El documento describe los principios básicos de la microscopía electrónica, comparando la microscopía óptica de luz con la microscopía electrónica. Explica que la microscopía electrónica usa un haz de electrones en lugar de luz visible, lo que permite una mayor resolución para observar detalles a nivel atómico. También describe los componentes básicos y principios de funcionamiento del microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido, y cómo cada uno puede usarse para estudiar diferentes caracter

1. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA UNIDAD 3<br />INTRODUCCION<br />Un microscopio es, básicamente, un sistema óptico que transforma un objeto en una imagen, la cual amplifica (magnifica) detalles característicos del objeto.<br />Con el microscopio de luz se resuelven detalles del orden del micrón, mientras que con el microscopio electrónico se alcanzan a resolver objetos del orden de los angstrom.<br />En el microscopio electrónico, un haz de electrones incide sobre una muestra y de la interacción de estos electrones con los átomos de la misma, surgen señales que son captadas por algún detector o bien, proyectadas directamente sobre una pantalla.<br />Dentro de la familia de microscopios electrónicos, se encuentran el microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM). Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes características de una muestra. El SEM provee información sobre morfología y características de la superficie, mientras que con el TEM podemos observar la estructura interna y detalles ultraestructurales.<br />Un gran avance se ha alcanzado con la incorporación de técnicas de procesamiento de imágenes para revelar detalles específicos de interés, algunos de ellos ligados a la ultraestructura de la muestra.<br />COMPARACION ENTRE MICROSCOPIOS DE LUZ Y ELECTRONICO<br />Los microscopios de luz y electrónico son esencialmente, idénticos. Tanto uno como otro nos permiten amplificar aquellos objetos que son indistinguibles a nuestro ojo. La diferencia fundamental entre los dos es la fuente de iluminación. Mientras el microscopio de luz utiliza un haz de luz en el rango de las longitudes de onda del visible, el microscopio electrónico emplea un haz de electrones de muy corta longitud de onda que permite obtener una mayor resolución.<br />Una tabla comparativa, entre ambos microscopios se muestra a continuación. Cabe destacar que la misma, involucra características generales de los microscopios electrónicos y no considera las diferencias particulares entre TEM y SEM.<br /> MICROSCOPIODE LUZMICROSCOPIOELECTRONICOIluminaciónHaz de luzHaz de electronesLongitud de onda2000 Å - 7500 Å0.037 Å - 0.086 ÅLentesVidrioElectromagnéticasMedioAtmósferaVacíoResolución2000 Å3 ÅMagnificación10 x - 2000 x100 x - 450000 xFocalizaciónMecánicaEléctricaContrasteAbsorción - ReflexiónScattering<br />RESOLUCION<br />El concepto de resolución está relacionado con la capacidad de distinguir detalles finos en una imagen. En otras palabras, es la distancia mínima r1 a la cual podemos distinguir, claramente, dos puntos como entidades separadas.<br />La resolución teórica del microscopio electrónico es:<br />Para valores de l = 0.037 Å y a = 0.1 radianes, la resolución nominal es 0.2 Å.<br />NATURALEZA DE LAS ONDAS DE ELECTRONES<br />De Broglie mostró que una partícula moviéndose a una velocidad cercana a la de la luz tenía una forma de radiación asociada con ella. Esta relación está expresada por:<br />donde l es la longitud de onda, h la costante de Plank, m la masa de la partícula y v su velocidad.<br />Si la partícula es un electrón y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, l = 0.05 A. que es 100.000 veces más corta que la luz verde. Por lo tanto, la resolución de un microscopio que emplee este tipo de radiación será mucho mejor que la de un microscopio de luz.<br />La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difícil de entender en términos de la física clásica y su descripción se hace mediante la mecánica cuántica.<br />Las ondas de electrones se pueden pensar como un quantum o paquete de radiación que acompaña a cada electrón en su trayectoria, es parte de él y permanece con él. Las características de estas ondas dependen de la posición exacta de un dado electrón en el espacio y en el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de encontrar al electrón en esa posición.<br />Las ondas de electrones no deben confundirse con radiación electromagnética, como la que se produce cuando un haz electrónico interactúa con la materia, pierde energía y produce una radiación cuya longitud de onda pertenece al espectro electromagnético.<br />MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION<br />EL INSTRUMENTO<br />El sistema óptico-electrónico del microscopio electrónico de transmisión está constituído por las siguientes partes:<br />Cañón de electrones<br />Sistema de lentes<br />Pantalla fluorescente<br />Estos componentes están ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en alto vacío.