Validación método cromo suelos

I
NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE MINAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA
TÍTULO:
“VALIDACION DE UN METODO DE ENSAYO PARA LA DETERMINACION
DE CROMO HEXAVALENTE EN SUELOS Y SEDIMIENTOS DE ACUERDO A
LAS NORMAS EPA SW-846: METODO 3060A DIGESTION ANCALINA PARA
CROMO HEXAVALENTE Y METODO 7196A PARA CROMO HEXAVALENTE
COLORIMETRICO”
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL
DE INGENIERO QUÍMICO
PRESENTADO POR:
DUBERLI LOPEZ OROZCO
,
PIURA - PERÚ
2017

II
“VALIDACION DE UN METODO DE ENSAYO PARA LA DETERMINACION DE
CROMO HEXAVALENTE EN SUELOS Y SEDIMIENTOS DE ACUERDO A LAS
NORMAS EPA SW -846 METODO 3060A DIGESTION ALCALINA PARA CROMO
HEXAVALENTE Y METODO 7196A PARA CROMO HEXAVALENTE
COROMETRICO”
TESIS
PRESENTADO A LA FACULTAD DE INGENIERÍA DE MINAS
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
INGENIERO QUÍMICO
------------------------------------------------------------------
BACH. DUBERLI LOPEZ OROZCO
EJECUTOR
------------------------------------------
DR. GUIDO TICONA OLARTE
ASESOR

III
“VALIDACION DE UN METODO DE ENSAYO PARA LA DETERMINACION DE
CROMO HEXAVALENTE EN SUELOS Y SEDIMIENTOS DE ACUERDO A LAS
NORMAS EPA SW-846 METODO 3060A DIGESTION ALCALINA PARA CROMO
HEXAVALENTE Y METODO 7196A PARA CROMO HEXAVALENTE
COLORIMETRICO”
TESIS
PRESENTADO A LA FACULTAD DE INGENIERÍA DE MINAS
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
INGENIERO QUÍMICO
JURADO CALIFICADOR
-----------------------------------------------------
ING. JOSE F. MOLEROP LOPEZ
(PRESIDENTE)
-----------------------------------------------------------
ING. ELMER ARENAS RIOS
(SECRETARIO)
----------------------------------------------------
ING. CLAUDIO RODRIGUEZ GOM
(VOCAL)

IV
DUBERLI LOPEZ OROZCO
DEDICATORIA
Dedico este trabajo en primer lugar a Dios, por haberme dado la vida y permitirme
haber llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional. A mi
padre Duberli López C. y a mi madre Francisca Orozco M. y a mis hermanos Lena
López Orozco, Nadeshda López Orozco y Ilich López Orozco por ser los pilares más
importantes de mi vida y por demostrarme siempre su cariño y apoyo incondicional.

V
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por protegerme durante todo mi camino y darme fuerzas para
superar obstáculos y dificultades a lo largo de toda mi vida.
A mi padre, madre y hermanos que sin ellos no estaría aquí cumpliendo mi
objetivo.
Con especial cariño y admiración a mi asesor de tesis Ing. Guido Ticona Olarte
Y a todas aquellas personas que de una u otra manera me ayudaron a terminar esta
tesis.
Gracias

VI
RESUMEN
Validación de un método de ensayo para la determinación de cromo hexavalente en suelos y
sedimentos de acuerdo a las normas epa sw-846: método 3060A digestión alcalina para cromo
hexavalente y método 7196A cromo hexavalente colorimétrico.
La validación del método de ensayo para la determinación de cromo hexavalente se realizó
mediante la modificación de métodos normalizados (método 3060A y el método 7196A) para
las matrices de suelos y sedimentos, se seleccionó parámetros de validación, material de
referencia certificado y técnicas estadísticas.
Para garantizar el proceso de validación, se analizaron los siguientes parámetros de validación:
rango de trabajo, precisión, veracidad, selectividad, linealidad, límite de detección, límite de
cuantificación, sensibilidad, robustez e incertidumbre.
Se determinó mediante el análisis estadístico que se cumplió con los diferentes criterios de
aceptación, por lo que la validación quedo aceptada.

VII
CONTENIDO
1) CAPITULO I............................................................................................................................ 14
1.1) Justificación ....................................................................................................................... 15
1.2) Objetivos............................................................................................................................ 16
1.2.1) Objetivo Principal ....................................................................................................... 16
1.2.2) Objetivos Específicos.................................................................................................. 16
1.3) Metas.................................................................................................................................. 17
1.4) Terminología...................................................................................................................... 17
2) CAPITULO II........................................................................................................................... 20
2.1) Antecedentes del Estudio................................................................................................... 20
2.2) Sistema de Calidad del Laboratorio................................................................................... 21
2.3) Técnicas Estadísticas Aplicadas En Los Laboratorios De Ensayo .................................... 25
2.3.1) Estadística.................................................................................................................... 25
2.3.2) Población y Muestra.................................................................................................... 26
2.3.3) Clasificación De La Estadística................................................................................... 26
2.3.4) Medidas de Tendencia Central.................................................................................... 27
2.3.5) Medidas de Dispersión................................................................................................ 28
2.3.6) Prueba De Normalidad................................................................................................ 30
2.3.7) Prueba De Normalidad De Anderson Darling............................................................. 31
2.3.8) Detección De Puntos Atípicos..................................................................................... 33
2.3.9) Pruebas De Detección De Puntos Atípicos ................................................................. 33
2.3.10) intervalo de confianza ............................................................................................... 36
2.3.11) Prueba De T-Student De Una Muestra...................................................................... 38
2.3.12) Prueba De T-Student De Dos Muestra...................................................................... 40
2.3.13) Prueba De Wilcoxon ................................................................................................. 41
2.3.14) Prueba De Mann Whitney......................................................................................... 41
2.3.15) Método RSD De Horwitz.......................................................................................... 43
2.3.16) Análisis De Varianza (ANOVA)............................................................................... 44
2.3.17) Método Chi-Cuadrado............................................................................................... 45
2.3.18) Prueba De Bartlett ..................................................................................................... 46
2.3.19) Regresión Lineal Simple........................................................................................... 47

VIII
2.4) Validación De Método De Ensayo .................................................................................... 48
2.4.1) Plan de Validación ...................................................................................................... 50
2.4.2) Parámetros De Validación........................................................................................... 52
2.5) Metodologías Analíticas .................................................................................................... 57
2.6) Espectrofotómetro.............................................................................................................. 61
2.6.1) Componentes de un Espectrofotómetro ...................................................................... 62
2.6.2) Espectrofotometría UV-Visible................................................................................... 65
2.6.3) TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA .................................................................. 67
2.6.4) Ley de Lambert-Beer .................................................................................................. 69
2.7) Cromo ................................................................................................................................ 71
2.7.1) Efectos del Cromo Sobre la Salud............................................................................... 72
2.7.2) Efectos Ambientales Del Cromo................................................................................. 74
2.8) Suelos................................................................................................................................. 76
2.8.1) Características Físicas ................................................................................................. 77
2.8.2) Características Mineralógicas ..................................................................................... 82
2.8.3) Características Químicas............................................................................................. 82
2.8.4) Contaminación De Suelos........................................................................................... 84
2.9) Muestreo y Preservación.................................................................................................... 85
2.9.1) Obtención De Una Muestra Representativa................................................................ 86
2.9.2) Muestra Bruta.............................................................................................................. 87
2.9.3) Muestreo De Solidos................................................................................................... 88
2.10) Preparación de la Muestra y Determinación de Humedad............................................... 89
2.10.1) Aplastamiento y Trituración de Muestras ................................................................. 90
2.10.2) Mezclado de Muestras Solidas.................................................................................. 92
2.10.3) Humedad en las Muestras ......................................................................................... 93
2.11) Calidad De Agua Para Laboratorios ................................................................................ 94
2.11.1) Métodos De Preparación De Agua De Calidad Para Reactivos................................ 95
2.11.2) Calidad Del Agua Para Reactivos ............................................................................. 99
2.12) Indicador ........................................................................................................................ 101
2.12.1) Difenilcarbazida ...................................................................................................... 102
2.13) Material de Referencia................................................................................................... 103
2.13.1) Requisitos de un Material de Referencia................................................................. 104

IX
2.14) Estimación de la Incertidumbre ..................................................................................... 106
2.14.1) Términos Metrológicos Generales .......................................................................... 107
2.14.2) Incertidumbre De La Medición............................................................................... 115
2.14.3) Errores..................................................................................................................... 116
2.14.4) Proceso de Estimación de la Incertidumbre ............................................................ 117
3) CAPITULO III ....................................................................................................................... 125
3.1) Selección Del Método De Ensayo Para La Determinación De Cromo Hexavalentes En
Suelos Y Sedimentos............................................................................................................... 125
3.1.1) Método 3060A Digestión Alcalina Para Cromo Hexavalente .................................. 125
3.1.2) Método 7196A Cromo Hexavalente Colorimétrico.................................................. 127
3.2) Modificación del Método de Ensayo para la Determinación de Cromo Hexavalente en
Suelos y Sedimentos................................................................................................................ 127
3.3) Diagrama De Flujo Para La Determinación De Cromo Hexavalente Según Las Normas
................................................................................................................................................. 151
3.3.1) Diagrama De Flujo Para La Determinación De Cromo Hexavalente Por
Espectrofotometría UV/Visible Modificado ....................................................................... 152
3.4) Programa De Validación.................................................................................................. 153
3.4.1) Selección De Los Parámetros De Validación Para La Determinación De Cromo
Hexavalente En Suelos/Sedimentos .................................................................................... 154
4) CAPITULO IV ....................................................................................................................... 155
4.1) Prueba De Normalidad De Los Datos De Validación ..................................................... 155
4.2) Determinación de Datos Atípicos.................................................................................... 157
4.3) Determinación de Límite de Detección y Límite de Cuantificación ............................... 159
4.4) Determinación de La Selectividad del Método................................................................ 161
4.5) Determinación De Veracidad De Los Datos.................................................................... 163
4.6) Determinación De Precisión De Los Datos ..................................................................... 167
4.7) Determinación De La Linealidad Y Sensibilidad Del Método........................................ 174
4.8) Determinación De La Robustez Del Método................................................................... 176
4.9) Determinación De La Incertidumbre Del Método........................................................... 179
4.10) Tratamiento De Los Desechos De Cromo Hexavalente ................................................ 180
5) CAPITULO V......................................................................................................................... 182
5.1) Conclusiones.................................................................................................................... 182
5.2) Recomendaciones ............................................................................................................ 183
6) BIBLIOGRAFIA.................................................................................................................... 184

