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1. Sede
Semestre
Sección
Docente
Catedra
Unidad
Tema
Lago
Tercero
Microbiologia
-
COLORACION DE
GRAM

2. COLORACIÓN DE GRAM
• El procedimiento de tinción más ampliamente usado en
bacteriología, Nos permite dividir a las bacterias en dos
grandes grupos taxonómicos: Gram positivas y Gram
negativas, según sea su comportamiento frente a la tinción.

3. COLORACIÓN DE GRAM
SET DE COLORACIÓN
El set de coloración de Gram está compuesto
por:
• Cristal violeta
• Lugol
• Alcohol acetona
• Safranina o fucsina básica
• Técnica de coloración más sencilla y útil en microbiología
diagnóstica.
• Creada por el médico danés Hans Christian Gram en 1884.
• Sufrió modificaciones por Hucker en 1921.
• Es posible observar la forma que
tienen los microorganismos y clasificarlas en Gram
positivas y Gram negativas.

4. • Está a cargo de
un anión
• Tiene carga
negativa
• Tiñe el entorno de
la célula
ÁCIDOS
• Está a cargo de
un catión
• Presenta
carga positiva
• Tiñe el interior
de la
célula
BÁSICOS
• Formado por
soluciones acuosas
de colorantes ácidos
y básicos
• Soluble
exclusivamente
en alcohol
• Ej.: Giemsa
NEUTROS
TIPOS DE COLORANTES

5. Este tipo de coloración
es rápida y sencilla, ya
que se usa un solo
colorante por un corto
tiempo.
COLORACIÓN
SIMPLE

6. .
COLORACIÓN
Diferencial
Aquí los colorantes utilizados ponen de
manifiesto diferencias entre células
bacterianas o entre partes de una misma
célula, estas técnicas utilizan más de un
colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tinción.

7. La diferencia de la reacción entre bacterias Gram positivas y Gram negativas es
atribuida a diferencias químicas y físicas de su pared celular.
Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de peptidoglicano como
estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmática mientras que las
bacterias Gram negativas presentan por sobre la membrana citoplasmática una
delgada capa de peptidoglicano a la que se superpone una capa de lipopolisacáridos-
lipoproteína denominada “membrana externa”.
La presencia de esta “membrana externa” diferencia actualmente dos divisiones en
sistemática bacteriana: las que no la poseen, Gram positivas y las que poseen Gram
negativas.
FUNDAMENTO

8. • En la coloración de Gram, el violeta de genciana es captado en la pared celular de
bacterias Gram positivas y Gram negativas y luego se forma un complejo con el
lugol.
• El decolorante actúa extrayendo los lípidos de la membrana externa de la pared
celular de las bacterias Gram negativas lo que produce un aumento en la
permeabilidad y se pierde el complejo formado entre el violeta de genciana y el
lugol.
• Al agregar la safranina, las bacterias Gram negativas toman el color de este
contracolorante y se observan de color rosado.
• A diferencia de estas, en las bacterias Gram positivas el agregado del decolorante
produce disminución de la permeabilidad e incrementa la retención del complejo
del violeta de genciana-iodo.
• El resultado es que se observan de color violeta por la retención del mismo.
FUNDAMENTO

9. GRAM POSITIVAS

10. GRAM NEGATIVAS

11. Materiales
• Muestras
• Asa bacteriológica.
• Mechero
• Microscópio.
• Pizeta
• Varillas de vidrio.
• Cristal
violeta.
• Lugol.
• Fucsina
• Alcohol acetona.
• Solucion salina.
• Agua
• Aceite de
inmersión.
MATERIALES
Colorantes
Reactivos

12. METODOLOGÍA
Frotis y
fijación
• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados.
• A partir del crecimiento microbiano en medios sólidos o líquidos: cuando la coloración de
Gram se efectúa para caracterizar colonias, colocar en el portaobjeto una gota de solución
fisiológica en la que se emulsionará la colonia que ha sido recolectada (mediante el uso de
ansa o hisopo) del medio de cultivo en que se encuentra.
En caso de que se trate de medios líquidos, depositar una alícuota de cada uno de ellos en el
portaobjetos.
• Directamente a partir de la muestra en estudio: es común que se preparen los extendidos
directamente tomando la muestra (ejemplo pus, esputo, exudados, entre otros) con ansa,
hisopo o pipeta estéril y diseminándola sobre la superficie del portaobjeto.
Según la muestra, puede prepararse una suspensión en aproximadamente 1 mL de solución
fisiológica estéril dentro de un pequeño tubo estéril y luego tomar una alícuota y esparcirla
en el portaobjeto.
• A la llama: se efectúa pasando 3 veces el lado del portaobjeto que no tiene la preparación
sobre la llama del mechero.

13. TINCIÓN
Cubrir preparaciones con cristal violeta por
un minuto, lavar con agua.
Cubrir frotis con lugol por un minuto,
lavar.
Decolorar con la mezcla alcohol-acetona,
escurrir de 5 a 6 gotas y lavar.
Cubrir con safranina durante por 1
minuto, lavar.
Secar la preparación y observar al
microscopio
colocando aceite de inmersión.
1
2
3
4
5

14. Resultados de las observaciones
Cocos
Gram
Negativos
Bacilos
Gram
Negativos
Cocos
Gram
Positivos
Bacilos
Gram
Positivos

15. Conclusiones
 Las limitaciones de la técnica vienen dadas el hecho de que algunas
bacterias no presentan pared celular.
 En las bacterias gramnegativas se presentan dos membranas lipídicas
entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, en
cambio en las grampositivas presentan solo hay una membrana lipídica y
la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa.
 La coloración Gram nos permite identificar distintos tipos de bacterias
según se coloree su superficie, aportando información muy útil para
orientar el tratamiento antibiótico.