Este estudio buscó purificar una fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos tipo 1A (PDE-1A) sensible a la vinpocetina presente en las membranas plasmáticas del músculo liso traqueal bovino. La PDE-1A fue extraída de las membranas plasmáticas mediante un procedimiento hipotónico y purificada usando cromatografía de intercambio iónico y afinidad por calmodulina. Esto resultó en una enzima purificada 32 veces que mostró mayor
Este documento describe las rutas metabólicas de degradación de los esqueletos carbonados de los aminoácidos. Explica que algunos aminoácidos son glucogénicos, otros son cetogénicos, y algunos son ambos. También describe los transportadores de restos monocarbonados como el tetrahidrofolato y la biotina, y cómo estos transportan grupos como metilo, metileno y formilo entre las rutas metabólicas. Finalmente, menciona algunas enfermedades asociadas con trastornos en estas rutas.
El documento describe tres mecanismos para regenerar ATP, la molécula que proporciona la energía para la actividad física. El primer mecanismo utiliza fosfocreatina y es rápido pero de corta duración. El segundo mecanismo es el metabolismo anaeróbico láctico que utiliza el glicógeno muscular pero genera ácido láctico. El tercer mecanismo es el metabolismo aeróbico que consume oxígeno para regenerar ATP durante varios minutos después del ejercicio. Cuanto mayor sea la capacidad aeróbica y tolerancia al ácido
El Ministerio de Medio Ambiente conmemoró el Día del Aire Puro promoviendo el uso de la bicicleta y caminar en lugar de vehículos contaminantes. Funcionarios del ministerio llegaron en bicicleta a sus oficinas y más tarde asistieron a un evento en el Parque de las Naciones donde entregaron plantines para ayudar a oxigenar el aire.
La circular número 1 de Electrodomésticos Bogotá LTDA informa a los empleados sobre una reunión urgente el 28 de agosto a las 10 am en la sala de reuniones para explicar la reestructuración de la empresa y las nuevas políticas de promoción y ascenso que regirán a partir de esa fecha. La junta es obligatoria y se espera la asistencia puntual de todos los empleados.
1) La sociedad latinoamericana y chilena se están digitalizando rápidamente, con un aumento en la comunicación entre países y una mayor dependencia de las máquinas y servicios en línea. Esto está impactando industrias como la salud, telecomunicaciones y alimentos.
2) Hay un incremento en las inversiones extranjeras especializadas en áreas específicas, y una mayor oportunidad de outsourcing para pequeñas y medianas empresas chilenas.
3) Se fortalecen competencias como la comunicación digital, la innovación y agentes especializ
This document appears to be a resume for Michael Rapp for the position of Hazard Analysis Technician-Construction. It lists Michael Rapp as the applicant and July 5th, 2012 as the date. The resume does not provide any details about Michael Rapp's qualifications, experience, or education for the position.
La Casa Entreencinas destaca por su diseño bioclimático que minimiza las necesidades de climatización. El diseño cumple criterios de captación, almacenamiento y distribución pasiva de la energía. Se utilizaron materiales de bajo impacto ambiental como aislante de corcho negro. La vivienda logra altos estándares de sostenibilidad gracias a estrategias como ventilación y protección solar natural, energía solar térmica y recuperación de aguas pluviales.
Este documento describe las rutas metabólicas de degradación de los esqueletos carbonados de los aminoácidos. Explica que algunos aminoácidos son glucogénicos, otros son cetogénicos, y algunos son ambos. También describe los transportadores de restos monocarbonados como el tetrahidrofolato y la biotina, y cómo estos transportan grupos como metilo, metileno y formilo entre las rutas metabólicas. Finalmente, menciona algunas enfermedades asociadas con trastornos en estas rutas.
El documento describe tres mecanismos para regenerar ATP, la molécula que proporciona la energía para la actividad física. El primer mecanismo utiliza fosfocreatina y es rápido pero de corta duración. El segundo mecanismo es el metabolismo anaeróbico láctico que utiliza el glicógeno muscular pero genera ácido láctico. El tercer mecanismo es el metabolismo aeróbico que consume oxígeno para regenerar ATP durante varios minutos después del ejercicio. Cuanto mayor sea la capacidad aeróbica y tolerancia al ácido
El Ministerio de Medio Ambiente conmemoró el Día del Aire Puro promoviendo el uso de la bicicleta y caminar en lugar de vehículos contaminantes. Funcionarios del ministerio llegaron en bicicleta a sus oficinas y más tarde asistieron a un evento en el Parque de las Naciones donde entregaron plantines para ayudar a oxigenar el aire.
La circular número 1 de Electrodomésticos Bogotá LTDA informa a los empleados sobre una reunión urgente el 28 de agosto a las 10 am en la sala de reuniones para explicar la reestructuración de la empresa y las nuevas políticas de promoción y ascenso que regirán a partir de esa fecha. La junta es obligatoria y se espera la asistencia puntual de todos los empleados.
