Practica 3 tinciones

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA FCM - UCE
Práctica 3 – Técnica de Tinción – Gram Página |1

PRACTICA 3
Técnica de Tinciones Bacterianas

Dr. David Larreátegui R. – Docente de Cátedra.
Sr. Víctor Avenatti J. – Ayudante de Cátedra.

1. Taxonomía
2. Técnicas de tinción para la microscopia óptica.
3. Coloración gram
4. Procedimiento.
5. Observación de la tinción de gram.
6. Tinción de gram de las bacterias que crecen en cultivos. (frotis indirectos).
7. Coloración de Zhiel-Neelsen
8. Baciloscopía y su aplicación clínica
9. Procedimiento.
10. Observación de Bacterias BAAR.
11. Utilidad clínica

OBJETIVO:
 Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram
 Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad
clínica de la tinción.


FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA:
La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y puede utilizarse para
separar la mayoría de las especies bacterianas en dos grandes grupos, a saber, las que captan el
colorante básico, cristal violeta (es decir las bacterias gran positivas), y las que pierden ese
colorante por el lavado con el decolorante alcohol o acetona (es decir las bacterias gram
negativas).

Taxonomía
Todos los organismos tienen un nombre que consta de dos partes: el género seguido por la
especie (ejemplo: el Homo sapiens). Las bacterias se han agrupado y denominado principalmente
en su morfológicas y bioquímicas / metabólicas diferencias. Sin embargo, las bacterias son ahora
también clasificadas de acuerdo a su inmunología y las características genéticas.
Esta práctica se centra en la tinción de Gram, morfología bacteriana,
y características metabólicas, todos los cuales permiten al médico - clínico determinar
rápidamente el organismo que está causando la infección de un paciente.

Página 1


TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA.
Preparación del extendido:
Los métodos de tinción se utilizan en forma directa con las muestras del paciente o se aplican a los
preparados obtenidos a partir del desarrollo de los microorganismos en cultivos.

Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene el material
del paciente o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de líquido aspirado (Fig 1).
El material que se va a teñir se coloca en forma de una gota (si la muestra es liquida), o se rota (si
esta en un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco, en la parte media con un
largo aproximado de 2 cm por 1 cm de amcho.

B

A

Fig 1.- frotis obtenidos por rotación de un hisopo (A) y deposito con
pipeta (B) de la muestra del paciente sobre un portaobjetos de vidrio.

Es importante evitar la contaminación de los medios de cultivo; por lo tanto, una vez que el hisopo
toco la superficie de un portaobjetos no estéril no debe utilizarse para la inoculación posterior de
medios de cultivo.
Para la tinción de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una aguja estéril
para transferir una pequeña cantidad del cultivo desarrollado en un medio solido a la superficie
del portaobjetos. Este material se emulsiona en una gota de agua o solución salina 0.9% estéril
sobre el portaobjeto. En caso de cantidades pequeñas que puedan perderse incluso en una gota
de solución fisiológica se puede utilizar un aplicador de madera estéril para obtener el material;
luego este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teñir se deja secar y se
fija al portaobjeto mediante su colocación sobre:
1).- una platina caliente (a 60⁰C) durante por lo menos 10 minutos
2).- cubriéndolo con metanol al 95% durante 1 minuto o
3).- flameando la placa portaobjetos por el mechero en tres ocasiones

Para examinar los microorganismos que crecen en medio líquido se aplica una muestra aspirada
del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y se fija antes de la tinción.
La preparación de los frotis varía de acuerdo con el tipo de muestra que se va a procesar y con los
métodos de tinción que se van a utilizar. No obstante la regla general para la preparación de frotis
es que debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las

Página 2


posibilidades de detectar y diferenciar los microorganismos. Por último, el método de tinción que
se debe utilizar esta determinado por el tipo de microorganismo buscado.

COLORACION GRAM
Dado que las bacterias no tienen color y por lo general invisible para la microscopía de luz,
diferentes técnicas de tinción se han desarrollado para visualizarlas. La más útil es la tinción de
Gram, que separa los organismos en 2 grandes grupos: gram-positivos y gram-negativas.
Esta tinción también permite que el clínico pueda determinar si el organismo es redondo o
en forma de varilla, etc.

