1. ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Técnicas para estudiar las proteínas 2011 1 [email_address]

2. Mecánicos Licuadora Sonicador Prensa francesa Perlas de vidrio Arena de mar Homogenizador

3. Químicos/Termicos Lisis por lisozima Lisis por Detergentes Nitrógeno liquido

4. Masa (m) Densidad de la solución ( p ) Radio del tubo ( r ) Velocidad angular ( w- rad.s -1 ) Volúmen de la partícula (V) (V p )

5. Polysomes Microsomes

6. Cromatografías

9. CM – Carboxi-metil Cromatografía de intercambio catiónico DEAE – Dietil-aminoetil Cromatografía de Intercambio aniónico NaCl Na + Cl - NaCl Na + Cl - - CH 3 - CH 2 - NH + (CH 2 CH 2 ) 2 + - CH 2 - COO -

13. Línea de Origen Placa de Sílica o Celulosa Frente del solvente Cromatografía de capa delgada (TLC)

14. Origen Metionina Isoleucina Leucina Fenilalanina Valina Triptófano Tirosina Serina Alanina Glicina Homocisteína Cisteína

15. 3H 2 O H + C H R COO - H 3 N + + + + + Ninhidrina Aminoácido Pigmento púrpura Ninhidrina C OH O O C C OH C OH O O C C OH CO 2 O C H R + C O O C C= N - C O - O C C

18. DIALISIS . . Eppendorf Membrana

20. Vm = volúmen de la muestra Csm = concentración de sales muestra Vt = volúmen tampón Cst = concentración de sales tampón VT = volúmen total Cs f = concentración de sales finales. Tiempo recomendado de 16 a 24 horas No. de cambios Vs. Tiempo Se trabaja a 4°C (cuarto frío) Manejo: con guantes para evitar contaminación con proteasas, DNAsas, RNAsas (Vm) * ([Csm]) + (Vt) * ([Cst]) VT = ([Cs f ]) Volúmen tampón diálisis Vs. Concentración sales

21. Tto. Urea ó  -ME Diálisis

22. Bradford – A 595 nm 25 – 200  g/ml Prot. Basicas (R) Lowry – A 660 nm 5 – 100  g/ml (Y – W – H) BCA– A 562 nm 10 – 1.200  g/ml 0.5 – 10  g/ml (C – W – Y)

23. (NH 4 ) 2 S 2 O 8 ) Persulfato de Amonio (PA) C 6 H 16 N 2 N`N`N`N`-Tetramethylethylenediamine (TEMED)

25. % Acrilamida Resolución de Separación – kDa. 15 15 a 45 12.5 15 a 60 10 18 a 75 7.5 30 a 120 5 60 a 212 Gradientes 5 - 20 15 - 200 3 - 30 13 - 950

27. Coomassie Brillant Blue. Afinidad por proteínas Básicas: Lys, Arg. AgNO3 Afinidad proteínas ácidas ácido aspártico, ácido glutámico

28. 7.4 21.9 30.2 36.3 52.2 PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PM

29. 21 30 36 52 85 MW 1 2 3 4 5 6 7 1 - 500 ng, 2 - 250 ng, 3 - 125ng, 4 - 62.5ng, 5 - 31.2ng, 6 - 15.6ng y 7 - 7.8ng. Curva BSA (promega)

30. No Proteína No. Proteína 1 Pepsin 10  -amilasa 2 Ovalbumina 11 Nicotinamida deaminasa 3  -amilasa 12  -ureasa 4 Albumina 13 Catalasa 5 Transferrina 14 Xantina oxidasa 6 Ovotransferrina 15 Apoferritina 7 Hexoquinasa 16 Ureasa 8 Lactato deshidrogenasa 17 Ribulosa difosfato carboxilasa 9 Cetona-1-fosfato aldolasa

33. BSA Estandarización Proteínas de Mtb 37 25 15 10 PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 37 25 15 10 PM 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 G1: 19 – 22 kDa G2:23 – 25 kDa G3: 26 – 29 kDa G4: 30-36 kDa

39. Equilibrar las tirillas: Buffer 4X LDS (invitrogen) Incubar con agitación 10 min a T. amb. Condiciones Corrido: Gel 4-12% Bis-Tris (invitrogen) Tiempo Volts. mA Watts 50 – 55 min 200 190 - 170 38 Buffer de corrido: MES-SDS (invitrogen)

40. 75 50 37 25 20 Guanidina-6M: 2D-PAGE– 200  g (10-05-06)