1) La sociedad latinoamericana y chilena se están digitalizando rápidamente, con un aumento en la comunicación entre países y una mayor dependencia de las máquinas y servicios en línea. Esto está impactando industrias como la salud, telecomunicaciones y alimentos.
2) Hay un incremento en las inversiones extranjeras especializadas en áreas específicas, y una mayor oportunidad de outsourcing para pequeñas y medianas empresas chilenas.
3) Se fortalecen competencias como la comunicación digital, la innovación y agentes especializ
This document appears to be a resume for Michael Rapp for the position of Hazard Analysis Technician-Construction. It lists Michael Rapp as the applicant and July 5th, 2012 as the date. The resume does not provide any details about Michael Rapp's qualifications, experience, or education for the position.
La Casa Entreencinas destaca por su diseño bioclimático que minimiza las necesidades de climatización. El diseño cumple criterios de captación, almacenamiento y distribución pasiva de la energía. Se utilizaron materiales de bajo impacto ambiental como aislante de corcho negro. La vivienda logra altos estándares de sostenibilidad gracias a estrategias como ventilación y protección solar natural, energía solar térmica y recuperación de aguas pluviales.
El documento presenta una investigación sobre la expresión de la religiosidad en Facebook. Su objetivo es desarrollar una metodología para estudiar las interacciones religiosas en espacios digitales sociales como Facebook. Analiza cómo las personas reconstruyen su cotidianidad en Facebook publicando elementos que guían su sentido de vida, como oraciones, iconos y convocatorias religiosas. También muestra cómo diferentes iglesias y formas de congregación tienen cuentas en Facebook.
El documento resume un estudio que determinó el conocimiento sobre el Parto Psicoprofiláctico de las primigestas en el último trimestre de embarazo que asisten a la consulta prenatal de la Maternidad del Sur. El estudio encontró que las primigestas tenían poco conocimiento sobre las técnicas de relajación durante el parto y los momentos específicos para relajar brazos, piernas y vientre. Las parturientas mostraron intranquilidad e inseguridad.
El documento describe un estudio que midió la concentración de nicotina en dos marcas comerciales de chimó, un producto derivado del tabaco usado en Venezuela. Los resultados mostraron que la marca A contenía 508.6 ppm de nicotina, mientras que la marca B contenía 483.4 ppm. Estas concentraciones pueden inducir intoxicación por nicotina aguda y dependencia física y psicológica. El estudio concluye que el método espectrofotométrico usado es efectivo para medir nicotina en chimó.
Este documento presenta los resultados de un estudio que evaluó la disfunción endotelial en personas con síndrome metabólico en comparación con un grupo control. Los participantes con síndrome metabólico tuvieron mayores niveles de peso, IMC, circunferencia abdominal, presión arterial, colesterol, triglicéridos e insulina, y menores niveles de HDL y óxido nítrico. Esto indica una disfunción endotelial en personas con síndrome metabólico, lo que puede aumentar su riesgo cardiovascular.
Los niveles de IL-1, IL-1 y TNF- fueron significativamente mayores en el fluido gingival crevicular de pacientes con periodontitis crónica en comparación con un grupo control sano. Los parámetros clínicos como el índice gingival, índice de placa, profundidad de sondaje y pérdida de inserción también fueron significativamente peores en los pacientes con periodontitis crónica. Estos resultados demuestran el papel importante que juegan estas citoquinas inflamatorias durante
El documento describe una investigación sobre las creencias, sentimientos y emociones de estudiantes de odontología hacia la investigación científica. Se aplicó un cuestionario a 45 estudiantes y se encontró que la mayoría cree tener conocimientos adecuados sobre investigación y que los procedimientos pueden ser sencillos. Además, la mayoría se siente limitado en consultar textos en otros idiomas y les complace realizar actividades de investigación, aunque muchos muestran desinterés en tabulación y análisis de datos.
Este documento describe un estudio que caracteriza la variabilidad genómica de la región 5'UTR-C de los serotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 mediante la técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Los investigadores amplificaron la región 5'UTR-C de muestras virales y analizaron los patrones de fragmentos generados por diferentes enzimas de restricción. Encontraron homogeneidad en DENV-1, DENV-3 y DENV-4, pero dos grupos en DENV
Este documento presenta el caso de una adolescente de 16 años embarazada con problemas biopsicosociales. Tuvo su primer relación sexual a los 10 años y no usó anticonceptivos adecuadamente. Proviene de una familia disfuncional donde es víctima de abuso. Rechaza su segundo embarazo debido a su falta de apoyo económico y emocional. Mediante la aplicación del proceso de enfermería, se identificaron diagnósticos relacionados con su estado nutricional, eliminación, autocuidado y estado emocional. El objet
El documento analiza el cumplimiento del Convenio Internacional MARPOL 73/78 Anexo VI en el Puerto de La Guaira en Venezuela. Aunque el personal portuario conoce el convenio, el puerto no cumple totalmente debido a la falta de equipos e infraestructura adecuados. El puerto necesita desarrollar políticas y procedimientos para ayudar al cumplimiento del convenio y lograr sus objetivos de prevenir la contaminación atmosférica de los buques.
