Informe de laboratorio de Microbiologia, útil para estudiantes de medicina, biología y microbiologia

1. INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA I
ELABORACIÓN DE FROTIS Y COLORACIÓN DE GRAM
Rodriguez Avila María José ª
ª: Estudiante de Microbiología I, de la Universidad de Sucre, en el programa de Medicina.
RESUMEN
Debido a que las bacterias y otros microorganismos tienen un tamaño muy pequeño, se
requiere de tinciones biológicas para visualizarlos, demostrar detalles de su estructura interna,
o algunas funciones fisiológicas; además estos colorantes, son utilizados como indicadores de
pH en los medios de cultivos, y como indicadores REDOX para demostrar la presencia o
ausencia de condiciones de Anaerobiosis. Estas herramientas han sido de gran ayuda para el
análisis de todos los microorganismos, ahí radica la importancia de realizar correctamente las
técnicas de tinción, en este informe de laboratorio se habla específicamente de coloración de
Gram.
OBJETIVOS
1. Elaborar correctamente frotis a
partir de colonias obtenidas en
cultivo o de muestras clínicas
presentes en el laboratorio.
2. Manipular debidamente cada uno
de los materiales de uso recurrente
en las prácticas de laboratorio, con
base a las normas ya establecidas.
3. Conocer los principios de la
coloración de Gram, para
posteriormente realizarla.
4. Observar bacterias en
preparaciones coloreadas con la
coloración de Gram.
5. Identificar qué tipo de bacteria es,
según los criterios de reacción al
Gram.
MARCO TEORICO
El tamaño de la mayoría de las células
bacterianas es tal que resultan difíciles de
ver con el microscopio óptico. La principal
dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea. El modo
más simple de aumentar el contraste es la
utilización de colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el
contraste de las células para la microscopía,
son suficientes los procedimientos que
usan un solo colorante llamado de tinción
simple. Sin embargo, a menudo se utilizan
métodos que no tiñen de igual modo todas
las células, es el proceso denominado
tinción diferencial. Uno muy usado en
microbiología es la tinción Gram.
Basándose en su reacción a la tinción
Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta
tinción tiene gran importancia en
taxonomía bacteriana ya que indica

2. diferencias fundamentales de la pared
celular de las distintas bacterias.
Se destaca que una característica
taxonómica importante de las bacterias es
su respuesta a la tinción de Gram. Las
propiedades de tinción de Gram parecen
ser fundamentales, porque la reacción de
Gram se correlaciona con muchas otras
propiedades morfológicas en formas con
relación filogenética. Un microorganismo
que en potencia es positivo para la tinción
de Gram puede parecerlo sólo bajo
condiciones ambientales particulares y en
un cultivo joven.(1)
Mientras que las bacterias gramnegativas
son constantes en su reacción, los
microorganismos grampositivos pueden
presentar respuestas variables en ciertas
condiciones (son gramlábiles). Por
ejemplo, los cultivos viejos de algunas
bacterias grampositivas pierden la
propiedad de retener el cristal violeta, y en
consecuencia, se tiñen por la safranina
apareciendo como gramnegativas. Análogo
efecto se produce en ocasiones por cambio
en el medio del organismo, o por ligeras
modificaciones en la ejecución de la
técnica. Por este motivo, es preciso
atenerse, en la práctica, al procedimiento
establecido. (2)
Para explicar el mecanismo de la tinción de
Gram se han propuesto varias hipótesis
fundadas en la naturaleza química de las
paredes celulares de los microorganismos.
 Bacterias Gram +
Las bacterias Gram positivas poseen una
pared celular gruesa constituida por
peptidoglicano, pero no cuentan con
membrana celular externa.
Fig 1. Esquema estructural de la pared
celular de bacteria Gram +. Imagen en
color en: www.medigraphic.com/rid
Las bacterias G+ retienen el cristal-violeta
después de la decoloración y aparecen de
color azul intenso (purpura).
 Bacterias Gram -
La pared celular de las bacterias Gram
negativas está constituida por una capa fina
de peptidoglicano y una membrana celular
externa, cuyo componente estructural
único son los lipopolisacáridos.
Fig 2. Esquema estructural de la pared
celular de bacteria Gram - . Imagen en
color en: www.medigraphic.com/rid
Las bacterias G- no son capaces de retener
el cristal-violeta después de la decoloración
y son teñidas de rojo con safranina. (3)

