El documento habla sobre la validación de métodos analíticos en laboratorios de análisis de alimentos. Explica que los laboratorios deben trabajar bajo normas como ISO/IEC 17025 para generar resultados confiables. También menciona a EURACHEM, que provee guías sobre validación de métodos y buenas prácticas. Finalmente, resume los principales aspectos que deben considerarse para la validación de métodos como la exactitud, rango, incertidumbre y sensibilidad.

1. ANÁLISIS DE ALIMENTOS
VALIDACIÓN DE MÉTODOS
ANALÍTICOS
Dra. Roxana Verdini
rverdini@fbioyf.unr.edu.ar
2022

2. CALIDAD EN EL LABORATORIO DE
ANÁLISIS DE ALIMENTOS
Los laboratorios de análisis instrumental de
alimentos, propiedades físicas y microbiología
pueden prestar servicios a clientes internos y externos
de análisis fisicoquímico y microbiológico para muestras
de alimentos.
Acorde a la política de calidad, los laboratorios de
análisis deben trabajar con el objetivo de generar y
garantizar resultados confiables.

3. CALIDAD EN EL LABORATORIO DE
ANÁLISIS DE ALIMENTOS
El trabajo realizado en los laboratorios bajo los
lineamientos establecidos en la norma ISO/IEC
17025:2005, (NORMA ARGENTINA IRAM 301*
ISO/IEC 17025) garantiza el mejoramiento continuo,
para el logro de la eficacia y eficiencia en los objetivos
del Sistema de Gestión de Calidad.
También EURACHEM que es una red de organizaciones
en Europa, que tiene el objetivo de establecer un
sistema de trazabilidad internacional de las
mediciones químicas y la promoción de buenas prácticas
de calidad, proporciona una Guía de Laboratorio para
la Validación de Métodos y Temas Relacionados.

4. EURACHEM
Proporciona un foro para la discusión de los
problemas comunes y para el desarrollo de un enfoque
informado y considerado que considera cuestiones
técnicas y políticas de decisión.
Promueve las mejores prácticas en la medición
analítica mediante la producción de una guía autorizada
dentro de sus grupos de expertos, guías de publicación
en la web y el apoyo a talleres para comunicar las
buenas prácticas.

5. EURACHEM
La orientación incluye cuestiones técnicas como la
evaluación de la incertidumbre de medición, validación
de métodos y ensayos de aptitud .
También trabaja a través del enlace con los organismos
de acreditación y otras organizaciones con intereses en
la calidad de la medición para ayudar a asegurar
políticas prácticas de acreditación y promoción de las
provisiones técnicas sensibles en la regulación.

6. IRAM 301* ISO/IEC 17025
Esta norma establece los requisitos generales para la
competencia en la realización de ensayos o de
calibraciones, incluido el muestreo.
Cubre los ensayos y las calibraciones que se realizan
utilizando:
métodos normalizados,
métodos no normalizados,
métodos desarrollados por el propio laboratorio.

7. IRAM 301* ISO/IEC 17025
Organización
Sistema de gestión
Control de los documentos
Revisión de los pedidos, ofertas y contratos
Subcontratación de ensayos y de calibraciones
Compras de servicios y de suministros
Servicio al cliente
Control de trabajos de ensayos o de calibraciones no conformes
Mejora
Acciones correctivas
Acciones preventivas
Control de los registros
Auditorías internas
Revisiones por la dirección

8. ORGANIZACIÓN
Debe ser una entidad con responsabilidad legal y tener una
dirección técnica con responsabilidad total ...
Debe realizar sus actividades de ensayo y de calibración de modo
que se cumplan los requisitos de esta norma ...
Debe tener personal que tenga los recursos necesarios para
desempeñar sus tareas ...
Debe tomar medidas para asegurarse de que su personal están
libres de cualquier presión o influencia indebida ...
Debe tener políticas y procedimientos para asegurar la protección
de la información confidencial y los derechos de propiedad de sus
clientes ...
Debe proveer adecuada supervisión al personal encargado de los
ensayos y calibraciones ...