Página 3


Ambos organismos, gram-positivas y gram-negativas tienen más que una capa de protección de su
citoplasma y núcleo desde el medio extracelular, a diferencia de las células animales, que tienen
una sola membrana citoplasmática compone de una bicapa de fosfolípidos. La capa externa de la
membrana citoplasmática bacteriana es el peptidoglicano o pared celular. Está presente en ambos
organismos gram-positivos y gram-negativas.
La capa de peptidoglicano o pared celular está compuesta de repetidos disacáridos con 4
aminoácidos en una cadena lateral que se extiende desde cada disacárido.
Las cadenas de amino-ácidos del peptidoglicano se unen covalentemente a otros aminoácidos de
las cadenas vecinas. Esto resulta en una estable estructura reticulada. La enzima que cataliza la
formación de esta unión Se llama transpeptidasa y está situado en el interior citoplásmica
membrana. El antibiótico se une a la penicilina inhibe esta enzima. Por esta razón, la enzima es
también llamada proteína de unión a la penicilina.

La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen microscópico de las bacterias.
Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden detectarse con este método. Las únicas
excepciones son:
 Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las células huésped (p.
ej., clamidias).
 Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).
 Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el microscopio óptico (p.
ej., espiroquetas).
 Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los colorantes (p. ej.,
mycobacterias).

Página 4


MATERIALES:
 Portaobjetos
 Cubreobjetos
 Asas de inoculación
 Mechero Bunsen
 Pipetas
 Hisopos
 Colorantes

PROCEDIMIENTO:
El procedimiento clásico de la tinción de Gram consiste en fijar el material orgánico a la superficie
del portaobjetos del microscopio ya por calor o con metanol.
Después de la fijación el primer paso en la tinción de Gram es la aplicación del colorante principal
cristal violeta (metil rosanilina o violeta de genciana). Luego se aplica un mordiente, el yodo de
Gram (lugol), para que el colorante alcalino se una a la pared celular a través de enlaces químicos.
La decoloración distingue las bacterias grampositivas de las gramnegativas. Después de la
decoloración los microorganismos aparecen como grampositivos retienen el cristal violeta y los
gramnegativos lo pierden. El agregado colorante de contraste safranina (Contratinción) teñirá de
color rosa o rojo las bacterias gramnegativas claras.

PRINCIPIO:
Las diferencias de composición de las paredes de las bacterias grampositivas, que contienen una
gruesa capa de peptidoglucano con numerosos enlaces cruzados de acido teicoico, y las paredes
de las células gramnegativas, en las que la capa de peptidoglucano es más delgada, explican las
diferencias de la tinción de Gram entre estos dos grupos principales de bacterias es probable que
la gran cantidad de enlaces cruzados de acido teicoico de los microorganismos gram positivos
contribuya a su capacidad de resistir la decoloración con alcohol.(Fig. 2) Si bien el colorante de
contraste puede ser captado por los microorganismos gram positivos, su color violeta no se altera.

Página 5


Fig. 2.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y GRAM(-).

*Los microorganismos gram positivos que perdieron la integridad de la pared celular debido al
tratamiento antibiótico, al envejecimiento o a la acción de enzimas autolíticas permiten que el
violeta se elimine durante la decoloración y pueden aparecer como gram variables, con algunas
células coloreadas de rosa y otras de violeta.

Sin embargo, con propósitos de identificación, estos microorganismos se consideran gram
positivos verdaderos. Por otro lado, las bacterias gram negativas raras veces (o nunca) retienen el
cristal violeta si el procedimiento de tinción se ha realizado de manera apropiada.

Las células huésped, como los eritrocitos y los leucocitos (fagocitos), pierden el cristal violeta con
la decoloración y aparecen de color rosa en los frotis preparados y teñidos de manera correcta.

