Este documento describe los procedimientos para la extracción de proteínas y electroforesis en geles de poliacrilamida, incluyendo la tinción con azul de Coomassie. Explica los pasos de fijado, tinción y destinción del gel, así como diferentes métodos de tinción como con plata, fluorocromos, cobre y zinc.

1. Extracción de Proteínas y Electroforesis en Geles de Poliacrilamida

2. procedimiento Tinción con Azul de Coomasie

3. Tinción Coomasie Fijado Poner el gel en solución de fijado Metanol Acido Acético Agua Almacenar a 4°C

4. Tinción Coomasie Tinción Metanol Acido Acético Agua Azul brillante Coomassie al 0.05% (w/v) Retire la solución de fijado, cubra el gel con solución de azul de Coomasie y agite por 30 minutos a 37°C

5. Tinción Coomasie Destinción 5% (v/v) metanol 7% (v/v) acido acético 88% H2O Saque la solución de tinción Enjuague con solución de fijado Cubra con solución de destincion y agite lentamente por 45 minutos.

6. Métodos de Tinción de Geles de Poliacrilamida

7. Métodos de Tinción de Geles de Poliacrilamida Tinción con Coomassie Blue Tinción con Plata Tinción con otros Metales (Cobre y Zinc) Tinción con Fluorocromos Inmunoblot

8. Detección de Proteínas en Gel Coomassie Blue Tinción con Plata Fluorocromos Tinción con Cobre Tinción con Zinc

11. Tinción con Coomassie Blue 50 veces menos sensible que la tinción con plata, pero es una alternativa conveniente. Se une estequiométricamente a las proteínas Determinar la concentración de proteína por densitometría

14. Tinción con Plata Los geles se impregnan con iones de plata (Ag+) solubles Se revela con un agente reductor Las macromoléculas promueven la reducción a plata metálica Insoluble Visible

15. Tinción con otros metales Tinción con cobre Tinción con zinc

16. Tinción con Fluorocromos SYBRO orange

17. Inmunoblot

18. Procedimiento Secado de geles

19. Secado de Geles

20. Secado de Geles

21. ANÁLISIS DE GELES DE PROTEÍNAS Construcción de árboles Usando PAUP

22. Pozos: (M)Proteus (L)E. coli C600 (A)E. coli K12 (J) E. coliB (K) E. coliW (D) E. colipGLO

23. MARCADOR En este tutorial usaremos PAUP para analizar la matriz de datos obtenida a partir de un gel en el que se comparan las cepas de E. coli C12, W3104, K12, C600 y Jtaq. A continuación se presentan 2 geles, uno hecho en agarosa y teñido con brumro de Etidio y otro con Tinción en Plata con las mismas muestras en igual cantidad al gel de Bromuro.Construya su matríz a partir de uno, o ambos geles. W3104 Jtaq K12 C600 C600 C12 C12

24. marca W3104 K12 Jtaq C600 C600 C12 C12

25. Para buscar a PAUP debe desplazar el ratón hacia la barra desplegable inferior, en algunos computadores podrá encontrar el vínculo directamente en este sitio. Haga clic con el mouse sobre este y ábralo! Si logra abrir PAUP con este paso, siga al paso 3, si el icono no está presente continúe con el siguiente paso para buscar el programa

26. Busque el Finder (que es como el explorador de archivos de Mac) si no lo encuentra puede hacer doble clic en el icono del PC.

27. Esta es una ventana de finder, puede buscar en todo el disco la localización de PAUP, ya que esto tomaría mucho tiempo, puede buscar el archivo, haciendo clic donde se señala.

28. En el espacio señalado ingrese la cadena “PAUP”

29. En la ventana se enlistan los archivos que contienen la palabra PAUP, haga doble clic en el nombre del programa para abrir. Si el programa no abre o no aparece, cambie de Mac o contacte al administrador de sala.

30. Este es el menú inicial de PAUP, como no tiene (asumiendo) la matriz hecha le va a dar clic en New

31. Haga su matriz dejando un espacio (Tab) entre el nombre del individuo y los caracteres de la matriz binaria. No deje espacios entre los caracteres.

32. Haga clic en File:Save As.. Y salve su matriz con un nombre específico, en una locación conocida (preferiblemente el escritorio) y con la terminación .txt (ojo, importante que quede .txt). Por ejemplo matriz.txt.