X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura N° 1. Grafica de control.………………………………………………………………..21
Figura N° 2. Campana de gauss prueba de normalidad.………………………………..............28
Figura N° 3. Diagrama de cajas………………………………………………………………..32
Figura N° 4. Intervalo de confianza……...…………………………………………………….35
Figura N° 5. Componentes de un espectrofotómetro…………………………………………..61
Figura N° 6. Espectrofotómetro UV- visible…………………………………………………...63
Figura N° 7. Atenuación de un haz de radiación por una disolución absorbente……………...65
Figura N° 8 propiedades del cromo…………………………………………………………….68
Figura N° 9. Efectos del cromo sobre la salud………………………………………………….70
Figura N° 10. Efectos ambientales del cromo…………………………………………………..72
Figura N° 11. la textura del suelo………………………………………………………………74
Figura N° 12. Muestreo y preservación………………………………………………………...81
Figura N° 13. Muestra representativa…………………………………………………………..83
Figura N° 14. Proceso de destilación…………………………………………………………..92
Figura N° 15. Proceso de osmosis inversa……………………………………………………..93
Figura N° 16. Proceso de intercambio iónico…………………………………………………...94
Figura N° 17. Proceso para obtener agua desionizada…………………………………………97
Figura N° 18. Reacción del difenilcarbazida…………………………………………………....98
Figura N° 19. Unidad de medida……………………………………………………………...104
Figura N° 20. Mediciones……………………………………………………………………...105
Figura N° 21. Mensurando……………………………………………………………………..105
Figura N° 22. Instrumento de medición………………………………………………………..106
Figura N° 23. Medidas materializadas…………………………………………………………107
Figura N° 24. Resoluciones de equipos………………………………………………………..109
Figura N° 25. Diagrama de Ishikawa………………………………………………………….115
Figura N° 26. Espectrofotómetro UV-Visible Modelo UV – 1800……………………………126
Figura N° 27. Celda de vidrio………………………………………………………………….126
Figura N° 28. Balanza analítica………………………………………………………………..127
Figura N° 29. Agitador magnético…………………………………………………………….127

XI
Figura N° 30. Estufa…………………………………………………………………………..128
Figura N° 31. Vasos precipitados……………………………………………………………..128
Figura N° 32. Pipetas volumétricas…………………………………………………………...129
Figura N° 33. Matraces volumétricos…………………………………………………………129
Figura N° 34. Embudos……………………………………………………………………….130
Figura N° 35. Papel filtro…………………………………………………………………….130
Figura N° 36. Centrifuga……………………………………………………………………..131
Figura N° 37. Soporte para el proceso de filtración………………………………………….131
Figura N° 38. Pisetas con agua desionizada………………………………………………….132
Figura N° 39. Acetona………………………………………………………………………...132
Figura N° 40. Reactivos de calibración y de control de dicromato de potasio………………..133
Figura N° 41. Dicromato de potasio…………………………………………………………..133
Figura N° 42. Soluciones de control y de calibración a 500 ppm…………………………….134
Figura N° 43. Material de referencia…………………………………………………………..134
Figura N° 44. Ácido fosfórico al 85%.......................................................................................135
Figura N° 45. Reactivo difenilcarbazida……………………………………………………...135
Figura N° 46. Solución del difenilcarbazida al 0.5%.................................................................135
Figura N° 47. Preservación de la muestra……………………………………………………..136
Figura N° 48. Estándares de la curva de calibración…………………………………………..137
Figura N° 49. Curva de calibración…………………………………………………………....137
Figura N° 50. Muestra acondicionada para pesar……………………………………………..138
Figura N° 51. Procedimiento de pesado………………………………………………………138
Figura N° 52. Calentamiento de muestras en agitación………………………………………139
Figura N° 53. Proceso de enfriamiento del extracto………………………………………….139
Figura N° 54. Centrifugación del extracto……………………………………………………140
Figura N° 55. Filtración del extracto………………………………………………………….140
Figura N° 56. Solución final del extracto……………………………………………………..140
Figura N° 57. Adición de ácido fosfórico al extracto…………………………………………141
Figura N° 58. Adición de difenilcarbazida al 0.5%...................................................................141
Figura N° 59. Desarrollo del color de la solución…………………………………………….142
Figura N° 60. Adición de la solución a la celda de medición………………………………....142

XII
Figura N° 61. Medición en el espectrofotómetro UV – visible………………………….........142
Figura N° 62. Controles de calidad……………………………………………………………143
Figura N° 63. Diagrama de flujo según las normas…………………………………………...145
Figura N° 64. Diagrama de flujo modificado………………………………………………….146
Figura N° 65. Grafica de probabilidad de cromo VI 56.9 mg/kg……………………………..150
Figura N° 66 grafica de probabilidad de cromo VI 4.10 mg/kg……………………………….151
Figura N° 67. grafica de valores atípicos de cromo VI 56.9 mg/kg…………………………..152
Figura N° 68. grafica de valores atípicos de cromo VI 4.10 mg/kg…………………………..153
Figura N°69. Prueba de varianzas iguales: cromo VI 56.9 mg/kg…………………………….162
Figura N° 70 prueba de varianzas iguales: cromo VI 4.10 mg/kg……………………………..165
Figura N° 71. Grafica de sensibilidad…………………………………………………………168
Figura N° 72. Estimación de la incertidumbre del método…………………………………….172
Figura N° 73. Reducción de Cr VI……………………………………………………………..174

XIII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla N° 1. Magnitudes………………………………………………………………..............104
Tabal N°2. Error máximo permitido……………………………………………………………109
Tabla N° 3. Parámetros de validación………………………………………………………….148
Tabla N° 4. Ensayos del material de referencia de 56.9 mg/kg………………………………...149
Tabla N° 5. Ensayos del material de referencia de 4.10 mg/kg………………………………...150
Tabla N° 6. Límite de detección y Límite de cuantificación…………………………………...154
Tabla N° 7. Porcentajes de recuperación de 56.9 mg/kg……………………………………….155
Tabla N° 8. Porcentajes de recuperación de 4.10 mg/kg……………………………………….156
Tabla N° 9. Veracidad de los datos de 56.9 mg/kg……………………………………………..158
Tabla N°10. Veracidad de los datos de 4.10 mg/kg…………………………………………….159
Tabla N°11. Prueba de Bartlett: 56.9mg/kg…………………………………………………….161
Tabla N° 12. Determinación de Varianzas: 56.9 mg/kg……………………………………….163
Tabla N°13 suma de cuadrados: 56.9 mg/kg…………………………………………………...163
Tabla N° 14 prueba F: 56.9 mg/kg……………………………………………………………..163
Tabla N°15. Prueba de Bartlett: 4.10 mg/kg…………………………………………………...164
Tabla N° 16. Determinación de varianzas: 4.10 mg/kg………………………………………..166
Tabla N° 17. Suma de cuadrados: 4.10 mg/kg…………………………………………………166
Tabla N° 18. Prueba F: 4.10 mg/kg…………………………………………………………….166
Tabla N° 19. Curvas de calibración…………………………………………………………….167
Tabla N° 20. Concentración vs Absorbancia…………………………………………………...168
Tabla N°21 valores de la pendiente y del intercepto…………………………………………...169
Tabla N° 22. Factores………………………………………………………………………….170
Tabla N° 23. Variables del método……………………………………………………………170
Tabla N° 24. Efectos máximos…………………………………………………………………171
Tabla N° 25. Incertidumbres estándares……………………………………………………….172
Tabla N°26. Incertidumbre expandida…………………………………………………………173
Tabla N°27. Tiempo vs Concentración…………………………………………………………173

14
1) CAPITULO I
INTRODUCCION
En la actualidad el concepto de la calidad ha tomado un enfoque global; la química analítica
como ciencia ha decidido trasformar la idea de un típico análisis químico convirtiéndola en un
análisis cuantitativo con la comprensión de una serie de etapas, y diversas secuencias como la de
elección del método de análisis, el tratamiento y procesamiento de la muestra, propiedades y
características del analito, determinación de resultados y como el más importante, la
determinación de la fiabilidad y confiabilidad de los resultados. Hoy en día, los laboratorios
deben demostrar que sus métodos analíticos proporcionen resultados fiables y adecuados para su
finalidad o propósitos perseguidos. El presente trabajo de tesis pretende validar un método de
ensayo en función a la norma NTP-ISO/IEC 17025, Validar un método analítico consiste en
verificar y documentar su validez, esto es, su adecuación a unos determinados requisitos,
previamente establecidos por el usuario, para poder resolver un problema analítico particular.
Estos requisitos son los que definen los parámetros o criterios de calidad que debe poseer el
método a utilizar para resolver el problema analítico. La metodología y las técnicas que se
utilizan son fácilmente aplicadas al laboratorio, capturando los conceptos de control de calidad
con un manejo de datos y basado en cálculos de los principales parámetros de validación. Donde
el tratamiento de datos juega un rol importante en todo el desarrollo de la validación siendo este
último un requerimiento para la acreditación de laboratorios.
En la validación de métodos, los laboratorios realizan un esfuerzo para asegurar la precisión de
los resultados. El proceso asegura que los laboratorios acreditados cumplen con los requisitos y

15
demuestran la capacidad para dar datos más exactos y precisos de los parámetros especificados
en el alcance de la acreditación.
Un laboratorio puede adoptar un procedimiento validado que, por ejemplo, ha sido publicado
como una norma, o adquirir un sistema de medida completo y emplearlo para una aplicación
específica a partir de un desarrollo comercial. En ambos casos el trabajo de validación básica
se ha realizado, pero el laboratorio debe confirmar su capacidad para aplicar el método. Esta
es la verificación. Esto implica que debe realizarse algún trabajo experimental para demostrar
que el método funciona adecuadamente en el laboratorio. Sin embargo, la carga de trabajo es
probable que sea considerablemente menor en comparación con la validación de un método
que se ha desarrollado internamente. Las medidas En la actualidad el avance tecnológico y
científico significa que la acreditación del sistema de calidad del laboratorio, su personal, sus
instalaciones y equipos, sus métodos de prueba, sus archivos y reportes han sido evaluados, y
la evaluación indica que laboratorio tiene la capacidad de conseguir nuevas oportunidades de
mercado, reservado solo para aquellos laboratorios que consiguen demostrar su avancé y su
competencia técnica.
1.1) Justificación
El presente trabajo de investigación de tesis encuentra justificación en la validación del método
de ensayo de cromo hexavalente por colorimetría, la importancia de validación en métodos de
ensayo radica en proporcionar la seguridad, confianza y reproducibilidad de resultados siendo
esta indispensable para mantener una alta calidad en el control del laboratorio ya que esto es uno
de los requisitos de la norma NTP-ISO/IEC 17025, la norma dice que debes validar los métodos
no normalizados y normalizados, los métodos que diseña o desarrolla, los métodos normalizados