OBSERVACION DE LA TINCION DE GRAM.
Una vez teñido el frotis se observa con el objetivo de inmersión (1.000x). Cuando el material
orgánico se tiñe con Gram (p. ej., frotis directo) el portaobjetos se evalúa en busca de la presencia
de células bacterianas así como de las reacciones Gram, (Fig. 3) En el análisis de muestras clínicas
suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
 Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.
 Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos
identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos
bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas
que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la
atmósfera de incubación.

Página 6


A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos:
 Los cocos son de forma esférica
 Los bacilos poseen forma alargada
 Los cocobacilos
 Los vibriones que son bacilos en forma de coma o curvados,
 Los espirilos, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son
blandas y onduladas
Pueden aparecer agrupados de diferente forma:
 Aislados después de la división celular (Micrococos),
 Aparecer por pares Diplococos,
 Formar cadenas Estreptococos, o
 Agruparse de manera irregular Estafilococos.
 Los bacilos en general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en
empalizada.
La tinción de gram proporciona una cantidad relativa de las bacterias infectantes.

Clasificación de las bacterias de acuerdo a su morfología
agrupación.
Página 7


Esta información a menudo proporciona un diagnostico preliminar con respecto a los agentes
infecciosos y con frecuencia se utiliza para el tratamiento directo inicial del paciente.

Si bien la evaluación de la tinción de Gram del frotis directo se utiliza de rutina como una ayuda en
el diagnostico de las infecciones bacterianas, es posible que se detecten y no deben ignorarse
hallazgos inesperados pero importantes de otras etiologías infecciosas. Por ejemplo, las células y
los elementos micóticos por lo general se tiñen como grampositivos pero pueden captar el cristal
violeta de manera deficiente y aparecer como gram variables (p. ej., rosa y violeta) o gram
negativos. Dado que con la tinción de Gram pueden detectarse otros agentes además de las
bacterias:
 Como células inflamatorias (PMN o mononucleares)
 Elementos sanguíneos (eritrocitos)
 Restos celulares o mucosos (detritus celulares)

TINCIÓN DE GRAM DE LAS BACTERIAS QUE CRECEN EN CULTIVOS. (Frotis indirectos).
La tinción de Gram también desempeña un papel clave en la identificación de las bacterias en
crecimiento en cultivos. De manera similar a los frotis directos, en los preparados a partir del
crecimiento bacteriano se evalúan las reacciones de Gram, las morfologías y no es valorable las
disposiciones (agrupación) de las células bacterianas. Si se va a teñir más de una muestra en el
mismo portaobjeto, puede utilizarse un lápiz de cera para crear divisiones.es útil dibujar una
especie de “mapa” de ese portaobjetos de modo que los resultados de las diferentes tinciones de
Gram puedan registrarse de manera organizada. Los resultados del examen del frotis se utilizaran
para determinar comprobaciones ulteriores para la identificación y la caracterización de los
microorganismos aislados a partir de la muestra del paciente.

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN
La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial que se basa en que las
paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena
larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración
con alcohol-acido, después de la tinción con colorantes básicos. Las micobacterias absorben
los colorantes solo muy lentamente debido a la elevada proporción de ceras y lípidos en la
pared celular. Para acelerar la absorción del colorante fuscina y así la formación del complejo
micolatofusina en la pared celular, se calienta la solución de fuscina fenicada aplicada sobre el
preparado normalmente hasta la
formación de vapores. Una vez que las
micobacterias han absorbido el colorante,
difícilmente lo ceden a pesar del
tratamiento con solución decolorante
alcohol-ácido clorhídrico. Por esto se
denominan bacilos alcohol acido
resistente o BAAR y aparecen en el
preparado microscópico teñidas de rojo,
mientras que todos los microorganismos
no resistentes a los ácidos se tiñen de
acuerdo con la contratinción.1 Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del

Página 8


diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos ácido-alcohol resistentes,
tales como Mycobacterimum tuberculosis son patógenos muy importantes para los humanos.
Las micobacterias no constituyen el único grupo que tienen propiedades alcohol-acido
resistentes. Las especies de Nocardia y Rhodococcus poseen una alcohol-acido resistencia
parcial así como Legionella micdadei causante de neumonía. Los quistes de los géneros
Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia definida a las tinciones con acido alcohol