9. SISTEMA DE GESTIÓN
Debe establecer, implementar y mantener un
sistema de gestión apropiado al alcance de sus
actividades.
Debe documentar sus políticas, sistemas,
programas, procedimientos e instrucciones tanto
como sea necesario para asegurar la calidad de
los resultados de los ensayos o calibraciones.
La documentación del sistema debe ser
comunicada al personal pertinente, debe ser
comprendida por él, debe estar a su disposición y
debe ser implementada por él.

10. SUBCONTRATACIÓN DE ENSAYOS Y DE
CALIBRACIONES
Cuando un laboratorio subcontrate
un trabajo, se debe encargar este
trabajo a un subcontratista
competente
Un subcontratista competente es el
que, por ejemplo, cumple esta
norma para el trabajo en cuestión

11. COMPRAS DE SERVICIOS Y DE
SUMINISTROS
Deben existir procedimientos para la
compra, la recepción y el
almacenamiento de los reactivos y
materiales consumibles de
laboratorio que se necesiten para los
ensayos y las calibraciones
El laboratorio debe asegurarse de que los
suministros, los reactivos y los materiales
consumibles comprados, que afectan a la
calidad de los ensayos o de las
calibraciones, no sean utilizados hasta que
no hayan sido inspeccionados…

12. SERVICIO AL CLIENTE
El laboratorio debe estar dispuesto a cooperar con los
clientes o sus representantes para aclarar el pedido del
cliente y para realizar el seguimiento del desempeño del
laboratorio en relación con el trabajo realizado siempre que el
laboratorio garantice la confidencialidad hacia otros clientes
Los clientes valoran el mantenimiento de una buena
comunicación, el asesoramiento y los consejos de orden
técnico, así como las opiniones e interpretaciones basadas en
los resultados
El laboratorio debe procurar obtener información de retorno,
tanto positiva como negativa, de sus clientes
La información de retorno debe utilizarse y analizarse para
mejora rel sistema de gestión, las actividades de ensayo y
calibración y el servicio al cliente

13. QUEJAS
El laboratorio debe tener una
política y un procedimiento para
la resolución de las quejas
recibidas de los clientes o de
otras partes.
Se deben mantener los registros
de todas las quejas así como de
las investigaciones y de las
acciones correctivas llevadas a
cabo por el laboratorio

14. CONTROL DE TRABAJOS DE ENSAYOS
O DE CALIBRACIONES NO
CONFORMES
El laboratorio debe tener una política y
procedimientos que se deben implementar cuando
cualquier aspecto de su trabajo de ensayo o de
calibración, o el resultado de dichos trabajos, no
son conformes con sus propios procedimientos o
con los requisitos acordados con el cliente
Cuando la evaluación indique que el trabajo no
conforme podría volver a ocurrir o existan dudas
sobre el cumplimiento de las operaciones del
laboratorio con sus propias políticas y
procedimientos, se deben seguir rápidamente los
procedimientos de acciones correctivas

15. ¿CÓMO IDENTIFICAR
TRABAJOS NO
CONFORMES O
PROBLEMAS?
las quejas de
los clientes
el control de la
calidad
la calibración de
instrumentos
el control de los
materiales
consumibles
la observación o
la supervisión
del personal
el control de los
informes de
ensayo y
certificados de
calibración
las revisiones
por la dirección
las auditorías
internas o
externas

16. ACCIONES CORRECTIVAS
Cuando se necesite una acción correctiva, el laboratorio
debe identificar las acciones correctivas posibles
Debe seleccionar e implementar la o las acciones con
mayor posibilidad de eliminar el problema y prevenir su
repetición
Las acciones correctivas deben corresponder en
importancia a la magnitud del problema y sus riesgos
El laboratorio debe documentar e implementar cualquier
cambio necesario que resulte de las investigaciones de
las acciones correctivas.

17. AUDITORÍAS INTERNAS
El laboratorio debe efectuar,
periódicamente, de acuerdo con un
calendario y un procedimiento
predeterminados, auditorías internas de
sus actividades para verificar que sus
operaciones continúan cumpliendo los
requisitos del sistema de gestión y de esta
norma.
El programa de auditoría interna debe
considerar todos los elementos del sistema
de gestión, incluidas las actividades de
ensayo y calibración

18. EXACTITUD Y CONFIABILIDAD DE LOS
ENSAYOS O DE LAS CALIBRACIONES
Intervienen factores:
humanos,
instalaciones y condiciones ambientales.
El grado con el que los factores contribuyen a la
incertidumbre total de la medición difiere
considerablemente según los ensayos y calibraciones.
El laboratorio debe tener en cuenta estos factores al
desarrollar los métodos y procedimientos de ensayo y de
calibración, en la capacitación y la calificación del
personal, así como en la selección y la calibración de los
equipos utilizados.