16
empleados fuera del alcance previsto, así como las ampliaciones y modificaciones de los
métodos normalizados, para confirmar que los métodos son aptos para el fin previsto.
La validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de
aplicación que se realizan en la calidad de suelos para satisfacer los estándares de calidad
ambiental.
1.2) Objetivos
1.2.1) Objetivo Principal
Validar el método de ensayo para la determinación de cromo hexavalente en suelos y sedimentos
mediante un material de referencia.
1.2.2) Objetivos Específicos
• Seleccionar el método para la determinación de la validación de cromo hexavalente
• Definir la consistencia, validez y distribución paramétrica del método analítico de ensayo
en suelo y sedimentos de cromo hexavalente por colorimetría
• Seleccionar el material de referencia en la validación de cromo hexavalente
• Determinar la validación de cromo hexavalente empleando técnicas estadísticas y
parámetros de validación y su aplicación

17
1.3) Metas
El presente trabajo de tesis tiene como finalidad de demostrar que el método a validar para la
determinación de cromo hexavalente en suelos o sedimentos sea confiable y de calidad para la
determinación de cromo hexavalente en un laboratorio acreditado y que cumpla con los
requisitos de la norma NTP-ISO/IEC 17025 garantizando el aseguramiento de la calidad.
1.4) Terminología
• Incertidumbre Estándar: Es cada componente de incertidumbre expresada como
desviación estándar.
• Incertidumbre Estándar Combinada: Es la combinación de la incertidumbre estándar.
• Incertidumbre Expandida: Proporciona un intervalo dentro del cual se cree que esta el
parámetro medido, para cierto nivel de confianza.
• VIM: Vocabulario internacional de metrología
• Resolución: Mínima variación de la magnitud medida que da lugar a una variación
perceptible de la indicación correspondiente.
• Magnitud: Propiedad de un fenómeno, cuerpo o sustancia, que puede expresarse
cuantitativamente mediante un número y una referencia
• Material de Referencia (MR): Material, suficientemente homogéneo y estable con
respecto a una o más propiedades especificadas, que se ha establecido para ser apto para
el uso previsto de un proceso de medición
• Trazabilidad: La trazabilidad es la propiedad del resultado de una medición o del valor
de un patrón que puede relacionarse con una incertidumbre establecida generalmente a
patrones generales o internacionales, a través de una cadena interrumpida de
comparaciones.

18
• Patrón: Medida materializada, instrumento de medida, material de referencia o sistema
de medida destinado a definir, realizar, conservar o reproducir una unidad o uno o varios
valores de magnitud para que sirvan de referencia.
• Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia
aceptado.
• Error Sistemático: Es definido como un componente de error el cual, en el desarrollo de
un número de análisis del mismo mensurando, permanece constante o varía en forma
predecible.
• Error Aleatorio: El error aleatorio de un resultado analítico no puede compensarse
mediante corrección pero puede reducirse mediante el incremento del número de
observaciones.
• Error Máximo Permitido (EMP): Valor extremo de un error de medición permitido por
especificaciones o reglamentaciones para una medición, instrumento o sistema de
medición dado.
• Incertidumbre: Parámetro no negativo que caracteriza la dispersión de los valores
atribuidos a un mesurando, a partir de la información que se utiliza.
• Magnitud: Propiedad de un fenómeno, cuerpo o sustancia, que puede expresarse
cuantitativamente mediante un número y una referencia.
• Estadística: Ciencia que se ocupa del estudio de fenómenos de tipo genérico
normalmente complejos y enmarcados en un universo variable.
• Precisión: Grado de concordancia existente entre los resultados independientes de un
ensayo obtenidos en condiciones estipuladas.

19
• Analito: Es un componente (elemento, compuesto o ion) de interés analítico de una
muestra. Es una especie química cuya presencia o contenido se desea conocer,
identificable y cuantificable, mediante un proceso de medición química.
• Calidad: conjunto de características inherentes que cumple con los requisitos.

20
2) CAPITULO II
MARCO TEORICO
2.1) Antecedentes del Estudio
La validación de métodos es un requisito importante en la práctica de los análisis químicos. Si
bien la mayoría de los químicos analíticos son conscientes de ello, no siempre está claro porque
y cuando debe realizarse y que es necesario hacer. Algunos consideran que la validación de
métodos debe realizarse en colaboración con otros laboratorios, por lo que no la llevan a cabo.
Los requisitos de las normas ISO/IEC 17025, ISO 15189 e ISO 15195 han ayudado a clarificar
este tema. Por ejemplo, la necesidad de demostrar que los métodos deben adecuarse a su uso
previsto se indica claramente en el apartado 5.4.2 de la ISO/IEC 17025:“El laboratorio debe
utilizar los métodos de ensayo o de calibración, incluidos los de muestreo, que satisfagan las
necesidades del cliente y que sean apropiados para los ensayos o las calibraciones que realiza. Se
deben utilizar
Preferentemente los métodos publicados como normas internacionales, regionales o nacionales.
El laboratorio debe asegurarse de que utiliza la última versión vigente de la norma, a menos que
no sea apropiado o posible. Cuando sea necesario, la norma debe ser complementada con detalles
adicionales para asegurar una aplicación coherente”.
La finalidad de este trabajo es demostrar cómo se realiza una validación de ensayo mediante la
norma técnica peruana ISO/IEC 17025.
La norma internacional ISO/IEC 17025 tuvo como antecesora, la Guía ISO/IEC 25 que tenía
como base a los “Requisitos Generales para la Competencia de Laboratorios de Calibración y
Ensayo” fue publicada en 1990 como un conjunto, acordado en el ámbito internacional, de

21
requisitos técnicos y de sistema de la calidad aplicable a laboratorios que realizan calibraciones
y/o ensayos.
A finales del año 1999, esta Guía ha sido reemplazada por la Norma Internacional ISO/IEC
17025 la cual forma la base para la acreditación de laboratorios en el futuro. Los requisitos de la
norma internacional ISO/IEC 17025 aun cuando esta incluye muchos de los criterios contenidos
dentro de las Normas ISO 9001 y 9002, ha sido preparada específicamente tomando en cuenta
las actividades de los laboratorios de ensayo y calibración. Se hace más énfasis en los elementos
del sistema de la calidad y en los temas de competencia técnica pertinentes a las operaciones de
un laboratorio.
Con la implantación de la norma internacional ISO/IEC 17025, existe mucha similitud entre el
desarrollo de un sistema ISO/IEC 17025 y un sistema ISO 9001. Sin embargo se debe poner
mayor atención en el desarrollo de un sistema ISO/IEC 17025 para detallar los temas técnicos
pertinentes a los laboratorios de ensaye. Inacal mediante la comisión de los reglamentos técnicos
y comerciales describe ampliamente el desarrollo de la validación de los métodos con
publicaciones como el reglamento general de la acreditación, reglamento de laboratorio de
ensaye y calibraciones, guía para la validación de métodos de ensayo, lineamientos sobre la
incertidumbre de la medición para laboratorios de ensayo, entre otras publicaciones que son de
gran ayuda para el desarrollo de la acreditación.
2.2) Sistema de Calidad del Laboratorio

22
Hoy en día el concepto de calidad va tomando importancia en muchas de las actividades
humanas, el laboratorio de análisis no es la excepción ya que su producto es la información
cualitativa o cuantitativa que se obtiene como resultado del ensayo de una muestra a analizar. La
validación de los métodos analíticos verifican que los resultados de los ensayos sean confiables
de esa manera se brinda la entera satisfacción al cliente en un marco de sistema de calidad
relacionado con la norma NTC/ISO/IEC 17025.
La validación de las metodologías analíticas aplicadas en los laboratorios según las
recomendaciones de las agencias internacionales e implementación del sistema de aseguramiento
de la calidad, del control de calidad analítica y del sistema de control y vigilancia, incluye la
elaboración de toda la documentación relacionada (manual de funcionamiento, protocolos,
instructivos, manual de calidad, formatos).
Todos estos procesos se llevan a cabo como parte del sistema de calidad, con el objeto de
acreditar los métodos de análisis y obtener reconocimiento como un laboratorio de excelente
calidad.
El control de calidad puede ser interno o externo. Los analistas utilizan algunos controles de
calidad para producir resultados creíbles. Sin embargo un buen programa de control de calidad se
compone de al menos, de siete elementos:
• Certificación de la Competencia del Operador
Antes de permitir que un analista lleve a cabo trabajos susceptibles de ser comunicado, ha
de demostrarse su competencia en la realización de los análisis. Los requisitos son

23
variables, aunque para la mayoría de los análisis químicos orgánicos e inorgánicos es
suficiente la demostración de sesgos y precisiones aceptables para operación en solitario.
• Recuperación de adiciones Conocidas
Utilícese la recuperación de adiciones conocidas como parte de un protocolo analítico
regular. Empleando adiciones conocidas para verificar la ausencia de electos de matriz.
Cuando se precisas analizar un nuevo tipo de matriz, verificase la magnitud de
interferencia.
• Análisis de Estándares de Suministro Externo
Los estándares de suministro externo deben analizarse, como mínimo, en los casos en que
el análisis de adiciones conocidas no produce recuperaciones aceptables o una vez al día,
según lo que sea más frecuente. Utilizar estándares de control de laboratorio con una
concentración entre cinco y cincuenta veces al de límite de cuantificación. Cuando sea
posible, utilizar materiales certificados de referencia como estándares de control de
laboratorio.
• Análisis de Blancos Reactivos
Analícense blancos de reactivos en todos los casos en que se utilizan nuevos reactivos y
con la frecuencia que requieran los métodos específicos.
• Calibrado con Estándares
Como mínimo, se mide tres diluciones diferentes del estándar una vez iniciado el análisis.
Verificases diariamente la curva estándar mediante el análisis de uno o más estándares en

24
la amplitud lineal, tal como se especifique en el método individual. No deben
comunicarse valores por encima del estándar superior a no ser que se haya realizado una
comprobación inicial de la mayor amplitud lineal.
• Análisis de Duplicados
Analizar duplicados y adiciones conocidas en matrices representativas de las muestras
Para evaluar la precisión de los resultados
• Gráficos de Control
Una gráfica de control es una herramienta estadística utilizada para evaluar la estabilidad
de un proceso. Permite distinguir entre las causas de variación.
En el laboratorio se utilizan normalmente tres tipos de gráficos de control de recursos
para estándares, ya sea estándares de control de laboratorio o control de calibrado: un
gráfico de recursos para resultados de fondos o blancos de reactivos; y un gráfico de
rango para análisis de réplicas.
Figura N° 1. Grafica de control