El estudio evaluó el ancho cortical mandibular (MCW) en radiografías panorámicas de 106 mujeres mayores de 40 años y lo comparó con densitometría ósea (DEXA). Los resultados mostraron una correlación significativa entre un MCW más delgado y osteoporosis diagnosticada por DEXA. El estudio concluyó que la medición del MCW es un buen predictor del diagnóstico de osteoporosis en mujeres mayores de 40 años.
Este documento describe un estudio que evaluó la actividad antifúngica y anti-aflatoxigénica de extractos de Salvia officinalis sobre Aspergillus flavus y aflatoxinas totales. Los resultados mostraron que el extracto inhibió el crecimiento de A. flavus con halos de inhibición de 17 mm. La concentración mínima inhibitoria fue de 116,6 mg/ml. El extracto redujo las aflatoxinas totales entre un 59,7-97,3%. Por lo tanto, el extracto de S. officinalis tiene potencial para controlar el hongo
El documento describe la validación del método analítico por HPLC para determinar N-acetil triptófano en muestras de albúmina humana. Se calificó el equipo HPLC, mostrando linealidad y exactitud. La validación mostró especificidad, adecuación del sistema cromatográfico, linealidad, precisión y exactitud aceptables. El método analítico se consideró válido para los fines descritos.
Este documento describe la estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para marcar la enzima 3α-hidroxiesteroide oxidoreductasa (3α-HSOR) utilizando un nuevo anticuerpo policlonal desarrollado contra un péptido sintético de la enzima. Los resultados mostraron que el anticuerpo permite marcar con éxito la 3α-HSOR en cortes de hígado y cerebro de rata cuando se usa en cortes flotantes, con una dilución de anticuerpo de 1:250 o 1:
La mayoría de los adolescentes entre 14 y 17 años conocen la sexualidad y creen que la exploración y el desconocimiento sobre la sexualidad influyen en el inicio de la actividad sexual. Sus padres fomentan normas éticas y morales en el hogar, lo que demuestra que la familia es importante para los adolescentes y puede influir en el inicio de la actividad sexual. Se necesitan estrategias para mejorar las percepciones sobre los riesgos de las prácticas sexuales y fortalecer los aspectos del comportamiento sexual responsable.
Este documento describe el diseño de un curso multimedia para capacitar a docentes en el uso de tecnologías de la información y la comunicación. El curso sigue las 6 fases del modelo de diseño instruccional ASSURE, analizando la audiencia de docentes, estableciendo objetivos de aprendizaje, seleccionando estrategias y materiales, implementando contenidos en una plataforma virtual, requiriendo participación de los estudiantes, y evaluando los resultados del aprendizaje. El curso busca capacitar a los docentes para aplicar estrategias basadas
Este documento describe los factores limitantes en el desarrollo de un proyecto de investigación transdisciplinar e interinstitucional sobre la gestión integral de cuencas. Identifica 9 factores clave como: 1) la visión de los coordinadores, 2) el equipo humano, 3) las instituciones participantes, 4) la verificación del direccionamiento estratégico, 5) el logro de los objetivos, 6) la cultura organizacional, 7) los factores externos, 8) el tiempo, y 9) el marco legal. Además, destaca dos lecciones aprendidas
Este estudio analizó la presencia de plaguicidas organofosforados en suelos de la Depresión de Quíbor en Venezuela. Se tomaron muestras de suelo en 5 puntos y 2 profundidades y se analizaron para detectar Memphis Clorpirifós. Los resultados mostraron la presencia de este plaguicida en todas las muestras a pesar de ser aplicado de forma aérea.
Este documento describe la identificación de aspectos ambientales en una empresa procesadora de alimentos en Venezuela. Se identificaron un total de 337 aspectos ambientales, de los cuales 163 fueron significativos y 108 de esos aspectos significativos tenían exigencia legal. Los aspectos ambientales significativos con exigencia legal incluyeron la generación de desechos peligrosos y no peligrosos, aguas residuales industriales y emisiones atmosféricas.
Este documento describe la identificación de la proteína Pv-32 de Plasmodium vivax, que es reconocida por un anticuerpo monoclonal utilizado para diagnosticar la malaria causada por esta especie. Mediante técnicas de proteómica como digestión enzimática, espectrometría de masas y secuenciación de péptidos, los investigadores determinaron que Pv-32 es la deshidrogenasa láctica de P. vivax, una enzima clave en la glucólisis del parásito. La identificación molecular de esta proteína mejora la compre
Este documento describe una investigación para caracterizar y clasificar pequeñas empresas artesanales productoras de queso guayanés telita en el estado Bolívar de Venezuela. La investigación evaluó 30 empresas a través de un cuestionario y análisis estadísticos. Los resultados mostraron que las empresas tienen baja productividad, alta diversidad y limitaciones para garantizar la calidad e inocuidad del producto. Se identificaron 4 estratos de empresas según su tamaño. La investigación provee una base para mejorar la competitividad de estas pequeñas empresas a través de
El documento presenta una investigación sobre la expresión de la religiosidad en Facebook. Su objetivo es desarrollar una metodología para estudiar las interacciones religiosas en espacios digitales sociales como Facebook. Analiza cómo las personas reconstruyen su cotidianidad en Facebook publicando elementos que guían su sentido de vida, como oraciones, iconos y convocatorias religiosas. También muestra cómo diferentes iglesias y formas de congregación tienen cuentas en Facebook.