<br />El cañón de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se encuentra ubicado en la parte superior de la columna. Está constituído por un filamento (cátodo), un cilindro con una apertura central, llamado cilindro de Wehnelt que rodea al filamento y tiene un potencial ligeramente más negativo que éste. El ánodo se encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt.<br />El filamento es calentado por el pasaje de corriente (alrededor de 2800 K). Los electrones emitidos termoiónicamente por el cátodo son acelerados hacia el ánodo, pasan por la apertura circular central de éste y un haz de alta energía es emitido hacia la columna del microscopio. <br />El sistema de lentes está formado por lentes condensadores objetivo, intermedia y proyectora. Las lentes condensadoras, en los microscopios, más modernos son dos. La primera, proyecta la imagen punto de entrecruzamiento demagnificada (spot size), mientras que la segunda controla su diámetro y el ángulo de convergencia en que incide sobre la muestra. limita al haz que incide sobre la muestra.<br />La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del especímen. Es considerada el componente más importante del microscopio electrónico. Cualquier defecto en ésta, será magnificado y transmitido al resto del sistema óptico. Por lo tanto, de ella dependen, en gran medida, la resolución final y la corrección de las aberraciones.<br />Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla fluorescente.<br />La pantalla del microscopio electrónico de transmisión está recubierta por una pintura de fluoruros de Zn y Cd, que fluoresce cuando es bombardeada por electrones, generando una imagen en el rango de las longitudes de onda del visible.<br />Mediante el microscopio electrónico de transmisión podemos estudiar la ultraestruacura de un material orgánico oinorgánico. Para esto, existen diferentes formas de operación que posibilitan el estudio de una característica en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de materiales no- biológicos y biológicos podemos nombrar :<br />Determinación de estructura cristalina en minerales, metales, etc.<br />Estudio de catalizadores.<br />Determinación de impurezas, precipitados,etc.<br />Identificación de bordes de grano e interfaces en metales.<br />Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.<br />Determinación de tamaño de partícula en catalizadores, minerales,etc.<br />Identificación de planos cristalinos.<br />Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos térmicos.<br />Realización de estudios de histoquímica para identificxar compuestos específicos.<br />Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales.<br />Reconocimiento de virus.<br />Estudios de citoquímica.<br />Estudios de estructuras moleculares.<br />MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM).<br />El microscopio electrónico de barrido (SEM) es similar al microscopio electrónico de transmisión. Ambos tienen ciertas características comunes tales como un cañón de electrones donde se genera el haz de electrones, lentes condensadoras y objetivo, sistema de vacío. La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman y magnifican la imagen. Esto hace que la información que se obtenga de cada uno sea distinta. Mientras el TEM permite el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el SEM posibilita conocer la morfología superficial.<br />En el microscopio electrónico de barrido, el haz electrónico, atraviesa la columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz , de manera que barra la muestra punto a punto. De la interacción entre los electrones incidentes con los átomos que componen la muestra se generan señales, las cuales pueden ser captadas con detectores adecuados para cada una de ellas. El detector capta una señal y las convierte en una señal electrónica que es proyectada en un tubo de rayos catódicos (CRT).<br />El barrido del haz está sincronizado con el barrido del CRT y produce una relación uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT.<br />Un esquema del SEM se muestra en la siguiente figura.<br />Mediante el SEM se estudian:<br />Morfología superficial de minerales, catalizadores, etc.<br />Electrodepósitos<br />Adherencia fibra-matríz en polímeros.<br />Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.<br />Formas de cristalización de minerales.<br />Control de calidad de catalizadores industriales.<br />Morfología superficial interna de partículas poliméricas.<br />Morfología de tejidos u órgano animales y vegetales.<br />Estudio de moléculas<br />Reconocimiento de fósiles.<br />INTERACCION HAZ INCIDENTE - MUESTRA EN EL SEM.<br />Naturaleza de la interacción: Cuando el haz de electrones choca contra la muestra, ocurren interacciones entre dichos electrones y los átomos que componen la muestra. De allí surgen señales tales como: electrones secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x característicos, electrones Auger, catodoluminiscencia. Todas estas señales se producen simultáneamente pero cada una de ellas son captadas por detectores diferentes.