19. PERSONAL
La dirección del laboratorio debe asegurar la
competencia de todos los que operan equipos
específicos, realizan ensayos o calibraciones,
evalúan los resultados y firman los informes de
ensayos y los certificados de calibración.
Cuando emplea personal en formación, debe
proveer una supervisión apropiada.
El personal que realiza tareas específicas debe
estar calificado sobre la base de una educación,
una capacitación, una experiencia apropiadas y de
habilidades demostradas, según sea requerido.

20. INSTALACIONES Y CONDICIONES
AMBIENTALES
Las instalaciones de ensayos o de calibraciones del
laboratorio, incluidas, pero no en forma excluyente, las
fuentes de energía, la iluminación y las condiciones
ambientales, deben facilitar la realización correcta de
los ensayos o de las calibraciones.
El laboratorio debe asegurarse de que las condiciones
ambientales no invaliden los resultados ni
comprometan la calidad requerida de las
mediciones.
Se deben tomar precauciones especiales cuando el
muestreo y los ensayos o las calibraciones se
realicen en sitios distintos de la instalación
permanente del laboratorio.

21. INSTALACIONES Y CONDICIONES
AMBIENTALES
Debe haber una separación eficaz entre áreas vecinas
en las que se realicen actividades incompatibles.
Se deben tomar medidas para prevenir la
contaminación cruzada.
Se deben controlar el acceso y el uso de las áreas que
afectan a la calidad de los ensayos o de las
calibraciones.
El laboratorio debe determinar la extensión del control en
función de sus circunstancias particulares.
Se deben tomar medidas para asegurar el orden y la
limpieza del laboratorio.
Cuando sean necesarios se deben preparar
procedimientos especiales.

22. ¿QUÉ MÉTODOS USAR?
El laboratorio debe utilizar los métodos de ensayo o de
calibración, incluidos los de muestreo, que satisfagan
las necesidades del cliente y que sean apropiados
para los ensayos o las calibraciones que realiza.
Se deben utilizar preferentemente los métodos
publicados como normas internacionales, regionales o
nacionales.
El laboratorio debe asegurarse de que utiliza la última
versión vigente de la norma, a menos que no sea
apropiado o posible.
Cuando sea necesario, la norma debe ser
complementada con detalles adicionales para asegurar
una aplicación coherente.

23. ¿QUÉ MÉTODOS USAR?
El cliente debe ser informado del método elegido.
El laboratorio debe confirmar que puede aplicar
correctamente los métodos normalizados antes de
utilizarlos para los ensayos o las calibraciones.
Si el método normalizado cambia, se debe repetir la
confirmación.
También se pueden utilizar los métodos
desarrollados por el laboratorio si son apropiados
para el uso previsto y si han sido validados.

24. ¿SE PUEDEN APLICAR MÉTODOS
DESARROLADOS EN EL
LABORATORIO?
La introducción de los métodos de ensayo y de
calibración desarrollados por el laboratorio para su
propio uso debe ser una actividad planificada y debe ser
asignada a personal calificado, provisto de los recursos
adecuados
Cuando sea necesario utilizar métodos no normalizados,
éstos deben ser acordados con el cliente y deben incluir
una especificación clara de los requisitos del cliente y del
objetivo del ensayo o de la calibración.
Los métodos desarrollados debe haber sido
validados adecuadamente antes del uso.

25. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
Una identificación apropiada
El alcance
La descripción del tipo de ítem a ensayar o a calibrar
Los parámetros o las magnitudes y los rangos a ser determinados
Los aparatos y equipos, incluidos los requisitos técnicos de
funcionamiento
Los patrones de referencia y los materiales de referencia requeridos
Las condiciones ambientales requeridas y cualquier período de
estabilización que sea necesario
La descripción del procedimiento

26. MEDICIONES ANALÍTICAS
La EURACHEM resume en seis principios la buena
práctica de laboratorio en las mediciones analíticas
Las mediciones analíticas deben realizarse para
satisfacer un requisito acordado (es decir, con
un objetivo definido).
Las mediciones analíticas deben realizarse
utilizando métodos y equipos que han sido
probados para asegurar que son adecuados a
su propósito.
El personal que realiza las mediciones analíticas
debe ser calificado y competente para
emprender la tarea asignada” (y demostrar que
pueden desempeñar el análisis apropiadamente).