El documento resume un estudio que determinó el conocimiento sobre el Parto Psicoprofiláctico de las primigestas en el último trimestre de embarazo que asisten a la consulta prenatal de la Maternidad del Sur. El estudio encontró que las primigestas tenían poco conocimiento sobre las técnicas de relajación durante el parto y los momentos específicos para relajar brazos, piernas y vientre. Las parturientas mostraron intranquilidad e inseguridad.
El documento describe un estudio que midió la concentración de nicotina en dos marcas comerciales de chimó, un producto derivado del tabaco usado en Venezuela. Los resultados mostraron que la marca A contenía 508.6 ppm de nicotina, mientras que la marca B contenía 483.4 ppm. Estas concentraciones pueden inducir intoxicación por nicotina aguda y dependencia física y psicológica. El estudio concluye que el método espectrofotométrico usado es efectivo para medir nicotina en chimó.
Este documento presenta los resultados de un estudio que evaluó la disfunción endotelial en personas con síndrome metabólico en comparación con un grupo control. Los participantes con síndrome metabólico tuvieron mayores niveles de peso, IMC, circunferencia abdominal, presión arterial, colesterol, triglicéridos e insulina, y menores niveles de HDL y óxido nítrico. Esto indica una disfunción endotelial en personas con síndrome metabólico, lo que puede aumentar su riesgo cardiovascular.
Los niveles de IL-1, IL-1 y TNF- fueron significativamente mayores en el fluido gingival crevicular de pacientes con periodontitis crónica en comparación con un grupo control sano. Los parámetros clínicos como el índice gingival, índice de placa, profundidad de sondaje y pérdida de inserción también fueron significativamente peores en los pacientes con periodontitis crónica. Estos resultados demuestran el papel importante que juegan estas citoquinas inflamatorias durante
El documento describe una investigación sobre las creencias, sentimientos y emociones de estudiantes de odontología hacia la investigación científica. Se aplicó un cuestionario a 45 estudiantes y se encontró que la mayoría cree tener conocimientos adecuados sobre investigación y que los procedimientos pueden ser sencillos. Además, la mayoría se siente limitado en consultar textos en otros idiomas y les complace realizar actividades de investigación, aunque muchos muestran desinterés en tabulación y análisis de datos.
Este documento describe un estudio que caracteriza la variabilidad genómica de la región 5'UTR-C de los serotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 mediante la técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Los investigadores amplificaron la región 5'UTR-C de muestras virales y analizaron los patrones de fragmentos generados por diferentes enzimas de restricción. Encontraron homogeneidad en DENV-1, DENV-3 y DENV-4, pero dos grupos en DENV
Este documento presenta el caso de una adolescente de 16 años embarazada con problemas biopsicosociales. Tuvo su primer relación sexual a los 10 años y no usó anticonceptivos adecuadamente. Proviene de una familia disfuncional donde es víctima de abuso. Rechaza su segundo embarazo debido a su falta de apoyo económico y emocional. Mediante la aplicación del proceso de enfermería, se identificaron diagnósticos relacionados con su estado nutricional, eliminación, autocuidado y estado emocional. El objet
El documento analiza el cumplimiento del Convenio Internacional MARPOL 73/78 Anexo VI en el Puerto de La Guaira en Venezuela. Aunque el personal portuario conoce el convenio, el puerto no cumple totalmente debido a la falta de equipos e infraestructura adecuados. El puerto necesita desarrollar políticas y procedimientos para ayudar al cumplimiento del convenio y lograr sus objetivos de prevenir la contaminación atmosférica de los buques.
El estudio evaluó el ancho cortical mandibular (MCW) en radiografías panorámicas de 106 mujeres mayores de 40 años y lo comparó con densitometría ósea (DEXA). Los resultados mostraron una correlación significativa entre un MCW más delgado y osteoporosis diagnosticada por DEXA. El estudio concluyó que la medición del MCW es un buen predictor del diagnóstico de osteoporosis en mujeres mayores de 40 años.