25
Fuente: seis sigmas disponibles en: http://www.monografias.com/trabajos101/calidad-basado-
sistema-6-sigma/calidad-basado-sistema-6-sigma.shtml
2.3) Técnicas Estadísticas Aplicadas En Los Laboratorios De Ensayo
Desde hace una serie de años en los laboratorios de ensayos, al igual que en otros ámbitos
sociales y tecnológicos, se ha planteado la necesidad de conseguir que los resultados analíticos se
obtengan con la calidad necesaria para satisfacer las actuales normativas impuestas, tanto en la
investigación científica como en el análisis aplicado.
La calidad, que ha de ser controlada con metodologías adecuadas, permitirá convenir los datos
generados en el laboratorio en información útil para obtener conclusiones fiables y rigurosas.
Para asegurar los resultados analíticos y brindar confiabilidad, al cliente es necesario emplear
diversas herramientas, entre las cuales, las herramientas estadísticas que cumplen un papel
importante. En este sentido es necesario que tanto personal científico como técnicos implicados
en la obtención y elaboración de datos obtenidos en el laboratorio de ensayo tenga un adecuado
conocimiento del conjunto de técnicas estadísticas mediante las cuales se obtiene una mejor y
más rigurosa información de los resultados.
2.3.1) Estadística

26
Ciencia que se ocupa del estudio de fenómenos de tipo genérico normalmente complejos y
enmarcados en un universo variable, mediante el empleo de modelos de reducción de la
información y de análisis de variación de los resultados en términos de representatividad.
2.3.2) Población y Muestra
• Población: En forma general en estadística se denomina población a un conjunto de
elementos que consiste de personas, objetos, etc. En los que se pueden observar o medir
una o más características de naturaleza cualitativa o cuantitativa.
• Parámetros: Se denomina parámetros a una medida descriptiva que resume a una
característica definida a una población, tal como la media o la varianza etc. Calculada a
partir de los datos observados de toda la población.
• Muestra: Se denomina muestra a una parte de la población seleccionada de acuerdo con
un plan o una regla con el fin de obtener información acerca de la población de la cual
proviene.
2.3.3) Clasificación De La Estadística
• Estadística Descriptiva: El término “estadística descriptiva” se refiere a procedimientos
para resumir y presentar datos cuantitativos de manera que revela las características de la
distribución de los datos.

27
• Estadística Inferencial: Extraer conclusiones de una muestra, para inferirlas a una
población con un determinado nivel de confianza.
• Estadística no Paramétrica: Pruebas estadísticas aplicadas cuando se supone que los
datos no se distribuyen normalmente.
• Estadística Paramétrica: Pruebas estadísticas aplicadas cuando se supone que los datos
se distribuyen normalmente.
• Análisis Univariante: Técnicas empleadas para analizar los cambios de una variable en
cada observación realizada.
• Análisis Bivariante: Técnicas empleadas para analizar simultáneamente los cambios de
dos variable en cada observación realizada.
• Análisis Multivariante: Técnicas empleadas para analizar simultáneamente los cambios
de diversas variables.
2.3.4) Medidas de Tendencia Central
Al describir grupos de observaciones, con frecuencia es conveniente resumir la información con
un solo número. Este número que, para tal fin, suele situarse hacia al centro de la distribución de
datos se denomina medida o parámetros de tendencia central o de centralización.

28
• Promedio: Es el valor numérico que se obtiene dividiendo la suma total de los valores
observados de una variable entre el número de observaciones.
• Mediana: Valor mediano de una serie de valores observados es el número, que separa a
la serie de datos ordenados (en forma creciente o decreciente) en dos partes de igual
número de datos. La mediana es la medida promedio que depende del número de orden
de los datos y no de los valores de estos datos, por lo tanto no la afectan los valores
aislados grandes o pequeños.
• Moda: Valor que se presenta con más frecuencia en una serie de mediciones.
2.3.5) Medidas de Dispersión
También llamadas medidas de variabilidad, muestran la variabilidad de una distribución,
indicando por medio de un número. Si las diferentes puntuaciones de una variable están muy
alejadas de la tendencia central. Cuanto mayor sea ese valor, mayor será la variabilidad, cuanto
menor sea, más homogénea será a la tendencia central. Así se sabe si todos los casos son
parecidos o varían mucho entre ellos.
• Rango: El rango de variación o recorrido, denotado por R es el número que resulta de
la diferencia del valor máximo (Xmax) menos el valor mínimo (Xmin) de una serie de
datos observados de variable X. Esto es,
𝑅 = 𝑋 𝑚𝑎𝑥 − 𝑋 𝑚𝑖𝑛 (1)

29
• Rango Intercuartil: El rango intercuartil, denotado por RI, es el número que resulta
de la diferencia del cuartil 3 menos el cuartil 1 de los datos. Esto es,
𝑅𝐼 = 𝑄3 − 𝑄1 (2)
El rango intercuartil es una medida que excluye el 25% superior y el 25% inferior,
dando un rango dentro del cual se encuentra el 50% central de los datos observados.
• Varianza: La varianza, es una medida que, en promedio, cuantifica el nivel de
dispersión o de variabilidad de los valores de una variable cuantitativa con respecto a
su media aritmética. Si los datos tienden a concentrarse alrededor de su media, la
varianza será pequeña. Si los valores tienden a distribuirse lejos de su media, la
varianza será grande.
𝑆2
=
∑ ( 𝑥𝑖 − 𝑥̅)2𝑛
𝑖=1
𝑛
(3)
• Desviación Estándar: La desviación estándar es la raíz cuadrada positiva de la
varianza. La desviación estándar definida como la raíz cuadrada de la media
cuadrática de una muestra se denota por:
𝑆 = √
∑ (𝑥𝑖−𝑥̅)2𝑛
𝑖=1
𝑛
(4)

30
• Coeficiente de Variación: El coeficiente de variación denotado por CV o RSD, es una
medida de dispersión relativa (libre de unidades de medición), que se define como el
cociente de la desviación estándar entre la media aritmética. Esto es,
𝑅𝑆𝐷 =
𝑆
𝑥̅
(5)
El coeficiente de variación se utiliza para comparar la variabilidad de dos o más series
de datos que tengan medias iguales o diferentes o que tengan unidades de medidas
iguales o diferentes.
2.3.6) Prueba De Normalidad
En estadística y probabilidad se llama distribución normal, distribución de Gauss o distribución
gaussiana, a una de las distribuciones de probabilidad de variable continua que con más
frecuencia aparece aproximada en fenómenos reales. La gráfica de su función de densidad tiene
una forma acampanada y es simétrica respecto de un determinado parámetro estadístico. Esta
curva se conoce como campana de Gauss y es el gráfico de una función gaussiana.
La importancia de esta distribución radica en que permite modelar numerosos fenómenos
naturales, sociales y psicológicos. Mientras que los mecanismos que subyacen a gran parte de
este tipo de fenómenos son desconocidos, por la enorme cantidad de variables incontrolables que
en ellos intervienen, el uso del modelo normal puede justificarse asumiendo que cada
observación se obtiene como la suma de unas pocas causas independientes.
Muchos de los procedimientos estadísticos habitualmente utilizados asumen la normalidad de los
datos observados. Resulta recomendable contrastar siempre si se puede asumir o no una

31
distribución normal. Cuando los datos no sean normales, podremos o bien transformarlos o
emplear otros métodos estadísticos que no exijan este tipo de restricciones (los llamados métodos
no paramétricos).
2.3.7) Prueba De Normalidad De Anderson Darling
La prueba de Anderson – Darling se basa en las desviaciones de las distribuciones acumuladas
experimentales respecto a las teóricas o supuestas. Si los datos no se distribuyen de acuerdo al
supuesto teórico, la distancia de las distribuciones acumuladas teóricas y experimentales crecen y
se hacen distintas.
Esta prueba se realiza con los residuales con el fin de detectar la normalidad de un conjunto de
datos y se evalúa de acuerdo a un Pvalué. Esta prueba se aplica a datos provenientes de una
muestra aleatoria de tamaño n asociado con alguna función de distribución desconocida,
denominada por F(x).
Esta prueba se realiza con los residuales, importante en el análisis de chequeos de las
suposiciones del modelo.
Figura N° 2. Campana de gauss prueba de normalidad

32
Fuente: manual práctico de quimiometria. Disponible en:
http://www.compostandociencia.com/estadistica_aplicada_al_analisis_quimico_quimiometria/
𝐴𝐷 = ∑
1−2𝑖
𝑛
𝑛
𝑖=1 ⌊ln⌊ 𝐹( 𝑍𝑖)⌋ + ln[1 − 𝐹( 𝑍 𝑛+1−𝑖)]⌋ (6)
Donde:
n = es el número de datos
Zi = es el valor del resultado estandarizado de la posición i-esima ordenado de mayor a
menor
F = función de probabilidad normal acumulada
AD = estadístico de Anderson Darling
• Planteamiento De Hipótesis:
Hipótesis nula (Ho): La muestra aleatoria tiene una distribución normal, con media y
varianza no especificada.