Pared Celular de las bacterias Acido- Alcohol Resistentes (BAAR).
Químicamente, la pared celular de los BAAR consiste en un esqueleto formado por dos tipos de
polímeros, unidos covalentemente entre sí:
 Un peptidoglucano especial (la diferencia más importante es que en vez de N-acetil
murámico existe N-glucolil-murámico);
 un arabinogalactano de gran peso molecular.7

Ambos polímeros se encuentran enlazados a través de fosfodiéster entre una unidad de murámico
y una de las arabinosas. Pero a su vez, este esqueleto se une covalentemente a los ácidos
micólicos.7 Los ácidos micólicos son ß-hidroxiácidos grasos ramificados en a, cuya longitud de
cadena es grande (desde C78 a C91 en Mycobacterium). Están unidos al esqueleto de la P.C. de
forma uniforme, a través de enlaces con los -OH en 5 de las unidades de arabinosa.7 Por lo tanto,
el esqueleto de la P.C. de estas bacterias consiste en: peptidoglucano-arabinogalactano-ácidos
micólicos. Pero aparte de este esqueleto complejo, la P.C. de las bacterias ácido-alcohol resistente
exhibe una variedad de lípidos:

1) Glucolípidos:
a) Micolatos de trehalosa: Constituyen el llamado factor de crecimiento en cuerdas, debido a
que son responsables de la agregación de los individuos bacterianos en forma de “cuerdas”.
b) Sulfolípidos de trehalosa: están localizados en la periferia de la P.C., y parecen ser
importantes factores de virulencia. En Mycobacterium tuberculosis estos sulfolípidos de trehalosa
funcionan como evasinas, es decir, facilitan el que la bacteria escape a la acción de los macrófagos
inhibiendo la fusión del fagosoma con el lisosoma, lo cual puede explicar el hecho de que estos
microorganismos tengan éxito como parásitos intracelulares.
c) Micósidos: Localizados en la periferia, consisten en la unión por enlace éster entre ácidos
micólicos y azúcares (incluyendo ácidos urónicos, desoxiosas, aminozúcares, etc.).

2) Ceras: Unión de ácidos micólicos con tioceroles (alcoholes ramificados de alto peso molecular).7
El alto contenido en lípidos confiere una serie de propiedades a estas bacterias (aparte de la ácido-
alcohol resistencia ya citada): aspecto y consistencia cérea de sus colonias; crecen formando
grumos en medios líquidos; gran impermeabilidad de la P.C., que a su vez condiciona una gran
resistencia a la desecación y gran resistencia a sustancias antibacterianas (detergentes, oxidantes,
ácidos, bases, etc).5

Página 9

Práctica 3 – Técnica de Tinción – Gram P á g i n a | 10

LA MUESTRA.
La muestra más examinada es el esputo debido a que, la tuberculosis pulmonar es la enfermedad
más frecuente. Sin embargo, dado que el micobacterium puede afectar a cualquier órgano, con
menor frecuencia puede requerirse la investigación de muestras muy variadas como: orina, líquido
cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias de
piel, hueso. Estas muestras de lesiones extrapulmonares así como las pulmonares deben
procesarse también por cultivo.4

EL ESPUTO.
El envase.
Debe tener las siguientes características:
• Boca ancha: de no menos de 50 mm de diámetro
•Capacidad entre 30 y 50 ml: para facilitar que el paciente pueda depositar la expectoración con
facilidad dentro, sin ensuciar sus manos o las paredes del frasco y para que en el laboratorio se
pueda seleccionar y tomar la partícula más adecuada, con comodidad, para realizar el extendido.
• Cierre hermético: con tapa a rosca, para evitar derrames durante el transporte y la producción
de aerosoles cuando se abre en el laboratorio.
• Material plástico transparente, resistente a roturas, para poder observar la calidad de la muestra
cuando la entrega, evitar roturas y derrames de material infeccioso y para que pueda ser
desechado.4