Este documento describe un estudio que evaluó la actividad antifúngica y anti-aflatoxigénica de extractos de Salvia officinalis sobre Aspergillus flavus y aflatoxinas totales. Los resultados mostraron que el extracto inhibió el crecimiento de A. flavus con halos de inhibición de 17 mm. La concentración mínima inhibitoria fue de 116,6 mg/ml. El extracto redujo las aflatoxinas totales entre un 59,7-97,3%. Por lo tanto, el extracto de S. officinalis tiene potencial para controlar el hongo
El documento describe la validación del método analítico por HPLC para determinar N-acetil triptófano en muestras de albúmina humana. Se calificó el equipo HPLC, mostrando linealidad y exactitud. La validación mostró especificidad, adecuación del sistema cromatográfico, linealidad, precisión y exactitud aceptables. El método analítico se consideró válido para los fines descritos.
Este documento describe la estandarización de un protocolo de inmunohistoquímica para marcar la enzima 3α-hidroxiesteroide oxidoreductasa (3α-HSOR) utilizando un nuevo anticuerpo policlonal desarrollado contra un péptido sintético de la enzima. Los resultados mostraron que el anticuerpo permite marcar con éxito la 3α-HSOR en cortes de hígado y cerebro de rata cuando se usa en cortes flotantes, con una dilución de anticuerpo de 1:250 o 1:
La mayoría de los adolescentes entre 14 y 17 años conocen la sexualidad y creen que la exploración y el desconocimiento sobre la sexualidad influyen en el inicio de la actividad sexual. Sus padres fomentan normas éticas y morales en el hogar, lo que demuestra que la familia es importante para los adolescentes y puede influir en el inicio de la actividad sexual. Se necesitan estrategias para mejorar las percepciones sobre los riesgos de las prácticas sexuales y fortalecer los aspectos del comportamiento sexual responsable.
Este documento describe el diseño de un curso multimedia para capacitar a docentes en el uso de tecnologías de la información y la comunicación. El curso sigue las 6 fases del modelo de diseño instruccional ASSURE, analizando la audiencia de docentes, estableciendo objetivos de aprendizaje, seleccionando estrategias y materiales, implementando contenidos en una plataforma virtual, requiriendo participación de los estudiantes, y evaluando los resultados del aprendizaje. El curso busca capacitar a los docentes para aplicar estrategias basadas
Este documento describe los factores limitantes en el desarrollo de un proyecto de investigación transdisciplinar e interinstitucional sobre la gestión integral de cuencas. Identifica 9 factores clave como: 1) la visión de los coordinadores, 2) el equipo humano, 3) las instituciones participantes, 4) la verificación del direccionamiento estratégico, 5) el logro de los objetivos, 6) la cultura organizacional, 7) los factores externos, 8) el tiempo, y 9) el marco legal. Además, destaca dos lecciones aprendidas
Este estudio analizó la presencia de plaguicidas organofosforados en suelos de la Depresión de Quíbor en Venezuela. Se tomaron muestras de suelo en 5 puntos y 2 profundidades y se analizaron para detectar Memphis Clorpirifós. Los resultados mostraron la presencia de este plaguicida en todas las muestras a pesar de ser aplicado de forma aérea.
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Este documento describe la identificación de la proteína Pv-32 de Plasmodium vivax, que es reconocida por un anticuerpo monoclonal utilizado para diagnosticar la malaria causada por esta especie. Mediante técnicas de proteómica como digestión enzimática, espectrometría de masas y secuenciación de péptidos, los investigadores determinaron que Pv-32 es la deshidrogenasa láctica de P. vivax, una enzima clave en la glucólisis del parásito. La identificación molecular de esta proteína mejora la compre
Este documento describe una investigación para caracterizar y clasificar pequeñas empresas artesanales productoras de queso guayanés telita en el estado Bolívar de Venezuela. La investigación evaluó 30 empresas a través de un cuestionario y análisis estadísticos. Los resultados mostraron que las empresas tienen baja productividad, alta diversidad y limitaciones para garantizar la calidad e inocuidad del producto. Se identificaron 4 estratos de empresas según su tamaño. La investigación provee una base para mejorar la competitividad de estas pequeñas empresas a través de
1. Resúmen # B-16
El asma es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por la contracción reversible
del músculo liso traqueo-bronquial. La contracción del músculo liso traqueal de bovino
(MLTB) activa cascadas de señalización que generan segundos mensajeros como: AMPc/
LA PURIFICACIÓN DE UNA FOSFODIESTERASA DE LOS
NUCLEÓTIDOS CÍCLICOS (PDE-1A) DEL MÚSCULO LISO TRAQUEAL
GMPc. Los niveles de GMPc en el MLTB son regulados por la activación/inhibición de recep-
tores muscarínicos (MAchRs) acoplados a proteínas G (GPCR) asociados a cascadas que pue-
den aumentar los niveles de AMPc/GMPc mediante la inhibición de fosfodiesterasas (PDEs).