33
Hipótesis alternativa (Ha): La función de distribución y los resultados de ensayo no es
normal.
• Criterio:
Se rechaza la hipótesis nula a un nivel de significación aproximado α = 0.05 si Pvalue
es inferior a 0.05.
2.3.8) Detección De Puntos Atípicos
En estadística, tales como muestras estratificadas, un valor atípico es una observación que es
numéricamente distante que el resto de los datos. Las estadísticas derivadas de los conjuntos de
datos que incluyen valores atípicos serán frecuentemente engañosos.
Los valores atípicos pueden ser indicativos de datos que pertenecen a una población diferente del
resto de la muestra establecida.
2.3.9) Pruebas De Detección De Puntos Atípicos
• Z-Score: es aplicable a conjunto de datos que poseen distribución normal,
preferentemente cuando la cantidad de valores es grande (n ≥ 30). Tiene mayor
potencia para estos conjuntos de datos.
𝑍 =
𝑥𝑖− 𝑋̅
𝑆
(7)
Clasificación:
| 𝑍| ≤ 2 Satisfactorio
2 < | 𝑍| ≤ 3 Cuestionable

34
| 𝑍| > 3 Atípico
• Z-Score Robusto: es aplicable a conjunto de datos que no poseen distribución normal.
Preferentemente cuando la cantidad de valores es grande (n ≥ 30). Tiene mayor
potencia para este conjunto de datos.
𝑍 =
𝑋 𝑖−𝑀 𝑒
𝑆 𝑀𝑒
(8)
Clasificación:
| 𝑍| ≤ 2 Satisfactor
2 < | 𝑍| ≤ 3 Cuestionable
| 𝑍| > 3 Atípico
• Test de Dixon: es aplicable a cualquier conjunto de datos. Es aplicable cuando la
cantidad de valores es pequeña (n < 30). Tiene mayor potencia para este conjunto de
datos.
𝑄 = |
𝑋𝑠𝑜𝑠𝑝𝑒𝑐ℎ𝑜𝑠𝑜𝑠 − 𝑋 𝑝𝑟𝑜𝑥𝑖𝑚𝑜
𝑋 𝑚𝑎𝑥 − 𝑋 𝑚𝑖𝑛
| (9)
• Diagrama de Cajas: Un Diagrama de caja, también conocido como diagrama de caja y
bigotes, es un gráfico que está basado en cuartiles y mediante el cual se visualiza la
distribución de un conjunto de datos. Está compuesto por un rectángulo, la "caja", y dos
brazos, los "bigotes".
Es un gráfico que suministra información sobre los valores mínimo y máximo,
los cuartiles Q1, Q2 o mediana y Q3, y sobre la existencia de valores atípicos y la

35
simetría de la distribución. Primero es necesario encontrar la mediana para luego
encontrar los 2 cuartiles restantes. Es aplicable a cualquier conjunto de datos.
Clasificación:
Xi ≥ Q1 − 1.5× (RI) y Xi ≤ Q3 + 1.5× (RI) satisfactorio
Xi < Q1 − 1.5× (RI) y Xi > Q3 + 1.5× (RI) atípico leve
Xi < Q1 − 3× (RI) y Xi > Q3 + 3× (RI) atípico extremo
Donde:
RI = rango intercuartil
Figura N° 3. Diagrama de cajas
Fuente: nube de datos disponible en:
http://nubededatos.blogspot.pe/2015/02/introduccion-al-diagrama-de-caja-box.html
• Prueba De Grubbs: se basa en la suposición de normalidad. Es decir, uno debe
primero verificar que los datos pueden ser razonablemente aproximado por una
distribución normal antes de aplicar el test de Grubbs.

36
La prueba de Grubbs detecta un valor atípico a la vez. Este valor atípico es borrado
del conjunto de datos y la prueba se repite hasta que no se detecten valores atípicos.
La prueba de Grubbs se define:
𝐺 =
𝑥̅ − 𝑥 𝑚𝑖𝑛𝑖𝑚𝑜
𝑆
(10)
𝐺 =
𝑥 𝑚𝑎𝑥𝑖𝑚𝑜 – 𝑥̅
𝑆
(11)
Donde:
xmin = valor mínimo
xmax = valor máximo
S = desviación estándar
x = media
El valor de G debe ser menor o igual al valor de G de la tabla para que no exista
diferencia significativa
2.3.10) intervalo de confianza
En estadística, se llama intervalo de confianza a un par o varios pares de números entre los
cuales se estima que estará cierto valor desconocido con una determinada probabilidad de
acierto. Formalmente, estos números determinan un intervalo, que se calcula a partir de datos de

37
una muestra, y el valor desconocido es un parámetro poblacional. La probabilidad de éxito en la
estimación se representa con 1 – α y se denomina nivel de confianza. En estas
circunstancias, α es el llamado error aleatorio o nivel de significación, esto es, una medida de las
posibilidades de fallar en la estimación mediante tal intervalo.
El nivel de confianza y la amplitud del intervalo varían conjuntamente, de forma que un intervalo
más amplio tendrá más probabilidad de acierto (mayor nivel de confianza), mientras que para un
intervalo más pequeño, que ofrece una estimación más precisa, aumenta su probabilidad de error.
Para la construcción de un determinado intervalo de confianza es necesario conocer
la distribución teórica que sigue el parámetro a estimar, θ2
. Es habitual que el parámetro
presente una distribución normal. También pueden construirse intervalos de confianza con
la desigualdad de Chebyshev.
En definitiva, un intervalo de confianza al 1 – α por ciento para la estimación de un parámetro
poblacional u que sigue una determinada distribución de probabilidad, es una expresión del tipo
[u1, u2] tal que P[u1 ≤ u ≤ u2] = 1 – α, donde P es la función de distribución de probabilidad de u.
Si 𝑥̅ es la media muestral de una muestra aleatoria de tamaño “n” de una población con varianza
conocida S2
, un intervalo de confianza para µ del 100 (1 – α) % está dado por:
𝑥̅ − 𝑡1−
𝛼
2
×
𝑆
√ 𝑛
≤ 𝑢 ≤ 𝑥̅ + 𝑡1−
𝛼
2
×
𝑆
√ 𝑛
(12)

38
Figura N° 4. Intervalo de confianza
Fuente: intervalo de confianza disponible: https://es.wikipedia.org/wiki/Intervalo_de_confianza
2.3.11) Prueba De T-Student De Una Muestra
En estadística, una prueba t de Student, o Test-T es cualquier prueba en la que el estadístico
utilizado tiene una distribución t de Student si la hipótesis nula es cierta. Se aplica cuando la
población estudiada sigue una distribución normal pero el tamaño muestral es demasiado

39
pequeño como para que el estadístico en el que está basada la inferencia esté normalmente
distribuido, utilizándose una estimación de la desviación típica en lugar del valor real. Es
utilizado en análisis discriminante.
La teoría de decisiones se usa en forma análoga empleando los intervalos de confianza. Para poder
aplicarlo se debe tener en cuenta los requisitos siguientes:
• Las muestras deberán ser extraídas de una población normal o aproximadamente
normal.
• La selección de la muestras deben ser de forma aleatoria
• Las repeticiones son independientes entre si
Si estas no se cumplen, las conclusiones que se obtengan no serán validas
T-Student:
𝑡 = (
𝑥̅ − 𝑢0
𝑆
) × √ 𝑛 (13)
Donde:
t: prueba T-Student
𝑥̅: Valor del promedio
𝑢0: Valor referencial de media
S: desviación estándar
n: número de datos
Donde existirá diferencia significativa:
|𝑡 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙| > 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎

40
2.3.12) Prueba De T-Student De Dos Muestra
El modelo t-Student también se puede usar cuando se desea comparar dos muestras entre sí, para
detectar si hay diferencia significativa entre ellas, debido a algún factor analizado. En primer
lugar se analiza el caso de dos muestras independientes, también cuando las muestras no son
independientes sino apareadas. Donde los supuestos para poder aplicar este modelo; al comparar
con t-Student las do s muestras deben ser normales, aleatorios e independientes. Además el
estadístico de contraste suponiendo la igualdad de varianzas:
T-student:
𝑡 =
| 𝑋1̅̅̅̅ − 𝑋2̅̅̅̅|
√ 𝑆2 × (
1
𝑛1
+
1
𝑛2
)
(13.1)
𝑆2
=
( 𝑛1 − 1) × 𝑆12
+ ( 𝑛2 − 1) × 𝑆22
𝑛1 + 𝑛2 − 2
(14)
Donde:
t: prueba de T-Student
X1, X2: valores de promedio
S1, S2: desviación estándar
n1, n2: número de datos
Además el valor de t de tabla es obtenido a partir de la distribución de t-Student para (n1+n2-2)
grados de libertad.

41
Donde existirá diferencia significativa:
|𝑡 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙| > 𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎
2.3.13) Prueba De Wilcoxon
La prueba de Wilcoxon se llama ahora comúnmente Prueba de rango con signos de Wilcoxon.
Para el desarrollo de esta teoría la muestra debe ser de una procedencia poblacional que no sea
normal o no paramétrica donde se debe aplicar a una restricción adicional a la distribución de la
que se toma los datos. Esta prueba se aplica en caso de una distribución continua simétrica. Bajo
esta condición podemos probar la hipótesis nula (Ho: μ = μo al cual restaremos μo, de cada
valor muestral y descartaremos todas las diferencias a cero. Se clasifican entonces las diferencias
restantes sin importar el signo. Se asigna un rango de 1 a la diferencia absoluta más pequeña (es
decir sin signo), un rango de 2 a la siguiente más pequeña, y así sucesivamente. Cuando el valor
absoluto de dos o más es el mismo, se asigna a cada uno el promedio de los rangos que se
asignarían si las diferencias se distinguieran.
2.3.14) Prueba De Mann Whitney

42
En estadística la prueba U de Mann-Whitney (también llamada de Mann-Whitney-
Wilcoxon, prueba de suma de rangos Wilcoxon, o prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney) es
una prueba no paramétrica aplicada a dos muestras independientes. Es, de hecho, la versión no
paramétrica de la habitual prueba t de Student.
Fue propuesto inicialmente en 1945 por Frank Wilcoxon para muestras de igual tamaños y
extendido a muestras de tamaño arbitrario como en otros sentidos por Henry B. Mann y D. R.
Whitney en 1947.
Este método y prueba de Mann Whitney también llamada prueba U se utiliza en muestras de
población no normal. La prueba consiste en:
• Combinar todos los valores muéstrales en orden del más pequeño al más grande, y
asignar rangos a todos los valores. Si dos o más valores son idénticos a estos valores
muéstrales se les designa un rango igual a la media de los rangos que les hubiera
correspondido sin empate
• Ahora se calcula la suma de los rangos para cada una de las muestras. Denotar estas
sumas como R1 y R2, donde N1 y N2 son los tamaños de muéstrales respectivos. Por
conveniencia, se elige N1 como la muestra más pequeña, en caso de que sean diferentes
de tal modo que N1 < N2 una diferencia significa entre las suma de rangos R1 y R2
implica una diferencia significativa entre las muestras.
• Para probar la diferencia entre las sumas de rangos, se utiliza el estadístico:

43
𝑈 = 𝑁1 × 𝑁2 +
𝑁1 × ( 𝑁1 + 1)
2
− 𝑅1 (15)
Donde la distribución muestral U es simétrica y tiene una media y una varianza
determinadas, respectivamente por las formulas:
𝑢 𝑈 =
𝑁1 × 𝑁2
2
𝜎2
=
𝑁1 × 𝑁2( 𝑁1 + 𝑁2 + 1)
12
(16)
2.3.15) Método RSD De Horwitz
El método de Coeficiente de variabilidad de Horwitz, determinado a partir del RSD, este
resultado es medido con el coeficiente de variabilidad o desviación estándar relativa, que son
definidos y utilizados como medidas de la dispersión de resultados como medidas de
repetibilidad o de reproducibilidad. Se determina de la siguiente manera:
𝑅𝑆𝐷𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 =
𝑆
𝑥̅
× 100% (17)
Método de la prueba RSD Horwitz:
𝑅𝑆𝐷 𝐻𝑜𝑟𝑤𝑖𝑡𝑧 = 21−0.5𝑙𝑜𝑔(𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛)
(18)