Página 10


Obtención espontánea del esputo.
Para la recolección de las muestras:
• Elegir un lugar bien ventilado y que ofrezca privacidad; puede ser una habitación bien ventilada y
con acceso de luz natural (sol) o algún lugar abierto no concurrido.2
• Entregar el envase de recolección ya rotulado con su nombre o número de identificación y el
servicio que solicita. Estos datos deben ser escritos en la pared del frasco y no en la tapa para
evitar errores, con rótulos que no se despeguen o con lápiz indeleble.
• Obtener una buena muestra de esputo instruyendo al paciente con
lenguaje simple y comprensible para que:
- inspire profundamente llenando sus pulmones de aire tanto como
sea posible
- retenga el aire un momento (10 a 15 segundos)
- expulse luego la expectoración con un esfuerzo de tos, tratando de
arrastrar las secreciones del pulmón
- recoja el esputo producido dentro del envase tratando de que entre
en su totalidad, sin manchar sus manos o las paredes externas del frasco
- repita esta operación otras dos veces colocando todas las secreciones en el mismo frasco
- limpie el exterior del envase con un pañuelo de papel y se lave las manos con agua y jabón

CALIDAD DE LA MUESTRA
La muestra de esputo mucopurulenta, proveniente de árbol bronquial, es la que asegura mayor
probabilidad de que se puedan observar bacilos
Una buena muestra tiene aproximadamente 3 a 5ml, es generalmente espesa y mucoide. Puede
ser fluida con partículas de material purulento. El color es variable (blanco, amarillento y hasta
verdoso). A veces son sanguinolentas.
Las secreciones nasales, faríngeas o la saliva no son buenas muestras para investigar tuberculosis,
aunque es conveniente examinarlas, de todas formas, porque siempre existe la posibilidad de que
contengan parte de la expectoración o bacilos expulsados por la tos que hayan quedado en la
boca, nariz o faringe.3

Mucopurulenta Sanguinolenta Mucosa Salivosa

Si las muestras de esputo no van a ser procesadas en el día, es aconsejable introducir cada envase
en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa encima de la tapa, de manera que quede sujeta
firmemente. Las muestras deben ser conservadas en refrigerador, preferentemente dentro de la
caja de plástico. Si no se cuenta con refrigerador, ubicarlas en un lugar fresco y protegidas de la
luz.4

Página 11


LAVADO GÁSTRICO
Se emplea especialmente en niños que no saben expectorar para detectar bacilos en el esputo
ingerido, mientras se encuentran en el estómago. La baciloscopia de lavado gástrico tiene valor
relativo. Por un lado los pacientes infantiles presentan lesiones que contienen pocos bacilos y por
lo tanto es poco probable detectarlos. Por otro, es posible que la muestra contenga micobacterias
ambientales provenientes de alimentos que pueden inducir a resultados falsos positivos. Se
recomienda utilizar esta muestra sólo para diagnóstico y no en el control del tratamiento.

OTRAS MUESTRAS
Todas las muestras extrapulmonares deben cultivarse: en algunos casos porque la escasa cantidad
de bacilos de los Micobacterium presentes sólo podrá ser detectada por cultivo, en otros para
confirmar o descartar que la muestra contenga micobacterias ambientales saprofitas (como en el
caso de la orina que resulta con baciloscopia positiva) o, excepcionalmente patógenas. La
baciloscopia de los líquidos con volumen mayor a 1 ml debe ser realizada luego de centrifugarlos
15 minutos a 3000 g, y la de tejidos después de disgregar el material. Por esta razón es altamente
recomendable que la baciloscopia de estas muestras sea realizada en el mismo laboratorio que
cultivará la muestra.
Orina
• Número de muestras: mínimo tres y máximo seis.
• Cantidad y momento de recolección: previa higiene externa con agua, el paciente debe recoger
no menos de 50 ml del segundo chorro de la primera micción de la mañana. Se desecha la primera
parte para disminuir la carga de gérmenes contaminantes.
• Envase: de 300-500 ml, limpio y de boca suficientemente ancha para posibilitar la recolección
directa.
• Conservación: la muestra debe ser procesada inmediatamente porque el pH ácido afecta la
viabilidad del bacilo. Si se deba a guardar debe ser conservado entre 4 y 9ºC por no más de 12
horas hasta el momento del envío. El diagnóstico debe ser completado con cultivo e identificación
del bacilo observado.