27. MEDICIONES ANALÍTICAS
La EURACHEM resume en seis principios la buena
práctica de laboratorio en las mediciones analíticas
Deberá existir una evaluación periódica e
independiente del desempeño técnico de un
laboratorio.
Las mediciones analíticas hechas en un
laboratorio deben ser consistentes con
aquéllas que se realicen en cualquier otro
laboratorio.
Las organizaciones que hacen mediciones
analíticas deben tener procedimientos bien
definidos de control y de aseguramiento de
calidad.

28. VALIDACIÓN
La ISO define a la validación como la confirmación, a
través del examen y el aporte de evidencias
objetivas, de que se cumplen los requisitos
particulares para un uso específico previsto.
El laboratorio debe validar los métodos no normalizados,
los métodos que diseña o desarrolla, los métodos
normalizados empleados fuera del alcance previsto, así
como las ampliaciones y modificaciones de los métodos
normalizados, para confirmar que los métodos son aptos
para el fin previsto.
La validación debe ser tan amplia como sea necesario
para satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o
del campo de aplicación dados.

29. VALIDACIÓN
Es conveniente utilizar una o varias de las técnicas
siguientes para la determinación del desempeño de un
método:
calibración utilizando patrones de referencia o
materiales de referencia,
comparación con resultados obtenidos con otros
métodos,
comparaciones interlaboratorios,
evaluación sistemática de los factores que influyen
en el resultado,
evaluación de la incertidumbre de los resultados
basada en el conocimiento científico de los principios
teóricos del método y en la experiencia práctica.

30. VALIDACIÓN
La gama y la exactitud de los valores que se obtienen
empleando métodos validados tal como fueron fijadas
para el uso previsto, deben responder a las necesidades
de los clientes.
incertidumbre de los resultados
límite de detección
selectividad del método
linealidad
repetibilidad o de reproducibilidad
robustez ante influencias externas
sensibilidad cruzada frente a las interferencias provenientes de la
matriz de la muestra o del objeto de ensayo

31. VALIDACIÓN – Enfoque de la
EURACHEM
La existencia de métodos analíticos confiables para la
realización de ensayos de laboratorio es indispensable para el
control de calidad e inocuidad de los alimentos.
La confiabilidad de un método se determina mediante
procesos de validación.
La validación de un método es un requisito importante en la
práctica del análisis químico.
Hay varias preguntas:
porqué debe hacerse?
cuándo debe hacerse?
que necesita hacerse?

32. VALIDACIÓN - Enfoque de la
EURACHEM
Algunos analistas ven la validación de métodos como algo que
sólo puede hacerse en colaboración con otros laboratorios y
por consiguiente no la realizan.
Por ejemplo la comisión del Codex Alimentarius requiere
para que un método sea incluido ciertos datos sobre la
perfomance del mismo tales como: especificidad, exactitud,
precisión (repetitividad, reproducibilidad), límite de detección,
sensibilidad, aplicabilidad, practicidad, etc.
Este proceso de validación requiere extensos estudios
colaborativos.
Estos procesos de validación son muy complejos y pueden
requerir el análisis de 5 o más muestras y la participación
de 8 o más laboratorios.
Sin embargo no siempre los métodos incluidos en algunas
normas han sido sometidos a una validación tan compleja.

33. VALIDACIÓN - Enfoque de la ISO
¿Qué es la validación?
Según ISO la validación es la confirmación mediante examen
y suministro de evidencia objetiva de que se cumplen los
requisitos particulares para un uso específico previsto (ISO
8402:1994).
Ésta se puede interpretar para la validación de un método
como el proceso de definir una necesidad analítica y confirmar
que el método en cuestión tiene capacidades de desempeño
consistentes con las que requiere la aplicación.
Está implícita la necesidad de evaluar las capacidades de
desempeño del método.
El criterio de la “conveniencia” del método es importante.