<br />Uno de los detectores más comunes es el de electrones secundarios. Los mismos son emitidos desde la muestra como consecuencia de las ionizaciones surgidas de las interacciones inelásticas. Por esta razón, poseen baja energía (50 ev). Ellos brindan una imagen de la morfología superficial de la muestra.<br />UNIDADES DE MEDIDA EN MICROSCOPIA<br />La unidad que se usa en microscopía de luz es el micrón (µ) que es la milésima parte del milímetro.<br />En microscopía electrónica la unidad más conocida es el angstrom (Å), definido como la diez millonésima parte del milímetro. También se emplea el nanometro (nm), que es la millonésima parte del micrón.<br />1 mm = 103 µ = 106 nm = 107 Å<br />Así, por ejemplo, la resolución de un microscopio de luz es 0.25 µ ó 2500 Å ; y la de un microscopio electrónico de 2.5 Å<br />PEQUEÑA GALERÍA DE IMÁGENES DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA<br />Detalle de epidermis de semilla de justicia. Fotografia tomada con el microscopio electrónico de barrido. (1cm=10 micras)<br />Micrografía electrónica de Transmisión de un polímero. (1cm=0.2 micras)<br />Vista general de un piojo (20X).(1cm=300 micras)<br />Detalle de ala de mariposa (220X). (1cm=30 micras)<br />Detalle de bacterias (bacilos) a 10000X. Las bacterias miden aproximadamente una micra.<br />Detalle de fibras de algodón (600X). (1cm= 10 micras)<br />CRIOFRACTURA<br />En la imagen inferior tienes dos células vistas con el microscopio electrónico con técnicas de transmisión (izquierda) y de criofractura (derecha). Aunque juntas, cada una de estas células posee una individualidad y esa cualidad se la proporciona la membrana plasmática.<br />En la imagen izda. hemos ampliado la zona de contacto entre dos células (1 y 2). Cada célula presenta una limitante que es la membrana plasmática (Flechas rojas) y entre las dos células hay un espacio intercelular (Ei)La membrana plasmática aparece como una estructura trilaminar (dos bandas más oscuras en los extremos y una banda más clara en el centro), pero esto es solo un efecto de la tinción que usamos para poder ver las estructuras celulares al microscopio electrónico<br />La ESTRUCTURA de la MEMBRANA PLASMÁTICA OBSERVADA por CRIOFRACTURA APOYA la HIPÓTESIS de MOSAICO FLUIDOA la izquierda se muestra una imagen parcial de una célula vista por criofractura, en la imagen vemos la membrana (m), el citoplasma (c) y el núcleo (n). A la derecha se muestra una ampliación de la membrana plasmática, esta imagen sugiere que las proteínas de membrana -que se observan como granos- se hayan integradas en una superficie constituida por fosfolípidos.<br />La MEMBRANA MANTIENE la RELACIÓN ENTRE la CÉLULA y el EXTERIOR<br />La membrana plasmática es el componente que establece la comunicación entre la célula y el entorno. En la membrana se realiza un transporte de moléculas en dos direcciones: de la célula al exterior y viceversa.Los únicos mecanismos de transporte que pueden observarse al microscopio electrónico son los de la endocitosis y la exocitosis. La endocitosis es el mecanismo de formación de vesículas en la membrana plasmática que se cargan con un contenido extracelular; la exocitosis es el proceso por el que las vesículas formadas en la célula se fusionan con la membrana plasmática y descargan su contenido al exterior.Esos dos procesos distintos muestran, sin embargo, la misma imagen al microscopio electrónico (abajo). Las vesículas se fusionan con la membrana plasmática (Mp) o se forman en ella y este proceso no se distingue morfológicamente. Observa abajo como las vesículas (izda, flechas rojas) se localizan en la membrana plasmática y como el proceso se observa en criofractura como sacos asociados a la membrana (dcha, flechas rojas).<br />SUPERFICIE CELULARUsualmente la superficie celular no es lisa, como lo es la superficie de un globo inflado. Por el contrario puede presentar prolongaciones, algunas hasta 1 m de largo como es el caso de los axones de las neuronas.Las microvellosidades (abajo, izda.) son pequeñas prolongaciones que aumentan la superficie de contacto de la célula con el medio exterior. Son habituales en células que limitan las cavidades de los organismos pluricelulares. Los cilios (derecha) son prolongaciones capaces de generar un movimiento sobre el medio extracelular líquido, para ello cuentan con un sistema de proteínas que forman parte del citoesqueleto.<br />UNIONESLas células de los organismos pluricelulares establecen contactos entre si. Estas uniones son importantes durante la formación del organismo pluricelular, para la coordinación de las células que lo componen y para la funcionalidad y la cohesión de las células que forman los tejidos. Estudiaremos las uniones en el curso, pero aquí tienes algunas de estas uniones tal y como se observan en microscopía<br />GAP o NEXOUNIÓN OCLUYENTEUNIÓN ADHERENTE<br />Bibliografía:<br />http://www2.uah.es/biologia_celular/LaCelula/Celula2MP.html<br />file:///C:/Users/casa/Downloads/Microscopia%20electronica.htm<br />eltamiz.com<br />http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo7_2.htm<br />