44
Donde no existirá diferencia significativa si:
𝑅𝑆𝐷𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 ≤ 0.67𝑅𝑆𝐷 𝐻𝑜𝑟𝑤𝑡𝑖𝑧 (19)
2.3.16) Análisis De Varianza (ANOVA)
La técnica estadística conocida como ANÁLISIS DE LA VARIANZA (ANOVA) trata de cómo
determinar si un fenómeno, que podemos cuantificar, tiene el mismo comportamiento en todos
los grupos de una población, que se diferencian entre sí por algún factor.
• Prueba F Comparación De Varianza: En muchos casos también es importante probar la
precisión entre dos analistas y dos métodos de laboratorios que difieren en precisión. La
prueba F se considera la razón de las dos varianzas. La cantidad calculada (F) está dada
por: La hipótesis nula es adoptada si las poblaciones de donde se toman las muestras
deben ser normales. Si la hipótesis nula es verdadera, se concluye que la razón de las
varianzas es próxima a uno. Este método se determina de la siguiente manera:
𝐹𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 =
𝑀𝑎𝑥 𝑆1
2
, 𝑆2
2
𝑀𝑖𝑛𝑆1
2
, 𝑆2
2 (20)
Método de la prueba F:
𝐹𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 = 𝐹(𝑔𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟,𝑔𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑑𝑒𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑟,1−𝛼)

45
𝐹𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 < 𝐹𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎
2.3.17) Método Chi-Cuadrado
La prueba de Chi Cuadrado puede usarse para determinar qué tan bien las distribuciones teóricas
(como las distribuciones normales y binominal) se ajustan a las distribuciones empíricas (es
decir, aquellas obtenidas de datos de muestras)
• Estadístico de Contraste:
Se utilizara el siguiente estadístico:
𝑋2
= ∑
( 𝑂𝑖 − 𝐸𝑖)2
𝐸𝑖
𝐾
𝑖=1
(21)
Donde:
Oi = Frecuencia Observada.
Ei = Frecuencia Esperada.
K = Número de categorías.
• Estadístico de Tabla:
𝑋2(1 − 𝛼, 𝐾 − 𝑟 − 1)

46
La cual posee una distribución Chi Cuadrado con un “(1-α) %” de confianza y “k-r-1” grados de
libertad. Donde “r” son los parámetros calculados de los datos para poder estimar los valores
observados.
Donde el criterio es aceptar la hipótesis nula, siempre y cuando el valor de tabla sea mayor o
igual al estimado de contraste.
2.3.18) Prueba De Bartlett
Introducida por Bartlett en 1937, es una modificación del test de Neyman y Pearson para
“corregir el sesgo”; esta prueba es la que se utiliza con más frecuencia para probar la
homogeneidad de las varianzas. En esta prueba los ni en cada tratamiento no necesitan ser
iguales; sin embargo, se recomienda que los ni no sean menores que 3 y muchos de los ni deben
ser mayores que 5.
El estadístico de prueba se define como:
𝑋2
𝐵𝑎𝑟𝑡𝑙𝑒𝑡𝑡 =
[ln (
∑ 𝑆2
× ( 𝑛 − 1)
∑( 𝑛 − 1)
) × ∑( 𝑛 − 1)] − ∑ 𝑙𝑛𝑆2
× (𝑛 − 1)
1 +
𝐾 + 1
3 × ( 𝐾 − 1) × ( 𝑁 − 𝐾)
(22)
Donde:
X2
Bartlett = valor estadístico
ln = logaritmo natural

47
n = tamaño de la muestra del grupo
S2
= varianza
K = número de grupos (participantes)
N = tamaño total (sumatoria de las muestras)
𝑋2
𝐵𝑎𝑟𝑡𝑙𝑒𝑡𝑡 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 < 𝑋2
𝐵𝑎𝑟𝑡𝑙𝑒𝑡𝑡 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎
El X2
Bartlett se calcula por K – 1 grados de libertad a un nivel de significancia α
𝑋2
(𝐾 − 1, ∝)
2.3.19) Regresión Lineal Simple
Se calcula la recta de regresión de y sobre x mediante el método de los mínimos cuadrados para
obtener una ecuación que permita interpolar la concentración de muestras mediante una ecuación
del tipo y = a + bx.
Pendiente:
𝑏 =
∑[( 𝑥𝑖 − 𝑥̅)( 𝑦𝑖 − 𝑦̅)]
∑( 𝑥𝑖 − 𝑥̅)2
(23)
Intercepto:
𝑎 = 𝑦̅ − 𝑏𝑥̅ (24)

48
Coeficiente de correlación:
𝑟 =
∑[( 𝑥𝑖 − 𝑥̅) ( 𝑦𝑖 − 𝑦̅)]
√[∑( 𝑥𝑖 − 𝑥̅)2] [∑( 𝑦𝑖 − 𝑦̅)2]
(25)
Cuando r = 1 se tiene una correlación lineal perfecta, cuando no existe correlación r = 0. En la
práctica analítica las gráficas de calibración proporcionan valores de r mayores que 0,99 valores
de r menores de 0,9 son poco comunes. (Solo análisis de espectrofotometría de absorción
atómica por lectura directa es usual obtener r ≥ 0,999).
2.4) Validación De Método De Ensayo
La validación de un método analítico es un paso fundamental para asegurar que los resultados
entregados por dicho método son confiable. Cuando se realiza la validación de un método por
parte del laboratorio, lo que se busca es poder determinar con fundamento estadístico que el
método es adecuado para los fines previstos. En este sentido, es importante que para el proceso
de validación se asigne a un responsable de realizar dicha tarea. De manera que, la validación se
efectué en forma metódica, ordenada, trazable y confiable. Es importante que el laboratorio tenga
claridad antes de iniciar la validación de cuáles son los requerimientos del método para
establecer el alcance de la validación. Es esencial, entonces conocer el método a validar y su

49
aplicabilidad, es decir, el analito, su concentración y la matriz o matrices en las cuales se desea
utilizar.
En general, se establece que el laboratorio debe validar:
• Métodos no normalizados: Corresponden a métodos desarrollados por el
laboratorio o método nuevos (ejemplo: publicado en revista científica), o bien, a
métodos que tradicionalmente se han utilizado en el laboratorio pero que no están
normalizados.
• Métodos normalizados: con una modificación significativa. Cuando se trata de un
método empleado tradicionalmente por el laboratorio que no esté normalizado, se
puede realizar una Validación Retrospectiva, es decir, en base a los datos
experimentales que el laboratorio dispone, para la cual se realizara la recopilación
de la mayor cantidad de datos históricos disponibles, para luego realizar un proceso
de ordenamiento y selección de los datos recopilados, estos datos pueden ser:
curvas de calibración, resultados de ensayos, cartas de control, ensayos de aptitud,
etc. A través de estos, se deberán determinar los parámetros de validación, y
evaluar si los resultados obtenidos para los fines de la son aceptable. En caso de ser
un método nuevo o uno antiguo del que no se dispongan de datos suficientes se
debe realizar una Validación Prospectiva, generando a través de análisis datos
experimentales.
En algunos casos se puede realizar lo que se conoce como validación menor o verificación
cuando se trate de:

50
• Métodos normalizados.
• Métodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto
• Ampliaciones y modificaciones menores de métodos normalizados. Ejemplo: uso en
otros analitos.
• Cuando se trate de métodos previamente validados, que haya sufrido alguna alteración
significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones pueden ser; cambio
de equipo, cambio de componentes de equipo como columnas, detectores, cambio
analista, cambio de la matriz que contiene la muestra o de nivel de concentración del
analito de interés, entre otros.
La verificación, tiene generalmente como objetivo, el comprobar que el laboratorio domina el
método de ensayo normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un método
normalizado modificado para la verificación se requiere solo realizar aquellas pruebas que
indiquen que la variación realizada no afecta el ensayo. En ocasiones, lo que se busca a través de
una validación es demostrar que un método es equivalente a otro.
El objetivo de la validación y la verificación, es demostrar que el método utilizado por un
laboratorio es adecuado para la aplicación en la que se propone utilizar, así, como también
demostrar que las modificaciones que pudieron haberse realizado no afectan su desempeño, ni la
confiabilidad de los resultados por este entregado.
2.4.1) Plan de Validación

51
Se entiende como Plan de Validación, a un documento tipo protocolo en el cual se definen
previamente a la experiencia; las pruebas o parámetros de validación necesarios y el diseño
experimental a desarrollar en base a los requerimientos del método. El Plan de Validación deberá
contener a lo menos:
• Alcance de la validación: método, analito, matrices y requerimientos del método.
• Diseño experimental: Establecer las muestras a ser analizadas: testigos reactivos, blanco
matriz, material certificados, material control, materiales de referencia certificado,
matrices de las muestras, muestras sin fortificar, muestras fortificadas, etc. Los
parámetros y pruebas a desarrollar, en caso, de que la prueba no sea una convencional,
sino diseñada por el responsable, también deberá indicarse en el documento. Numero de
análisis requeridos para cada prueba y/o parámetro.
• Criterios de aceptabilidad para cada parámetro de validación. Analistas responsables de
realizar las pruebas analíticas.
• Materiales, insumos y equipos necesarios para desarrollar la validación.
• Responsable de la Validación, fecha o tiempo programado para realizar la validación y
fecha de elaboración de plan.
• Las técnicas estadísticas son esenciales para agrupar los datos obtenidos y realizar un
análisis objetivo de las diferencias entre conjuntos de datos (pruebas de significación).

52
Los analistas deben familiarizarse con los elementos básicos de la teoría estadística como
ayuda para la evaluación de la precisión, sesgo, rango lineal, LOD, LOQ e incertidumbre
de medida. En la guía se incluyen varias referencias a libros de introducción a la
estadística en química analítica.
2.4.2) Parámetros De Validación
Los ensayos o mediciones realizadas serán con el fin de poder realizar las siguientes pruebas
de parámetros de validación:
• Veracidad: La veracidad es el grado de concordancia existente entre el valor medio
obtenido de un conjunto de resultado de todo el desarrollo de las pruebas, y es un valor
aceptable como referencia (ISO 5725-1). Para el cálculo de la veracidad en la validación
está determinado por casos importantes y específicos, estos casos son:
o La veracidad de las repeticiones de datos de un método frente a una muestra referencial
certificada, para este caso se utiliza dos métodos la prueba de t-Student o la prueba de
Wilcoxon.
o La veracidad de las repeticiones de un método a validar frente a un método
estandarizado, para este caso se requiere el uso de la prueba t-Student de dos muestras o
la prueba de Mann Whitney.