El antagonista muscarínico (atropina) incrementó simultáneamente los niveles de AMPc/
DE BOVINO
GMPc en el MLTB, efecto similar al utilizar IBMX (inhibidor no selectivo de PDE) y la vin-
pocetina (inhibidor específico de PDE-1) en fragmentos de MLTB, sugiriendo la participación
de PDEs en esta respuesta de los antagonistas muscarínicos. Los antagonistas muscarínicos
actúan sobre M2AChRs anclados en el sarcolema, vía una proteína PTX-sensible Gi/o, que
inicia una novedosa vía de señalización celular que conduce a la inhibición de una PDE-1 aso-
ciada al sarcolema. El objetivo de este estudio fue purificar una PDE-1 dependiente de calmo-
dulina e inhibida por vinpocetina, presente en las fracciones de membranas plasmáticas del
MLTB. La PDE-1 fue extraída de las fracciones de membranas plasmáticas utilizando un
amortiguador de baja fuerza iónica, el extracto hipotónico fue aplicado a una columna de Q- P. Mastromatteo-Alberga, F. Pláceres-Uray, R. Gonzalez de Alfonzo, MJ. Alfonzo, I. Lippo de Becemberg
Sefarosa y eluída con un gradiente de NaCl (0.4-1.0 M) obteniéndose un pico de actividad
sensible a vinpocetina, el cual fue aplicado a una columna de CaM-Agarosa, y eluída con EG- Sección de Biomembranas. Instituto de Medicina Experimental. Facultad de Medicina.
TA 2 mM obteniéndose un pico de actividad sensible a vinpocetina. La purificación de la pro-
teína de CaM-Agarosa (32 veces) fue analizada mediante PAGE-SDS observándose dos ban- Universidad Central de Venezuela, UCV. Sabana Grande. Aptdo 50587. Caracas-Venezuela
das (56, 58 KDa ) y utilizando anticuerpos mediante inmunoblot, se determinó la presencia de
una PDE-1A (58 kDa). La actividad de PDE fue cuantificada midiendo la cantidad de 3H- patrizia_mast@hotmail.com
Guanosina producida del [3H]GMPc. Subvencionado por CDCH PG -09-7772-2009/1 (MA) y
PG-09-7401-2008/2 (RGA).
Introducción Conclusión
El asma bronquial es una enfermedad inflamatoria crónica, carac terizada
Figura 1. Purificación de la PDE-1 mediante cromatografía de Q-Sefarosa y cromatografía de afinidad CaM-Agarosa
por una disminución reversible del calibre de las vías aéreas. El calibre
Nuestros resultados iniciales indicaron
de dichas vías depende en gran medida del balance entre los procesos 1-a) Perfil cromatográfico de la Q-Sefarosa. 1-b) Perfil cromatográfico de la CaM-Agarosa. por primera vez, la purificación de una
de contracción y relajación del músculo liso de las vías aéreas (MLVA) 1,2 Pool I
a) 0,3 PDE-1A sensible a vinpocetina asocia-
(1). Ambos procesos son iniciados por distintos estímulos o mediado-
res, que son transducidos a través de la membrana plasmática
Pool I da a los receptores muscarínicos si-
1 0,25 tuados en las membranas plasmáticas
(sarcolema) generando cada uno cascadas de señalización que condu-
cen a la generación de segundos mensajeros, tales como: el AMPc,
0,8
preparadas del músculo liso traqueal
GMPc, y el DAG (1). El GMPc ha sido implicado tanto en la relajación 0,2
bovino. Esta PDE activa se purificó
como en la contracción del MLVA (4). Los niveles del GMPc se relacio-
nan con la activación/inhibición de los MAChR, lo cual ha sido reporta- 0,6 0,15 más de 32 veces como una PDE sen-
g/L
g/L
do por Guerra de González y col. en el MLTB (1), quienes demostraron sible a vinpocetina que fue estimulada
que la atropina (un antagonista muscarínico no selectivo), incrementa- 0,4 0,1 dos veces por la calmodulina.
ba de manera significativa las concentraciones de GMPc y AMPc sien-
do este efecto similar al producido por el inhibidor inespecífico de 0,2 Además, en la última fracción de CaM
0,05
PDEs como es el isobutilmetilxantina (IBMX). Además, ellos describen agarosa, se pudieron observar 2 ban-
que los antagonistas muscarínicos son capaces de aumentar de mane- 0 das con PM de 56 y 58KDa. La de
0
ra simultánea los niveles de ambos nucleótidos cíclicos, y estos auto-
res proponen que un miembro de la familia de PDEs que hidroliza a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Fracciones 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 58KDa fue identificada como una ban-
Fracciones
ambos nucleótidos cíclicos, pudiese ser la PDE responsable de este da de PDE-1A positiva usando anti-
efecto del antagonista muscarínico. Además, demostraron en el MLTB Figura 2. Efecto de la vinpocetina. Figura 3. Estimulación por Calmodulina. cuerpos específicos en ensayos de
intacto, que la vinpocetina, un inhibidor selectivo de las CaM-PDE-1s,
no asociado con la calmodulina (CaM), provoca una respuesta similar
Western Blot que están presentes en
al antagonista muscarínico (atropina), incrementando las concentracio- las fracciones de membranas plasmá-
nes de ambos nucleótidos cíclicos (AMPc, GMPc). Adicionalmente, es- ticas cruda obtenidas de la columna
hidrolizados/min./mg. de proteina
pmoles de GMPc[3H] hidrolizados/min./mg
ta PDE sensible a antagonista muscarínico se encontró que está aso- 60 250 de CaM-agarosa activada. Además, la
ciada a la fracción particulada del MLVA. Nosotros en este trabajo nos
enzima purificada (fracción CaM-
pmoles de GMPc [3H]
planteamos purificar e identificar a una CaM-PDE-1s sensible a vinpo- 50
200
cetina presente en las fracciones subcelulares de membranas plasmá- agarosa) mostraron un incremento en
40
ticas del MLTB. 150 la inhibición por vinpocetina y en la ac-
de proteínas
Metodología 30
tivación por la calmodulina.