33. Una vez guardada su matriz, va a importarla para que pueda ser leída por PAUP. En general, los programas de análisis filogenético, de secuencias o de similitud varían los formatos de presentación de archivo y por tanto las extensiones con las que trabajan. De esta forma, programas como Phyllip utilizan extensiones de archivo *.phy, PAUP usa archivos nexus (*.nex). Existen formatos como FASTA, GenBank, etc. Estos formatos pueden ser importados de un programa a otro, en este caso PAUP puede importar y ejecutar directamente archivos distintos a .nex incluso este .tx.) Importémoslo para ver como varía este formato .txt con un .nex.

34. Al importar asegúrese de que las opciones sean como las que se muestran en la figura. Fíjese en missing data! Ya que si no puede visualizar bandas por exceso de tinción no significa que no estén allí, así que podría poner un ? En vez de un 0, sin embargo esto dará más incertidumbre al análisis y un mayor número de árboles posibles.

35. El formato cambia, verdad? Este formato es más rico en información que un formato plano, en este caso no tiene mayor información ya que fue importado de un formato plano, pero usualmente contiene información importante para el programa sobre secuencias, origen, información de los organismos

36. Puede ejecutar ahora el archivo, ya sea el nuevo con formato .nexo el antiguo con formato .txt

37. En la ventana principal aparece la información confirmando que el archivo ha sido cargado exitosamente, informa el número de taxa, los caracteres (las bandas que analizó), los caracteres (como es binario será 0 y 1, si fuera ADN sería ACGT), puede poner en su matriz símbolos de interrogación en aquellos caracteres que no se sabe si tienen o no la banda (en donde la tinción ha dejado negro el carril)

38. En análisis encontrará las herramientas de construcción y/o búsqueda de árboles. Parsimonia, Verosimilitud (Likelihood), Distancia, hacen referencia a los criterios de optimalidad con los que se buscarán árboles, de tal manera que parsimonia buscará árboles con la premisa de encontrar los que tengan el menor tamaño ( = menor numero de cambios). Haga Clic en Neighbor Joining/UPGMA

39. Neighbor Joining/UPGMA son algoritmos de construcción de árboles, ambos se basan en matrices de distancia elaboradas a partir de su set de datos. Seleccione UPGMA primero y haga click en OK

40. En este resultado el algoritmo arroja 1 sólo árbol con una raíz (necesaria para comparar las distancias de los individuos contra esta). Además, si seleccionó la opción de mostrar longitud de las ramas, puede observar la longitud de cada una de las ramas contra los nodos y la raíz (espacios señalados en números). Este algoritmo da una aproximación de un árbol óptimo bajo el criterio de optimalidad, sin embargo no significa necesariamente que sea la mejor opción, repitamos el análisis, esta vez señalando en vez de UPGMA, Neighbor Joining

41. Este árbol es distinto, ya que no está enraizado, en este algoritmo se comparan los individuos entre sí. Además, como podemos ver, la topología (es decir las ramas y la cercanía entre los individuos) es distinta al obtenido con UPGMA, por qué? Hagamos un último análisis para entender esto.

42. Ahora le vamos a pedir al programa que haga una búsqueda exhaustiva, esto es, que origine todos los posibles árboles que pueden darse con nuestro set de datos y encuentre los que tienen el menor tamaño (recuerde el criterio de parsimonia). Esta opción no se puede llevar a cabo siempre y resulta imposible con sets de datos grandes con muchos caracteres o muchos taxa, por tal motivo se hacen búsquedas como la heurística o con los algoritmos que usamos, que si no dan respuestas exactas, dan aproximaciones óptimas-

43. Aparece esto, que indica que se evaluaron 15 árboles y se escogieron 4 que tienen un puntaje de 20. Haga clic en Close para continuar. De los caracteres que escogimos acá dirá cuantos realmente sirven en este análisis.

44. Para visualizar los árboles puede ir a Trees:Show Trees o salvarlos para luego abrirlos con este u otro programa que permita visualizarlos.

45. En este caso pregunta cuál de los 4 árboles que encontró como óptimos debe mostrar, en su caso pueden ser menos o pueden ser más. En este caso escogemos que nos muestre los 4. Puede jugar con las opciones Tree Drawing.

46. De esta manera obtendrá los árboles que se ajustan a su set de datos. Que son igualmente probables. Para copiarlos, en Mac, puede hacer Comando+Shift+3, esto genera un pantallazo en formato pdf que queda guarado en el escritorio. O comando+shift+4 que permite hacer un panatallazo sólo de un área seleccionada por el mouse. (Comando es la tecla que parece tener una manzanita)