Líquido cefalorraquídeo
La obtención de este material está reservada a personal médico especializado.
• Cantidad de muestras: todas las que el médico crea conveniente; cuanto mayor es la cantidad de
muestras procesadas, mayor es la posibilidad de hallazgo de bacilos.
• Envase: estéril de 10-15 ml de capacidad y con tapa a rosca de cierre hermético.
• Uso de anticoagulante: no es necesario
• Conservación: es conveniente procesar el material inmediatamente o conservado a temperatura
ambiente por no más de 12 horas si se va ha realizar cultivo y si se va ha realizar solo baciloscopia
se puede refrigeras de 2 a 8oc.

Líquidos pleural, ascítico, pericárdico, articular y otros
La obtención de estos materiales está reservada al personal médico.
• Número de muestras: no mas de tres muestras
• Envase: estéril, de capacidad adecuada para la cantidad de la muestra
• Uso de anticoagulante: puede agregarse tres gotas de citrato de sodio al 10% o EDTA (ácido
etilén diamino tetraacético) por cada 10 ml de muestra.
• Conservación: enviar lo más rápido posible al laboratorio que realizará el cultivo, eventualmente
conservar en refrigeración por no más de 12 horas solo para realizar baciloscopia.

Página 12


Pus
Tener presente que normalmente pus no se cultiva por que es producto de la batalla en
investigación de micobacterias por ser un agente intracelular hay la posibilidad de crecimiento
• Envase: estéril Es preferible no usar hisopos para evitar la desecación. En caso de utilizarlos,
antes de la toma de muestra deben ser humedecidos con solución fisiológica o agua destilada
estéril.
• Conservación: La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio que hace el cultivo o
ser conservado refrigerado y al abrigo de la luz hasta su envío solo para baciloscopia

Sangre
La investigación de sangre está indicada para pacientes con inmunosupresión severa, como en
casos con infección por HIV con bajo recuento de linfocitos totales o CD4, y con baciloscopias de
muestras respiratorias reiteradamente negativas.
• Cantidad y momento de recolección: dos muestras de 10 ml de sangre venosa en días
consecutivos.
• Esterilidad y bioseguridad: utilizar guantes, desinfectar previamente la piel del área donde se
efectuará la extracción con alcohol iodado.
• Envase: los específicos para hemocultivo dependiendo de la casa fabricante.
• Conservación: Si no puede ser enviada la muestra inmediatamente al laboratorio a 18 a 22º C
hasta el momento del envío al laboratorio

PREPARACION Y FIJACION DEL EXTENDIDO
Si se observan las medidas de bioseguridad recomendadas. La mejor medida para evitar riesgos y
errores, que pueden originar resultados imprecisos o falsos, es la sistematización de las
actividades siguiendo las siguientes indicaciones:
• Lavarse las manos (clínico húmedo)
• Colocarse la bata o guardapolvo, guantes, mascarilla N95 y gorra
• Ubicar en la mesada de superficie lisa, papel embebido en hipoclorito de sodio al 1% sólo lo
necesario para realizar el extendido, colocarlo detrás del mechero
Materiales.
- mechero
- aplicadores
- soporte para los extendidos
- lápiz para marcar láminas portaobjetos
- láminas portaobjetos nuevos, previamente sumergidos en alcohol y secados al aire.
• Ubicar al lado de la mesa el recipiente para descartar el material con tapa
• Ordenar las muestras según su número.
• Para cada muestra, numerar una lámina portaobjetos,
• Usar una lámina para cada muestra. No colocar extendidos de más de una muestra en una
lámina.
• Tomar la muestra y la lámina correspondiente y colocarlas detrás del mechero de manera que la
llama quede entre el operador y el frasco. Esta posición protegerá al laboratorista de posibles
formaciones de aerosoles al abrir el frasco.
• Destapar con cuidado el envase.
• Partir un aplicador en dos, tratando de que las puntas queden ásperas.