100
1.-Preparación de las fracciones de membrana plasmática del 20
músculo liso traqueal de bovino. 50
La obtención de las fracciones subcelulares de MLTB fue descrita por 10
González de Alfonzo y col. (5) utilizando un amortiguador I que contie- 0 0
ne: (0,3M de sacarosa, 20mM de K-EGTA, 2mM de benzamidina, Basal Vinp Basal Vinp Basal Vinp Basal Vinp Basal Ca+2.CaM Basal Ca+2.CaM Basal Ca+2.CaM Basal Ca+2.CaM
0,25mM de PMSF, 0,5mM de DTT, 0,5mM de HEPES-KOH (pH 7.0). MPC EH Q-Sefarosa CaM-Agarosa MPC EH Q-Sefarosa CaM-Agarosa
Las fracciones subcelulares obtenidas fueron: E= extracto celular, M=
mitocondria, N= núcleo, P= microsomal, C=citosol, P1, P2= membra-
nas plasmáticas rica en receptores muscarínicos, y se les adicionó eti- La Figura 1a. El extracto hipotónico se colocó en una columna de Q-Sefarosa, equilibrada previamente con amortiguador 1 (20 mM Tris-HCl, 1 mM de imida-
lenglicol 30%, fueron congeladas con nitrógeno líquido y almacenadas zol, 1 mM de acetato de magnesio a pH 7) que contiene 0,1 mM EGTA y 5mM de DTT a 4 ºC y se lavó con 20 ml de amortiguador 1 + 50 mM NaCl, luego se
a –80ºC. eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0,4-1M). El contenido de proteínas se determinó por el método de Lowry. Las fracciones con mayor contenido de pro- Referencias
2.- Determinación de la actividad de la fosfodiesterasa de los nu- 3
teínas fueron agrupadas (Fr3-FR11) y se determinó la actividad enzimática de la PDE ( H-GMP) sensible a la vinpocetina (20 M) y la estimulación por CaM
cleótidos cíclicos. (3g/ml). Figuras 2 y 3. Luego el pool de proteínas de la columna de Q-Sefarosa, fue transferido a la columna de afinidad CaM-agarosa (5mL) siguiendo el 1. Guerra de González L., González
La actividad de PDE fue determinada, usando [3H]GMPc como sustrato
protocolo descrito en la metodología Figura 1b y Figuras 2, 3. Muestra: membranas plasmática cruda (MPC) de las fracciones (P1/P2 y M1/M2), extracto hi- de Alfonzo R., Lippo de Bécemberg
(1). Las proteínas (50 a 100mg) fueron incubadas durante 30 min. a
30ºC con [3H]GMPc (0.1 mC) por ensayo en un amortiguador que con- potónico (EH) de las fracciones MPC, fracción de Q-Sepharose activa, fracción de la columna CaM-Agarosa activa. Estos datos son la media + SE de tres I., Alfonzo M.J. Cyclic nucleotide-
tiene: 0.3 mM GMPc, 40 mM de Tris-HCl pH 7.5, 10 mM de MgCl2 y 1 preparaciones diferentes de proteínas ensayadas por duplicado. dependent phosphodiesterase
unidad de 5’nucleotidasa. La reacción se detuvo agregando 10 mM de (PDE1) inhibition by muscarinic an-
EDTA, luego todo el medio de incubación se coloca en una columna de Figura 4. Identificación de una PDE-1A mediante inmunoblot. tagonists in bovine tracheal smooth
3
intercambio iónico AG-1-X8 formato. Los productos hidrolizados ([ H] muscle. Biochemical Pharmacology.
guanosina) fueron eluidos con una mezcla de etanol-agua (1:1). El a)
3
contenido de [ H] fue determinado usando un contador de líquido de
2004; 68:651-658.
centelleo.