41. Guanidina-6M: 200  g (10-10-06) 2% SDS: 200  g (10-10-06) Triton 4% Fase acuosa: 200  g (10-10-06) Triton 114 4% Fase deterg.: 200  g (10-10-06) 75 50 37 25 20 15 10 100 150 250 75 50 37 25 20 15 10 100 150 250 75 50 37 25 20 15 10 100 150 250 75 50 37 25 20 15 10 100 150 250

42. 1 2 3 4 5 6 + - 0rigen Pozos Proteínas del suero en geles de agarosa

43. 37 49 64 82 115 180 26 19 C/ND LES/ND LES +A/ND C/D LES/D LES +A/D PM Hemoglobina + Igs = 75% - 80%

44. Suero Control Suero LES Suero LES + Anemia

47. 2% SDS: 2D-PAGE– 200  g (10-05-06) 75 50 37 25 20 15 10 100 150 250 10090608 bfrB 10090615 Control 1 HsPx 10090610 phoS1 10090612 Control 2 Ald (Rv2780)

48. Triton 4% Fase acuosa: 2D-PAGE – 200  g (10-05-06) 75 50 37 25 20 15 10 100 150 250 1010060301 rpmC 10090616 Control 1 HsPx 1010060313 ppiA (19 kDa) + rplF (19 kDa) 1010060306 lsr2 1010060309 rplT (15 kDa) + rplR (13 kDa) 1010060311 Possible HsPx 1010060303 HP: Rv1738 10090613 Control 2 Ald (Rv2780)

49. Toma de la muestra Se corta la punta Servilleta Blanca Vidrio Gel Eliminar todo el liquido tomado con la muestra

50. Auto-sampler Capillary-HPLC ES-Ion Trap-MS

51. Sheath Gas LC Flow Auxiliary Gas ESI Needle Heated Capillary Tube Lens Octapole Endcap Ring Electrode Conversion Dynode Electron Multiplier Workings of the Electrospray-Ion Trap Mass Spectrometer

54. Cátodo ( -) Anodo (+) Papel de filtro (3M) Gel Membrana de nitrocelulosa

57. Inmunotransferencia Proteínas transferidas 1 er . Ac. 2 do . Ac. Unido a la enzima Revelado

60. ANTICUERPOS MONOCLONALES????

61. Monoclonales VS Policlonales

62. Balb/c

63. Epitopes Lineales Conformacionales De NOVO

64. Día= -30 -15 -3 -2 -1 0 -45 Ag + ACF Ag + AIF Ag

68. Desarrollos Biotecnológicos

71. Quimérico FC humano/ Fab murino ximab

72. Anticuerpo humanizado FC humano/ Fab Humano-murino zumab

74. Humano 100% humano umab

75. Factores variables de cadena simple ScFv

76. Anticuerpos humanizados

78. Proteína de fusión FC Ig/Receptor de una proteína humana cept

79. Proteínas de Fusión con el Fc

81. Proteínas de Fusión con el Fc Aislamiento y marcaje para su Identificación

82. To be or not to be?

84. Anticuerpos específicos

85. Inhibidores TNF  Proteína de fusión dimérica  Ligando de la porción extracelular de TNF p75  Fracción Fc de la IgG1 Ac monoclonal quimérico 75% / 25%

87. Von Behring Kitasato Antitoxina del tetano ( 1890 ) Descubrieron que al inyectar el suero sanguíneo de un animal afectado por el tétanos a otro, se genera inmunidad a la enfermedad en el segundo. En 1891 trataron con suero a una niña enferma de difteria salvando su vida. Esto le hizo sospechar a Behring la existencia de unas sustancias (que llamó antitoxinas) que eliminaban las toxinas segregadas por las bacterias lo que supuso un gran avance en el conocimiento de las defensas corporales. Por este trabajo obtuvo el primer Premio Novel de fisiología y Medicina en 1901 .

88. Niels K. Jerne Georges Kohler Cesar Milstein N. K. Jerne junto con César Milstein y Georges J.F. Kohler obtuvieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en el año 1984 , por sus teorías sobre la especificidad en el desarrollo y control de los sistemas inmunitarios y por el descubrimiento del principio activo de la producción de ANTICUERPOS MONOCLONALES

89. Gerald Maurice Edelman ''Por sus descubrimientos de la estructura química de los anticuerpos" ( compartido con Rodney Robert Porter ) Premio Novel Medicina 1972 "Por su descubrimiento del principio genético para la generación de la diversidad en los anticuerpos“ premio Nobel de Medicina y Fisiología en 1987 Gerald Maurice Edelman Susumu Tonegawa RodneyRobert Porter