Página 13


• Tomar una parte del aplicador seleccionar la partícula más densa o purulenta de la muestra de
esputo. Enrollarla en una de los dos partes del aplicador con la ayuda de la otra. Si la muestra
contiene varias porciones mucopurulentas, tratar de mezclarlas con movimientos muy suaves del
palillo y luego tomar una porción de la mezcla. Si sólo hay pequeñas partículas purulentas, escoger
tres o más y mezclarlas en el mismo portaobjetos para homogeneizarlas
. Colocar la(s) partícula(s) seleccionada(s) sobre el portaobjetos y extenderla(s) con el aplicador
con movimientos suaves, circulares del centro a la periferia, tratando de dispersarla en forma
homogénea en el centro de la lámina, dibujando un círculo u óvalo de 2 cm de largo por 1
cm de ancho, sin llegar a los bordes de la lámina para evitar que el operador se contamine al
manipularla.
• Verificar que el extendido tenga grosor homogéneo y adecuado. Si es demasiado fino, es posible
producir un resultado falso negativo. Si es muy grueso, el material puede desprenderse durante la
coloración o puede resultar difícil la visualización de bacilos debajo de una capa gruesa de mucus.
Se puede adquirir entrenamiento poniendo un papel impreso debajo del extendido. El grosor
adecuado es el que permite ver pero no leer un texto impreso a través del preparado. Una vez
adquirido el entrenamiento, es preferible no repetir rutinariamente este proceso para evitar tocar
y transferir muestras con los papeles impresos.
• Dejar el extendido en un soporte ubicado al costado de la mesada para que se seque a
temperatura ambiente. El extendido no debe ser calentado a la llama mientras esté húmedo pues
el calor fuerte altera la estructura de los bacilos y su posterior tinción; además puede generar
aerosoles.

PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION ZIEHL- NEELSEN
MATERIALES:
Portaobjetos
Mechero
Asa de siembra
Pipetas
Pinzas de madera
Microscopio óptico
Equipo de tinción (barras paralelas)
REACTIVOS:
 Fucsina fenicada básica
 Alcohol acido 3,0 %
 Azul de metileno
Muestras de esputo o orina
Aceite de inmersión

COLORACIÓN EN CALIENTE
PROCEDIMIENTO: (ver anexo 1)
Se fija la muestra al portaobjetos con calor o alcohol.
Se cubre el frotis con papel filtro
Colocamos el reactivo de colorante de carbolfuscina cubriendo todo la placa
Se calienta con suavidad hasta la aparición de vapores mediante flameo por debajo de la rejilla de
sostén con un mechero de gas, si el colorante se evapora demasiado se coloca mas
Se deja actuar el colorante sobre el portaobjetos durante 5 minutos, sin calentar.

Página 14


Se retira el papel filtro, inclina el frotis para eliminar el exceso de colorante y se lava con agua
destilada con un chorro constante y no fuerte.
Se decoloran con acido alcohol al 3,0 % durante 3 minutos. Se lavan los frotis con agua destilada y
se los inclina para escurrir el resto de agua.
Se cubren los frotis con reactivo de azul de metileno durante 1 minuto.
Se lavan con agua destilada y se dejan secar al aire.
Se examinan con aceite de inmersión en búsqueda de BAAR5.