53
• Precisión: Grado de concordancia existente entre los resultados independientes de un
ensayo obtenidos en condiciones estipuladas (ISO 5725-1) o precisión ya sea de un
método o sistema, se refiere al grado de concordancia entre los resultados individuales de
la prueba, cuando el procedimiento se aplica repetitivamente a muestras múltiples o a una
muestra homogénea. Para evaluar la precisión de un sistema se analiza una concentración
conocida de la sustancia de interés y se establece un número de réplicas.
• Exactitud: Grado de concordancia existente entre el resultado del ensayo y un valor
aceptado de referencia (ISO 5725-1), o el acercamiento de los resultados experimentales
obtenidos, al valor verdadero. Se expresa como el por ciento de recobro por el ensayo de
cantidades conocidas adicionadas al analito. Para la evaluación de este parámetro se
realiza el análisis de un material de referencia certificado, preferentemente con una
matriz semejante a la de la muestra. Sólo en el caso de no existir un material adecuado se
puede realizar un ensayo de recuperación. Cuando sea posible, se realizan un mínimo de
10 repeticiones del ensayo tres días consecutivos. Se compara el promedio de los valores
obtenidos con el valor de referencia certificado, teniendo en cuenta la incertidumbre
asociada a ese material.
• Selectividad/especificidad: Es el grado por el cual un método puede determinar un
analito particular dentro de una mezcla compleja sin ser interferido por otros
componentes de la mezcla (EURACHEM-Guide the fitness for purpose of analytical
methods). Es la capacidad del método para medir con exactitud y específicamente el
analito en presencia de componentes que se espera que estén presentes en la matriz de la

54
muestra. Se determina como el grado de diferencia que se obtiene al comparar los
resultados analíticos de muestras contaminadas con impurezas, con los resultados de la
muestra sin contaminar. La interferencia se determina como la diferencia obtenida entre
los resultados de los grupos de muestras.
o Selectividad: La selectividad da una indicación de cuan fuertemente un resultado es
afectado por otros componentes de la muestra.
o Especificidad: La especificidad es la capacidad de un método para evaluar
inequívocamente al analito en presencia de los componentes que pueden estar presentes,
tales como impurezas, productos de degradación, componentes de la matriz, etc. Por lo
general, los resultados en un experimento, casi no coinciden con los valores predichos
por la teoría o el modelo en el cual se está trabajando. Esto es así por las fluctuaciones o
error en la medición. El problema es determinar si esas diferencias se deben al azar, o
bien no se ajusten al modelo teórico estudiado, en cuyo caso este modelo deberá ser
modificado y vuelto a investigar.
Para verificar este hecho utilizaremos pruebas estadísticas como: Prueba de Chi-
Cuadrado, la Prueba de Verosimilitud (G), y el Modelo de Mc- Nemar.
• Límite de detección del método: En un procedimiento analítico es la menor cantidad de
un analito en una muestra la cual puede ser detectada pero no necesariamente
cuantificada con un valor exacto (EURACHEM-Guide the fitness for purpose of
analytical methods). Es un parámetro de prueba límite. Es la concentración más baja a la

55
cual el analito puede ser detectado, pero no necesariamente cuantificado, bajo las
condiciones experimentales establecidas. Para un resultado analítico que es muy cercano
al valor del blanco, se plantea la duda de si el valor corresponde a valores aleatorios del
blanco o a la presencia real del analito.
𝐿𝐷𝑀 = 𝑥̅ 𝑏 𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜𝑠 + 𝑡(𝑛−1,𝛼) × 𝑆 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜𝑠 (26)
• Límite de cuantificación del método: Es la concentración mínima que puede
determinarse con un nivel aceptable de exactitud y precisión (EURACHEM-Guide the
fitness for purpose of analytical methods). Es un parámetro para ensayos cuantitativos
de bajos niveles de compuestos en matrices de muestras.
Se emplea cuando se realizan determinaciones de analitos a nivel de trazas. En
esencia se encuentran en la literatura dos formas para determinarla de manera análoga
al límite de detección, en el cual el límite de cuantificación es como mínimo tres
veces el límite de detección, según cada caso por determinación de una incertidumbre
de los resultados máxima permisible.
𝐿𝐶𝑀 = 𝑥̅ 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜𝑠 + 𝐾 × 𝑆 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜𝑠 (27)
Donde:
K= 5,6 o 10 (número de blancos)
• Linealidad: Es la relación entre la concentración de analito y la respuesta del método
(EURACHEM-Guide the fitness for purpose of analytical methods). Es la habilidad
del método para obtener resultados en la prueba que son directamente o por una
transformación matemática bien definida, proporcional a la concentración del analito

56
en muestras dentro de un rango dado. Generalmente se expresa en términos alrededor
de la pendiente de regresión lineal, calculada de acuerdo a una relación matemática
establecida de los resultados obtenidos de la prueba a analizar muestras de
concentración variable al analito.
• Sensibilidad: La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicación de un
sistema de medición y el cambio correspondiente en el valor de la cantidad objeto de
la medición. En una regresión lineal la sensibilidad corresponde a la pendiente (m) de
la recta de calibración. Se dice, que un método es sensible cuando una pequeña
variación de concentración determina una gran variación de respuesta. La sensibilidad
permite observar la capacidad de respuesta instrumental frente a una determinada
cantidad de analito. En el tiempo, visualiza cómo se comporta el instrumento
• Rango de trabajo: Es el intervalo entre el nivel más alto y más bajo del analito en el
que se ha demostrado que el método tal y como se indica, puede ser determinado con
exactitud, precisión y linealidad (Text on validatión of analytical. ICH Harmonized
Tripartite Guideline). Normalmente se expresa en las mismas unidades que los
resultados de la prueba en el método analítico
• Robustez: Es la medida de la resistencia de un método al cambio de respuesta cuando
se introducen pequeñas variaciones en el procedimiento (EURACHEM-Guide the
fitness for purpose of analytical methods). Es el grado de reproducibilidad de los
resultados de la prueba obtenidos por el análisis de una misma muestra bajo una
variación de las condiciones normales de prueba, tales como diferentes laboratorios,

57
analistas, ensayos, temperaturas, lotes de reactivos, días, etc. Es una medida de la
reproducibilidad de los datos de la prueba bajo las condiciones operacionales
normalmente esperadas de laboratorio a laboratorio y de analista a analista
El objetivo de la prueba de robustez es optimizar el método analítico y describir que
bajo las condiciones establecidas (incluidas sus tolerancias) se pueden obtener
resultados suficientemente exactos con una alta seguridad, de manera que el
procedimiento funcione confiablemente si se utiliza en otros laboratorios o después
de intervalos largos de tiempo.
• Incertidumbre: Parámetro asociado al resultado de una medición, que caracteriza la
dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mesurando
(EURACHEM-Guide the fitness for purpose of analytical methods).
2.5) Metodologías Analíticas
Los resultados de un análisis cuantitativo típico se calculan a partir de dos medidas. Una es la
masa o volumen de la muestra que se analiza. La segunda es la medida de alguna cantidad
proporcional a la del analito de la muestra, como la masa, volumen, intensidad luminosa o carga
eléctrica. Esta segunda medida, generalmente, complementa el análisis y su naturaleza sirve de
base para clasificar los métodos analíticos:
• métodos gravimétricos: En química analítica, el análisis gravimétrico o gravimetría
consiste en determinar la cantidad proporcionada de
un elemento, radical o compuesto presente en una muestra, eliminando todas las

58
sustancias que interfieren y convirtiendo el constituyente o componente deseado en
un compuesto de composición definida, que sea susceptible de pesarse. La
gravimetría es un método analítico cuantitativo, es decir, que determina
la cantidad de sustancia, midiendo el peso de la misma con una balanza analítica y
por último sin llevar a cabo el análisis por volatilización.
Los cálculos se realizan con base en los pesos atómicos y moleculares, y se
fundamentan en una constancia en la composición de sustancias puras y en las
relaciones ponderales (estequiometria) de las reacciones químicas.
• métodos volumétricos: La valoración o titulación es un método de análisis
químico cuantitativo en el laboratorio que se utiliza para determinar
la concentración desconocida de un reactivo conocido. Debido a que las medidas de
volumen desempeñan un papel fundamental en las titulaciones, se le conoce también
como análisis volumétrico.
Un reactivo llamado “valorante” o “titulador”, de volumen y concentración conocida
(una solución estándar o solución patrón) se utiliza para que reaccione con una solución
del analito, de concentración desconocida. Utilizando una bureta calibrada para añadir el
valorante es posible determinar la cantidad exacta que se ha consumido cuando se
alcanza el punto final. El punto final es el punto en el que finaliza la valoración, y se

59
determina mediante el uso de un indicador. Idealmente es el mismo volumen que en
el punto de equivalencia el número de moles de valorante añadido es igual al número de
moles de analito, algún múltiplo del mismo (como en los ácidos polipróticos). En la
valoración clásica ácido fuerte-base fuerte, el punto final de la valoración es el punto en
el que el pH del reactante es exactamente 7, y a menudo la solución cambia en este
momento de color de forma permanente debido a un indicador. Sin embargo, existen
muchos tipos diferentes de valoraciones. Pueden usarse muchos métodos para indicar el
punto final de una reacción: a menudo se usan indicadores visuales (cambian de color).
En una titulación o valoración ácido-base simple, puede usarse un indicador de pH, como
la fenolftaleína, que es normalmente incolora pero adquiere color rosa cuando el pH es
igual o mayor que 8,2. Otro ejemplo es el naranja de metilo, de color rojo en medio ácido
y amarillo en disoluciones básicas. No todas las titulaciones requieren un indicador. En
algunos casos, o bien los reactivos o los productos son fuertemente coloreados y pueden
servir como “indicador”. Por ejemplo, una titulación o valoración redox que
utiliza permanganato de potasio como disolución estándar (rosa/violeta) no requiere
indicador porque sufre un cambio de color fácil de detectar pues queda incolora al
reducirse el permanganato. Después del punto de equivalencia, hay un exceso de la
disolución titulante (permanganato) y persiste un color rosado débil que no desaparece.
Debido a la naturaleza logarítmica de la curva de pH, las transiciones en el punto final
son muy rápidas; y entonces, una simple gota puede cambiar el pH de modo muy
significativo y provocar un cambio de color en el indicador. Hay una ligera diferencia
entre el cambio de color del indicador y el punto de equivalencia de la titulación o
valoración. Este error se denomina error del indicador. Por este motivo es aconsejable

60
efectuar determinaciones en blanco con el indicador y restarle el resultado al volumen
gastado en la valoración.
• métodos electroanaliticos: Los Métodos electroanalíticos son una clase de técnicas
en química analítica, que estudian un analito mediante la medida del potencial
eléctrico (voltios) y/o la corriente eléctrica (Amperios) en una celda electroquímica, que
contiene el analito. Estos métodos se pueden dividir en varias categorías dependiendo de
qué aspectos de la celda son controlados y cuáles se miden. Las tres principales
categorías son:potenciometría (se miden la diferencia de potenciales en el electrodo),
coulombimetría (se mide la corriente de las celdas con el tiempo), y
Voltamperometría (se mide la corriente de las celdas mientras se altera activamente el
potencial de las celdas).
• métodos espectrométricos : Los métodos espectrométricos son métodos instrumentales
empleados en química analítica basados en la interacción de la radiación
electromagnética, u otras partículas, con un analito para identificarlo o determinar
su concentración. Algunos de estos métodos también se emplean en otras áreas de la
química para elucidación de estructuras. Estos métodos emplean técnicas que se dividen
en técnicas espectroscópicas y en técnicas no espectroscópicas. Las técnicas
espectroscópicas son aquellas en las que el analito sufre procesos
de absorción, emisión o luminiscencia. El resto corresponde a técnicas no
espectroscópicas.