34. VALIDACIÓN - Enfoque de la
EURACHEM
En el pasado la validación del método tendía a concentrarse
sobre el proceso de evaluación de los parámetros de
desempeño.
En el proceso de validación del método está implícito que:
Los estudios para determinar los parámetros de
desempeño se realizan usando equipos dentro de
especificaciones, que están trabajando correctamente y
que están calibrados adecuadamente.
El operador que realiza los estudios debe ser
técnicamente competente en el campo de trabajo bajo
estudio y debe poseer suficiente conocimiento sobre el
trabajo a realizar con el fin de que sea capaz de tomar
decisiones apropiadas a partir de las observaciones
hechas mientras avanza el estudio.

35. VALIDACIÓN - Enfoque de la
EURACHEM
VALIDACIÓN Y DESARROLLO
Generalmente se considera que la validación del método está
ligada estrechamente con el desarrollo del método.
No es fácil determinar exactamente donde termina el
desarrollo del método y donde empieza la validación.
Por lo general, muchos de los parámetros de desempeño del
método que están asociados a su validación son evaluados,
como parte del desarrollo del método.

36. ¿POR QUÉ ES NECESARIA LA
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO?
Importancia de las mediciones analíticas
Millones de mediciones analíticas se realizan diariamente en
miles de laboratorios alrededor del mundo con diversos fines:
evaluar bienes para propósitos de comercio,
como apoyo a la salud,
para verificar la calidad del agua para consumo
humano,
para el análisis de la composición elemental de una
aleación para confirmar su conveniencia en la
construcción de aeronaves,
en análisis forenses de fluidos corporales en
investigaciones criminales.

37. ¿POR QUÉ ES NECESARIA LA
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO?
Importancia de las mediciones analíticas
El costo de realizar estas mediciones es elevado y surgen
costos adicionales de las decisiones tomadas en base a los
resultados.
Por ejemplo, las pruebas que muestran que algún alimento no
es adecuado para su consumo pueden resultar en demandas
por compensación; pruebas que confirmen la presencia de
drogas prohibidas podrían ocasionar multas, encarcelamiento
o más aún, la ejecución en algunos países.
Claramente es importante determinar el resultado correcto y
ser capaz de demostrar que lo es.

38. EL DEBER PROFESIONAL DEL QUÍMICO
ANALÍTICO
El cliente espera poder confiar en los resultados reportados y
por lo general sólo los cuestiona cuando surge una
controversia.
De este modo, el laboratorio y su personal tienen una clara
responsabilidad de corresponder a la confianza del cliente
proporcionando la respuesta correcta a la parte analítica del
problema, en otras palabras, proporcionando resultados que
han demostrado ser “adecuados a su propósito”.
Esto lleva implícito que las pruebas realizadas son apropiadas
para la parte analítica del problema que el cliente desea
resolver y que el informe final presenta los datos analíticos de
tal manera que el cliente pueda entenderlos fácilmente y sacar
conclusiones apropiadas.
La validación del método permite a los químicos demostrar
que el método es “adecuado para su propósito”.

39. EL DEBER PROFESIONAL DEL QUÍMICO
ANALÍTICO
Para que un resultado analítico concuerde con el propósito
requerido, debe ser lo suficientemente confiable para que
cualquier decisión basada en éste pueda tomarse con
confianza.
Así, el desempeño del método debe validarse y debe
estimarse la incertidumbre del resultado a un nivel de
confianza dado.
La incertidumbre deberá ser evaluada y establecida de una
forma que sea ampliamente reconocida, consistente de forma
interna y fácil de interpretar.
La mayor parte de la información requerida para evaluar la
incertidumbre se puede obtener durante la validación del
método.

40. ALGUNAS DEFINICIONES
La exactitud es la proximidad de concordancia entre el
resultado de una medición y el valor de referencia
aceptado.
La precisión es una medida de que tan cercanos están
los resultados unos con respecto a los otros y por lo
general se expresa mediante medidas tal como la
desviación estándar la cual describe la dispersión de los
resultados.
El sesgo es la diferencia entre el valor esperado de los
resultados de prueba y un valor de referencia aceptado.