COLORACION EN FRIO
PROCEDIMIENTO:
Se fija la muestra al portaobjetos con calor o alcohol.
Se cubre el frotis con papel filtro
Colocamos el reactivo de colorante de carbolfuscina cubriendo todo la placa
Se deja actuar el colorante sobre el portaobjetos durante 30 minutos, sin calentar.
Se retira el papel filtro, inclina el frotis para eliminar el exceso de colorante y se lava con agua
destilada con un chorro constante y no fuerte.
Se decoloran con acido alcohol al 3,0 % durante 3 minutos. Se lavan los frotis con agua destilada y
se los inclina para escurrir el resto de agua.
Se cubren los frotis con reactivo de azul de metileno durante 1 minuto.
Se lavan con agua destilada y se dejan secar al aire.
Se examinan con aceite de inmersión en búsqueda de BAAR5.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DEL BACILO DE LA TUBERCULOSIS
Los bacilos acidorresistentes tienen entre 1 y l0 μm de largo. Con la coloración de Ziehl Neelsen se
observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente
contra el fondo azul. A veces se observan con gránulos o cuentas intensamente coloreados en el
interior. En la muestras de esputo pueden presentarse aislados, apareados o agrupados. Es muy
difícil distinguir el bacilo de la tuberculosis de otras micobacterias por examen microscópico.
Algunas micobacterias que no son M. tuberculosis pueden aparecer como bastones muy largos o
como bacilococos.
Otros microorganismos pueden presentar distintos grados de ácidorresistencia, como
Rhodococous spp., Nocardía spp., Legionella spp. y los quistes de Críptosporidio e Isospora spp. Se
observan como cocos, bacterias con formas variadas (pleomórficas), filamentos que a veces están
cortados, o como esferas de gran tamaño si se las compara con las bacterias. De todas formas, es
poco frecuente encontrar más de
10 microorganismos ácido alcohol resistentes diferentes a M. tuberculosis en las muestras de
esputo. Cuando el baciloscopista observa alguno que no tiene forma de bastón debe consultar al
supervisor

RESULTADOS:
Positiva bacilos rojos delgados en rosario BAAR
Negativo ausencia de bacilos rojos o rosadosen 100campos no BAAR

Un hallazgo positivo significa “presencia de bacilos alcohol acido resistentes” y un hallazgo
negativo significa “ausencia de bacilos alcohol acido resistentes”.

Página 15


AUTOEVALUACION E INVESTIGACION
1. Cite 2 ejemplos de microorganismos gram positivos y gram negativos.
2. Enumere 3 diferencias entre gram positivos y gram negativos
3. VISITE EL SIGUIENTE LINK EN YOUTUBE:
http://www.youtube.com/watch?v=NmB3giTOBQc
4. Cual es la utilidad de la Baciloscopía en el diagnostico de Tuberculosis?
5. Cuando se define que una muestra de esputo es adecuada?.

BIBLIOGRAFÍA
1. Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana,
2. Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual moderno, México,
México 2002.
3. Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial Panamericana, Buenos
Aires – Argentina, 2 004.
4. Salazar Wilson, Guías de práctica de Laboratorio de Microbiología, Depart. de
publicaciones de la Facultad de Ciencias Médicas, Quito – Ecuador, 2007.
5. 2.- Prácticas de Microbiología. Departamento de Microbiología y Genética Universidad de
Salamanca
6. 3.- Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual moderno,
México, México 2002
7. 4.- SEQUEIRA, L. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis normas y
guía técnica. OPS 2008
8. 5.- Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial Panamericana, Buenos
Aires – Argentina, 2 004.
9. 6.- Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana, 110 − 111.
10. 7. - Mandell, Bennett, & Dolin: Principles and Practice of Infectious Diseases 6th ed.
11. Copyright © 2005. Churchill Livingstone, An Imprint of Elsevier.
12. 8.- http://www.opsecu.org/informativo/informativo5/tuberculosis.htm

Página 16


Universidad Central del Ecuador
Facultad de Ciencias Médicas
Escuela de medicina

PRE-REQUISITOS DE MICROBIOLOGIA
NOMBRE: DOCENTE:

FECHA: AYUDANTE:

PARALELO: GRUPO:

PREGUNTA 1.

PREGUNTA 2

PREGUNTA 3

PREGUNTA 4

Página 17

Practica 3 tinciones

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

Destacado

Similar a Practica 3 tinciones

Practica 3 tinciones