Este documento describe dos técnicas espectroscópicas, la espectroscopía de absorción UV-visible y la espectroscopía de fluorescencia. La espectroscopía de absorción UV-visible mide la absorción de radiación electromagnética por moléculas y puede usarse para identificar compuestos químicos. La espectroscopía de fluorescencia involucra la emisión de luz visible por moléculas excitadas con luz UV y puede usarse para cuantificar compuestos y determinar estructuras proteicas

1. Espectroscopía de absorción
UV - visible.
Mariette Viladomat Jasso

2. ¿Qué es?
Método cualitativo/cuantitativo
de medición que utiliza
radiación electromagnética
(de la región visible, UV e
infrarroja del espectro 
380-780nm). La radiación de
esta región del espectro,
absorbida por las moléculas,
provoca transiciones
electrónicas que pueden ser
cuantificadas.

4. Espectro Electromagnético Transición Cuántica
Vibraciones de las moléculas.
Niveles de energía de los e- de
valencia.
Niveles de energía de los e-
interiores.
Rotaciones de las moléculas.

5. Color por Transmisión.

6. <Lámpara de deuterio>
<Monocromador>
-Prisma
-Red de
<Sist. Óptico>
<Divisor>
<Blanco>
<Disolución problema>

7. Ley de Beer-Lambert:
Transmitancia:
T = I / Io
Absorbancia:
A = ε bc
ε – coeficiente de absortividad molar del
medio
b – distancia óptica o camino óptico
(lo ideal es hacer una constante, usando
cubetas de un tamaño estándar)
c – concentración molar
I - intensidad producto
Io – intensidad inicial

8. Resultado
Cualitativo.- Estructuras Químicas
Cuantitativo.- Concentración (curva estándar)
• Mayor concentración / Mayor camino
óptico  Mayor absorción
• Estructuras químicas específicas  λ absorbida (Dobles enlaces, luz visible)
β-carotenos

9. Espectroscopía de Fluorescencia
y Dicroísmo Circular
Manuel García Ulloa Gámiz

10. Espectroscopía de
Fluorescencia

11. Principio Físico.
Luz UV
Luz visible

12. Moléculas que emiten fluorescencia al
exponerse a la luz UV
• Aminoácidos aromáticos:
– Triptofano (abs: 280 nm, emisión:
300 to 350 nm dependiendo de la
polaridad del medio ambiente).
– Fenilalanina.
– Tirosina.
• GFP.
• Fluoróforos.

13. Mecanismo.
*El detector puede ser:
•PMT (Photomutiplier).
•Photodiode.
•CCD (Charge-Coupled Device).
*Los filtros varían
dependiendo de la
longitud de onda que
se quiera obtener.
90º
monocromadores
UV
Se utilizan
recipientes de
cuarzo para
dejar pasar la
fulorescencia.
+ +

14. Aplicaciones en Biología Molecular
• Determinación de la presencia de
compuestos orgánicos: casi siempre
a través de los aa’s aromáticos.
• Conocer concentración de
determinado compuesto en una
muestra: intensidad de fluorescencia
emitida.
• Determinar estructuras secundarias
en proteínas: uso de aa’s aromáticos
cuya fuorescencia varía
dependiendo de su entorno
molecular (si está en una zona
hidrofóbica, hidrofílica, si es parte de
una alfa-hélice, etc.) = quenching.

15. Dicroísmo Circular

16. Principio Físico (luz linealmente
polarizada)
1.-
3.-
2.-

17. Luz polarizada

18. Principio Físico
(luz circularmente polarizada)
1.-
2.-
3.-

19. (A) Se representan los vectores de los componentes del haz antes de llegar a la
muestra. (B) Esos mismos vectores después de interactuar con los solutos de la
muestra, fuera de fase. (C) Los mismos vectores cuando son absortos en forma
diferencial.
Dicroísmo circular: rotación del plano lumínico debido a
la diferente absorción de los componentes circularmente polarizados
por una muestra dada.

20. 90º
Mecanismo
La luz pasa por un filtro del cual
únicamente sale la que se encuentra
orientada en determinada dirección.
Ésta es circularizada y choca con la
muestra. Los datos son arrojados al
final mediante el análisis de la luz
saliente (pasa de circular a elíptica).
UV

21. Aplicaciones en Biología Molecular
• Determinación de estructuras
secundarias y terciarias en
proteínas: estructuras como la
alfa hélice, la beta plegada y
los giros, imparten
determinado dicroísmo circular
al péptido, haciéndolas
reconocibles. *Se usan aa’s
aromáticos debido a que su
CD varía dependiendo de su
entorno aminoacídico.
• Determinación de orientación
estructural en moléculas:
dependiendo de la forma de
luz colectada al final, la
orientación (levógira o
dextrógira) de una molécula.

22. • Estimar % de estructura
secundaria: fracción de la
proteína como α-hélice, β
plegada, giro u otra.
• Comprobar su hubieron
cambios en estructura
secundaria: al exponer a alta
temperatura o agentes
desnaturalizantes, por ejemplo.
• Verificar si la proteína está en
su conformación nativa: para
comprobar efectos del pH,
sales, solventes, temperatura,
etc.

23. Bibliografía
• Espectroscopía de fluorescencia:
– http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_spectroscopy
– http://www.oswego.edu/~kadima/CHE425/CHE425L/FLUORES
CENCE_SPECTROSCOPY_08.pdf
– http://www.chimica.unipd.it/camilla.ferrante/pubblica/files/Electro
nicEmission2011.pdf
• Dicroísmo Circular
– http://en.wikipedia.org/wiki/Circular_dichroism
– http://www.mscwu.wur.nl/NR/rdonlyres/256B4909-D151-45EF-
BA90-47A81D1F17A0/57402/Kelly2005.pdf
– http://web.usal.es/~jmcsil/biblioteca/biofisica/unizar/CDIRl.pdf
– http://docencia.izt.uam.mx/docencia/alva/Dicroismo.htm