41. ALGUNAS DEFINICIONES

42. ALGUNAS DEFINICIONES
Adicionalmente, una expresión cada ves más común de
exactitud es la incertidumbre de medición, la cual
proporciona una figura única de expresión de la
exactitud.
La evaluación práctica de la veracidad se fundamenta en
la comparación de la media de los resultados de un
método con relación a valores conocidos, es decir, la
veracidad se determina contra un valor de referencia (o
sea, un valor verdadero o un valor verdadero
convencional).

43. ALGUNAS DEFINICIONES
Se dispone de dos técnicas básicas:
la verificación con respecto a los valores de
referencia de un material caracterizado,
la verificación con respecto de otro método
caracterizado.

44. ALGUNAS DEFINICIONES
Los valores de referencia son idealmente trazables a
patrones internacionales.
Los materiales de referencia certificados por lo
general se aceptan como medio de proveer valores
trazables y por lo tanto, el valor de referencia es el valor
certificado.
Cuando se utiliza un material de referencia, se determina
la media y la desviación estándar de una serie de
réplicas de una prueba y se compara contra el valor
caracterizado del material de referencia.

45. ALGUNAS DEFINICIONES
El material de referencia ideal sería un material de
referencia certificado de matriz natural, muy semejante a
las muestras de interés.
Claramente la disponibilidad de estos materiales es
limitada.
Los materiales de referencia para una validación pueden
ser por consiguiente:
preparados por adición de materiales típicos con
materiales de referencia de pureza certificada u
otros materiales de pureza y estabilidad
adecuadas,
materiales típicos bien caracterizados, de
estabilidad verificada internamente y
conservados para control de calidad interno.

46. ALGUNAS DEFINICIONES
Las medidas de precisión más comunes son la
“repetibilidad” y la “reproducibilidad”.
La repetibilidad dará una idea de la clase de
variabilidad esperada cuando un método se ejecuta por
un solo analista, con un equipo en un período corto de
tiempo.
Si la muestra se analiza por varios laboratorios para
fines comparativos, entonces una medida de precisión
más significativa a usarse es la reproducibilidad.

47. ALGUNAS DEFINICIONES
Tanto la reproducibilidad como la repetibilidad
dependen generalmente de la concentración del
analito y deben determinarse a varias
concentraciones y de ser pertinente, deberá
establecerse la relación entre la precisión y la
concentración del analito.
La desviación estándar relativa puede ser más útil en
este caso puesto que la desviación estándar dividida por
la concentración es prácticamente constante dentro del
intervalo de interés, a condición de que éste no sea
demasiado grande

48. ALGUNAS DEFINICIONES
La sensibilidad es efectivamente la pendiente de la
curva de respuesta, es decir, el cambio en la respuesta
del instrumento que corresponde a un cambio en la
concentración del analito.
Cuando se ha establecido que la respuesta es lineal
con respecto a la concentración (o sea, dentro del
intervalo lineal del método) y se ha determinado la
intersección de la curva de respuesta, la sensibilidad es
un parámetro útil para calcular y usar en fórmulas de
cuantificación.
La robustez es una medida de la efectividad del
método analítico es qué tan buen desempeño se
mantiene aun sin una implementación perfecta.

49. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
El análisis mediante recta de calibración puede hacerse
cuando sólo el analito de interés presenta señal analítica
o respuesta (absorbancia, fluorescencia, potencial
eléctrico, corriente, etc.), o cuando la señal del blanco es
constante.
Las etapas que deben seguirse en un análisis mediante
recta de calibración son:
determinación del extremo superior del rango
lineal
preparación de patrones
medición de la respuesta de los patrones
estimación de los parámetros de la regresión
cálculo de las cifras de mérito del método
predicción en muestras incógnita

50. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Determinación del extremo superior del
rango lineal
Esta etapa es fundamental, ya que la regresión lineal
está basada en la suposición de que los datos de
respuesta analítica están linealmente relacionados
con la concentración del analito.
Si se sospecha que existen desvíos de la linealidad, se
recomienda realizar un análisis exploratorio previo
cuyo objeto es extender el rango de aplicabilidad de la
técnica analítica a la máxima concentración posible.
En dicho análisis, se incluyen patrones de concentración
conocida del analito desde cero hasta valores que se
desvíen visiblemente de la linealidad.

51. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Preparación de patrones
Una vez estimado el extremo superior del rango lineal de
la técnica, deben prepararse patrones de concentración
conocida dentro de dicho rango, e incluyendo el valor
cero de concentración del analito (blanco).
Usualmente, se preparan varios patrones (como mínimo
cinco) con concentraciones igualmente espaciadas entre
cero y el extremo superior del rango lineal, y cada patrón
se analiza por triplicado.
Debe ponerse especial cuidado en la preparación de los
patrones del analito para la calibración, de manera que
las concentraciones de calibrado se conozcan con la
máxima precisión posible.

52. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Preparación de patrones
Este requisito se relaciona con el hecho de que la recta
de regresión se ajusta mediante ecuaciones que
suponen que los valores del eje x (concentraciones)
tienen una incertidumbre considerablemente menor que
los del eje y (respuestas).
Por ejemplo, si se realizan mediciones de absorbancia
como respuesta, podemos suponer que el nivel de
incertidumbre en la respuesta puede ser de alrededor de
0,005 unidades de absorbancia.
Si los valores de las respuestas son, en promedio, de 1
unidad de absorbancia, esto implica un nivel relativo de
incertidumbre de aproximadamente 0,5% en la
respuesta.

53. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Preparación de patrones
Por lo tanto, se deben preparar patrones de calibrado
cuyas concentraciones se conozcan con un error menor
al 0,5%.
Preparar soluciones de calibrado, por ejemplo, con
incertidumbres del orden del 0,1% en promedio, requiere
pesar más de 100 mg de reactivo, preparar soluciones
en matraces calibrados de al menos 100 mL, tomar
alícuotas con pipetas aforadas calibradas, etc.

54. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Medición de la respuesta de los patrones
Una vez preparados los patrones de concentración
conocida, se miden sus respuestas analíticas,
incluyendo réplicas de cada medición.
Usualmente cada patrón se mide por triplicado.
Es importante establecer la siguiente nomenclatura: si se
emplean 6 patrones, cada uno por triplicado, entonces el
número de niveles diferentes de concentración (p) es 6,
y el número total de puntos de la recta de calibrado (m)
es 18.

55. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimación de los parámetros de la
regresión
El análisis de los datos de calibrado mediante regresión
lineal implica el cálculo de la pendiente (A) y ordenada al
origen (B) de la recta ajustada a la ecuación y = A x + B.
Los valores estimados de A y B se calculan mediante las
siguientes ecuaciones:.

56. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimación de los parámetros de la
regresión
Además de los valores individuales de A y B, es
importante tener una idea de su incertidumbre asociada,
ya que los datos instrumentales llevan asociados un
error que depende del ruido instrumental, y el ajuste por
cuadrados mínimos sólo provee estimaciones de la
pendiente y ordenada al origen.
La sensibilidad de calibración es la pendiente de la curva
de respuesta, es decir, el cambio en la respuesta del
instrumento que corresponde a un cambio en la
concentración del analito.

57. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimación de los parámetros de la
regresión
Los desvíos estándar en los parámetros A y B se
calculan con las siguientes ecuaciones:
En las ecuaciones precedentes, el parámetro sy/x es el
desvío estándar de los residuos de la regresión y
está dado por:

58. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimación de los parámetros de la
regresión
donde yi es la respuesta experimental de cada patrón de
calibrado e yˆi representa la respuesta estimada en cada
punto, esto es, yˆi = A xi + B.
Se emplean m – 2 grados de libertad, ya que hay m
datos disponibles, y 2 parámetros estimados en la
regresión (A y B).
Estos parámetros estadísticos dan también una idea
de la bondad de la regresión.

59. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimación de los parámetros de la
regresión
Es deseable que sy/x sea lo más pequeña posible; no
obstante su valor está limitado por el ruido instrumental.
La distribución de los residuos, es decir, el modo en que
los valores de (yi – yˆi ) varían con la respuesta, cumple
también un papel importante en el análisis de la
adecuación de los datos al modelo lineal.

60. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Cifras de mérito del método
Las cifras de mérito de un método analítico se utilizan
regularmente con el propósito de calificar un
determinado método y comparar sus propiedades
analíticas con las provistas por otras técnicas.
Incluyen, entre otras, las siguientes:
sensibilidad de calibración
sensibilidad analítica
límite de detección
límite de cuantificación
rango dinámico
rango lineal

61. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Sensibilidad
La sensibilidad de calibración no es adecuada para
comparar dos métodos analíticos cuando estos están
basados en respuestas de diferente naturaleza (por
ejemplo, absorbancia y fluorescencia, o absorbancia y
medidas electroquímicas, etc.).
Para ello es preferible utilizar la llamada sensibilidad
analítica γ, definida por la relación entre la sensibilidad y
el ruido instrumental:
donde sy es una medida conveniente del nivel de ruido
en la respuesta.

62. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Sensibilidad
Para estimar el nivel de ruido pueden usarse dos
procedimientos, que en teoría deberían coincidir.
En el primero, se estima el ruido instrumental (sy)
a través de los desvíos de las réplicas de las
mediciones de calibrado respecto de sus
promedios.
En el segundo método de estimación del nivel de
ruido, se lo estima como el desvío estándar de
los residuos de la regresión lineal, el parámetro
ya definido sy/x

63. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Límite de detección (LOD)
Es la mínima concentración detectable de manera
confiable por la técnica.
En la definición moderna, el límite de detección (LOD) se
calcula en función del desvío estándar de la
concentración predicha para una muestra blanco (s0)
n

64. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Límite de detección (LOD)
De este modo, el LOD está dado por:
LOD = 2 × t0,05,m–2 × s0
definición que ha sido adoptada también por IUPAC e
ISO.
En la práctica, dado que m es un número relativamente
grande, el valor de (2×t0,05,m–2) tiende a 3,3, por lo que
una ecuación aproximada para el límite de detección es
LOD = 3,3 s0

65. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Límite de cuantificación (LOQ)
Es la mínima concentración cuantificable en forma
confiable.
Este parámetro (LOQ) se toma como la concentración
correspondiente a 10 veces el desvío estándar (en
unidades de concentración) del blanco, con lo cual:
LOQ = 10 s0
De este modo, el desvío estándar relativo (DSR) para
una concentración igual al LOQ es del 10%, nivel que se
toma convencionalmente como el máximo DSR
aceptable para cuantificar el analito en una muestra.

66. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Rango dinámico
Se considera que va desde la menor concentración
detectable (el LOD) hasta la pérdida de relación entre
respuesta y concentración.
El rango dinámico es también el rango de
aplicabilidad de la técnica.
En la zona de pérdida de la linealidad, podría aplicarse,
en principio, un método de regresión polinómica para la
calibración (o algún otro de naturaleza no lineal), de
modo que nada impide que dicha zona sea utilizada con
propósitos predictivos.

67. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Rango dinámico

68. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Rango lineal
Se considera que el rango lineal comprende desde la
menor concentración que puede medirse (el LOQ) hasta
la pérdida de la linealidad.
La prueba estadística que se utiliza para determinar si
los datos se ajustan a la ley lineal es la F: en primer
lugar se calcula un valor "experimental" de F, dado por:

69. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Rango lineal
Luego se compara este valor con el crítico que se
encuentra en tablas de F (de una cola) para m – 2 y m –
p grados de libertad, y un determinado nivel de
confianza, por ejemplo 95%.
Si Fexp < F, se acepta que los datos se comportan
linealmente.
Alternativamente, se calcula la probabilidad pF asociada
a este valor de Fexp, y se considera que la prueba de
linealidad es aceptada si pF > 0,05.

70. LA CURVA DE CALIBRACIÓN

71. LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Otro parámetro obtenido en el análisis de regresión es el
coeficiente de determinación o de regresión, R2.
El coeficiente casi siempre tiene un valor cercano a la
unidad, que es el máximo valor que puede alcanzar.
Pero no debe mal interpretarse puesto que un
coeficiente de correlación de 1, no necesariamente
significa que la linealidad sea buena, sino que el
numerador y el denominador de la expresión anterior se
cancelan mutuamente.
El coeficiente de correlación sólo es otro indicio adicional
que debe sumarse al análisis de los residuos.

72. BIBLIOGRAFÍA
.
NORMA ARGENTINA IRAM 301* ISO/IEC 17025. Cuarta
edición. 2005-09-05.
Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y
Temas Relacionados. EURACHEM. 2005.
La Calibración en Química Analítica. Goicoechea, HC y
Olivieri, AC. Editorial UNL, 2007.