61
Las técnicas espectroscópicas se diferencian también según la forma en la que se
encuentra el analito en el momento en el que sufre el proceso espectroscópico, dando
lugar a la espectroscopia atómica y a la espectroscopia molecular.
Según el rango de energía que presente la radiación electromagnética existen diferentes
técnicas, por ejemplo, espectroscopia de infrarrojo, espectroscopia de resonancia
magnética nuclear, etcétera. Las técnicas no espectroscópicas aprovechan diferentes
propiedades de la radiación electromagnética, como el índice de refracción o la
dispersión. Otra técnica importante es la espectrometría de masas, también empleada
en química orgánica para la elucidación de estructuras moleculares.
• métodos cromatógraficos: La cromatografía es un método físico de separación para la
caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la
ciencia; Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y
determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de
partición de los compuestos dan como resultado una retención diferencial sobre la fase
estacionaria y, por tanto, una separación efectiva en función de los tiempos de
retención de cada componente de la mezcla.
2.6) Espectrofotómetro

62
Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en
función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica
relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en
una muestra. También se utiliza en laboratorios de química para la
cuantificación de sustancias y microorganismos.
Hay varios tipos de espectrofotómetros, que son de absorción atómica, de absorción molecular
(que comúnmente se conoce como espectrofotómetro UV-VIS), y no debe ser confundido con un
espectrómetro de masa.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una
muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al
operador realizar dos funciones:
• dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra,
• indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la
muestra.
2.6.1) Componentes de un Espectrofotómetro
• fuente de luz: La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las siguientes
condiciones: estabilidad, direccionalidad, distribución de energía espectral continua y
larga vida. Las fuentes empleadas son: lámpara de wolframio (también

63
llamado tungsteno), lámpara de arco de xenón y lámpara de deuterio que se utilizan en
los laboratorios atómicos.
• monocromador: El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que
inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromática.
Está constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de
dispersión. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es un lente que
lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el
cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia
otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.
• compartimiento de muestra: Es donde tiene lugar la interacción con la materia (debe
producirse donde no haya absorción ni dispersión de las longitudes de onda). Es
importante destacar, que durante este proceso, se aplica la ley de Lambert-Beer en su
máxima expresión, con base en sus leyes de absorción, en lo que concierne al paso de la
molécula de fundamental-excitado.
• detector: El detector, es quien detecta una radiación y a su vez lo deja en evidencia, para
posterior estudio. Hay de dos tipos:
o los que responden a fotones.
o los que responden al calor.

64
• fotodetectores: En los instrumentos modernos se encuentra una serie de
16 fotodetectores para percibir la señal en forma simultánea en 16 longitudes de onda,
cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes
móviles del equipo.
• celdas: Son los recipientes donde se depositan las muestras líquidas a analizar. El
material del cual están hechas varía de acuerdo a la región que se esté trabajando; son de
vidrio o plástico si se trabaja en la región visible, de cuarzo si se trabaja en la ultravioleta
y de NaCl si se trabaja la región de infrarrojo. Se caracterizan por tener dos paredes
correspondientes a los lados ópticos por donde cruza el haz de luz.
Figura N° 5. Componentes de un espectrofotómetro

65
Fuente: calibración de instrumentos para análisis instrumental disponible en:
http://mapalu1994.blogspot.pe/2011/12/espectrofotometro.html
2.6.2) Espectrofotometría UV-Visible
El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas
analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización
físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la
espectroscopia, en general, y la espectroscopia ultravioleta-visible, en particular. Se pueden
identificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo de
reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto
coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectroscopia se debe a la capacidad de las moléculas para absorber
radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de
las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen
de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica,
constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la
determinación y caracterización de biomoléculas.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna.
Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y bacterias.
Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se origina un salto
desde un estado energético basal o fundamental, E
1
, a un estado de mayor energía (estado
excitado), E
2
. Y sólo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cada

66
molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas.
Como consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una molécula esto
es, su espectro de absorción constituye una seña de identidad de la misma. Por último, la
molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental.
En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación
electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectrofotometría
de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible
(400-780 nm).
La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una región
de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura común. Los compuestos
con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos
carbonilos y otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta
es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos.
Diversos factores como pH, concentración de sal y el disolvente que alteran la carga de las
moléculas, provocan desplazamientos de los espectros UV. La fuente de radiación ultravioleta
es una lámpara de deuterio.
En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite.

67
Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la
que absorbe luz la solución coloreada. La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de
tungsteno y no proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm.
Figura N° 6. Espectrofotómetro UV- visible
Fuente: calibración de instrumentos para análisis instrumental disponible en:
http://mapalu1994.blogspot.pe/2011/12/espectrofotometro.html
2.6.3) TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA
Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad I
o
incide
perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que absorbe luz o
cromóforo, el compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (I
a
) y dejará pasar el resto
(I
t
), de forma que se cumple: I
o
= I
a
+ I
t

68
• transmitancia: La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la
cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, I
t,
y la cantidad de luz que incidió sobre ella, I
o
, y se representa normalmente en tanto por
ciento:
%𝑇 =
𝐼𝑡
𝐼0
× 100
La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y
transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal,
pero asume una relación logarítmica inversa.
• absorbancia: Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta
luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor
cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz
será transmitida por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos
aspectos del mismo fenómeno. La absorbancia, a una determinada longitud de onda
lambda, se define como:
𝐴 = − log10 (
𝐼𝑡
𝐼0
)
Donde It es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I0 es la
intensidad de la luz incidente.
Figura N° 7. Atenuación de un haz de radiación por una disolución absorbente

69
Fuente: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas disponible
en: http://adela9613.blogspot.pe/2015/04/espectrofometria-de-absorcion.html
2.6.4) Ley de Lambert-Beer
La ley de BOUGUER-LAMBERT-BEER también se conoce como ley de Beer-Lambert-
Bouguer y fue descubierta de formas diferentes e independientes en primer lugar por el
matemático y astrónomo francés Pierre Bouguer en 1729 Luego por el filósofo y matemático
alemán, Johann Heinrich Lambert en 1760 y por último el físico y matemático también
alemán, August Beer en el año 1852. Se puede decir que esta ley se trata de un medio o
método matemático, el cual es utilizado para expresar de qué modo la materia absorbe la luz.
En óptica (Rama de la física que se encarga del estudio de la luz) La ley de Beer afirma que
la totalidad de luz que emana de una muestra puede disminuir debido a tres fenómenos de la
física, que serían los siguientes:
• El número de materiales de absorción en su trayectoria, lo cual se denomina
concentración.
• Las distancias que la luz debe atravesar a través de las muestra. Denominamos a este
fenómeno, distancia del trayecto óptico.

70
• Las probabilidades que hay de que el fotón de esa amplitud particular de onda pueda
absorberse por el material. Esto es la absorbencia o también coeficiente de extinción.
La relación anterior se puede expresar de la siguiente manera:
𝐴 = −𝜀𝑐𝑑
Donde:
A = Absorbancia
Ɛ = Coeficiente molar de extinción
d = Recorrido (en cm)
c = Concentración molar
A medida que la luz atraviesa un medio que la absorbe, la cantidad de luz absorbida en cualquier
volumen corresponde a la intensidad de luz que incide, luego se multiplica por el coeficiente de
la absorción. Frecuentemente la intensidad de un haz de luz incidente declina significativamente
a medida que pasa a través del medio absorbente. Cuando esta relación se expresa como Ley de
BOUGUERLAMBERT-BEER, tenemos que:
𝑇 = 10−𝜀𝑐𝑑
Donde:
T = Transmitancia
Ɛ = Coeficiente molar de extinción
d = Recorrido (en cm)
c = Concentración molar

71
2.7) Cromo
Elemento químico, símbolo Cr, número atómico 24, peso atómico 51.996; metal que es de color
blanco plateado, duro y quebradizo. Sin embargo, es relativamente suave y dúctil cuando no está
tensionado o cuando está muy puro. Sus principales usos son la producción de aleaciones
anticorrosivas de gran dureza y resistentes al calor y como recubrimiento para galvanizados. El
cromo elemental no se encuentra en la naturaleza. Su mineral más importante por abundancia es
la cromita. Es de interés geoquímico el hecho de que se encuentre 0.47% de Cr2O3 en el basalto
de la Luna, proporción que es de 3-20 veces mayor que el mismo espécimen terrestre.
Existen cuatro isótopos naturales del cromo, 50
Cr, 52
Cr, 53
Cr, 54
Cr, Se han producido diversos
isótopos inestables mediante reacciones radioquímicas. El más importante es el 51
Cr, el cual
emite rayos gamma débiles y tiene un tiempo de vida media aproximadamente de 27 días. El
cromo galvanizado y pulido es de color blanco azuloso brillante. Su poder reflejante es 77% del
de la plata.
Sus propiedades mecánicas, incluyendo su dureza y la resistencia a la tensión, determinan la
capacidad de utilización. El cromo tiene una capacidad relativa baja de forjado, enrollamiento y
propiedades de manejo. Sin embargo, cuando se encuentra absolutamente libre
de oxígeno, hidrógeno, carbono y nitrógeno es muy dúctil y puede ser forjado y manejado. Es
difícil de almacenarlo libre de estos elementos.
El cromo forma tres series de compuestos con otros elementos; éstos se representan en términos
de los óxidos de cromo: cromo con valencia dos, CrO, óxido de Cr(II) u óxido cromoso; con

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