3.-Purificación de una CaM-PDE-1 sensible a vinpocetina siguien- 2. Sharma, R. K., Das, S. B., Lakshmi-
do un procedimiento modificado (2). kuttyamma A., Selvakumar P., Shri-
Primera etapa. Extracción de la PDE-1 a partir de las fracciones de las vastav A. Regulation of calmodulin-
membranas plasmáticas (3). Las fracciones de membrana plasmática stimulated cyclic nucleotide phosp-
(P1/P2 y M1/M2), fueron resuspendidas en un amortiguador hipotónico
b) hodiesterase 1(PDE-1): Review. In-
(10mM HEPES., 0,1 mM EDTA, 1mM DTT, 0.25mM PMSF), y se reali-
zaron extracciones mediante centrifugación 150,000 x g por 5 min a ternational Journal of Molecular Me-
4ºC. Este procedimiento se realizó 6 veces y los sobrenadantes dicine. 2006; 18: 95-105.
(extracto hipotónico) obtenido fue utilizado para la purificación de la
PDE-1. 3. So Insuk, Yang, D. Ki, Kim, I. Five
Segunda etapa. Cromatografía Q-Sefarosa (2). La muestra (extracto subtypes of muscarinic receptors
hipotónico) fue trasferida a una columna de intercambio iónico Q- Las proteínas de membrana (50g) (fueron separadas sobre geles de SDS-PAGE al 10% de acuerdo
con el método descrito por Laemmli (Figura 4a). El patrón de peso molecular utilizado (28,3-132KDa).
are expressed in gastric smooth
Sefarosa, previamente equilibrada con un amortiguador 1 (20mM Tris-
HCl, 1mM imidazole, 1mM acetato de magnesio a pH 7 conteniendo Las muestras analizadas fueron: Carril 1: Membranas plasmáticas cruda (MPC) correspondientes a las muscle of guinea pig. Experimental
0.1mM EGTA y 5mM DTT) a 4ºC. Luego de colocar la muestra, se rea- fracciones (P1/P2 y M1/M2). Carril 2: Extracto hipotónico de las fracciones de MPC. Carril 3: Fracción de and Molecular Medicine. 2003; 35:
lizó un lavado con 20mL de amortiguador 1 conteniendo 50mM NaCl, Q-sefarosa activa. Carril 4: Fracción de la columna CaM-agarosa activada. La fracción de PDE-1 en es- 46-52.
posteriormente la muestra fue eluída con un gradiente lineal de NaCl tudio presenta unos pesos molecular es de 56 y 58 kDa. Lo cual fue corroborado al realizar un inmuno-
(0,4-1M). Las fracciones fueron colectadas y se determinó la concen- blot utilizando anticuerpo específico de PDE-1A con un PM relativo en los 58 KDa (Figura 4b). 4. Katsuki S, Murad F. Regulation of
tración de proteínas mediante el método de Lowry. Además, se deter- adenosine cyclic 3’,5’ monophosp-
minó la actividad de PDE (3H-GMP) sensible a vinpocetina y la activa-
hate and guanosine cyclic 3’,5’ mo-
ción por CAM.
Tabla 1. Purificación de una fosfodiesterasa de nucleótido cíclico dependiente de calmodulina de músculo nophosphate levels and contractility
Tercera etapa. Cromatografía de afinidad “CaM-Agarosa” (2).
Las fracciones con actividad de PDE sensible a vinpocetina fueron liso traqueal de bovino. in bovine tracheal smooth muscle.
transferidas a la columna “CaM-Agarosa” (5mL), la cual fue previamen- Mol Pharmacol 1977; 13: 330-41.
te lavada con 10mL de amortiguador 1 conteniendo Hidrocloruro de Muestras mg/mL Volumen total(mL) Proteínas totales(mg) Actividad específica Actividad total Purificación
Guanidina 2M, luego la columna fue equilibrada con 10mL de amorti- 5. González de Alfonzo, R., Lippo de
guador 1 conteniendo Ca+2 100M y 5mM de DTT. La columna fue eluí- Extracto crudo 10,2 900 9162 4,7 42.707,1 1,0 Becemberg, I., Alfonzo, M. J. A
da con 20mL de Buffer 1 conteniendo 2mM de EGTA y 5mM DTT, obte-
Membrana plasmática 7,0 50 350 7,4 2.604,4 1,5 Ca2+/CaM protein kinase associated
niendo fracciones de 1mL. Se determinó la concentración de proteínas 2+
mediante el método de Lowry, además se determinó la actividad de with Ca transport in sarco (endo)
PDE (3H-GMP) sensible a vinpocetina y la activación por CAM. Extracto hipotónico 0,18 900 161 8,1 1.304,7 1,7 plasmic vesicles from tracheal smo-
4.-Western blotting. Las proteínas fueron separadas sobre geles de oth muscle. Life science. 1996; 58:
Q-Sefarosa 5,2 1,8 9,3 72,1 669,8 15,3
PAGE-SDS al 10% y luego transferidas a una membrana de nitrocelu- 1403-1412.
losa a fin de identificar la proteína utilizando anticuerpos específicos CaM-Agarosa 1,0 0,5 0,5 152,1 76,1 32,4
mediante inmunoblot.