 23996, 3:
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