3. MATERIALES
 Colorantes para la coloración de
Gram:
 Cristal Violeta
 Solución de Lugol
 Alcohol -Acetona
 Safranina
 Cultivos de bacterias (cocos y
bacilos)
 Láminas portaobjetos
 Laminillas cubreobjetos
 Solución salina
 Mechero de gas
 Agua
METODOLOGIA
Inicialmente se elaboró el frotis del cultivo
suministrado por el laboratorio, siguiendo
los pasos:
1. Se calentó el asa de inoculación
hasta que estaba al rojo.
2. Se Tomó la porción de la muestra
(o una colonia del cultivo (
) que posteriormente se va a
examinar por medio de una asa o
escobillón
3. Se colocó la muestra sobre un
portaobjetos limpio y sin grasa,
debidamente marcado
4. Debido a que la muestra no es
líquida, se colocó una pequeña gota
de solución salina sobre el
portaobjetos antes de realizar el
frotis; se trazó con la muestra un
espiral desde el centro hasta la
periferia.
5. Nuevamente se calentó el asa para
desinfectarla.
6. Dejar secar el frotis al medio
ambiente.
7. Para la fijación se pasó tres veces a
través de la llama con la muestra
hacia arriba.
Fig 3. Procedimiento del paso 1 al 6, para
la elaboración del frotis.
Posteriormente se realizó el procedimiento
para la coloración que se muestra a
continuación:
Fig 4. Esquema del Procedimiento de
coloración de Gram. Imagen en:
https://compendiomicrobiologia.wordpres
s.com/2014/03/09/staphylococcus-spp/
1. Se agregó el cristal violeta sobre el
portaobjetos y dejar actuar por 1
minuto.

4. Fig 5. Aplicación de Cristal Violeta
2. Enjuagar con agua corriente y dejar
escurrir
3. Después se agregó la solución de
lugol y dejar actuar por 1 minuto
Fig 6. Adición de lugol al
portaobjetos
4. Escurrir la solución y enjuagar el
portaobjetos con agua corriente
5. Se agregó el alcohol-acetona, hasta
que se decolorara completamente.
Fig 7. Decoloración con alcohol –
cetona.
6. Por último, se agregó la solución de
Safranina y dejar actuar por 5
segundos, enjuagar, escurrir y dejar
secar.
Fig 8. Laminas después de realizar la
tinción de Gram.
7. Se llevaron las láminas al
microscopio y se observó.
RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS
La coloración de Gram está constituida
por:
 Cristal Violeta: colorante primario
o básico, que se une a la pared celular
bacteriana. En este punto tanto bacterias
Gram + y Gram – estarán de color violeta.
 Lugol: solución de yodo, utilizado
como mordiente, el cual facilita la adhesión
del cristal violeta a la pared celular.
 Alcohol – Cetona: empleado para
aclarar, deshidrata las paredes de los
microorganismos grampositivos, tratados
con mordiente, y forma una barrera que la
laca no puede atravesar, porque loa poros
de la pared se cierran. En las células
gramnegativas, los lípidos de la pared (más
abundantes que en las células
grampositivas) se disuelven por este
tratamiento, lo que permite el escape del
complejo de cristal violeta.

5. En este punto las Gram + permanecen
de color violeta, y las Gram – se decoloran.
 Safranina: Es un colorante
secundario, que imparte una coloración de
contraste o contracolor (color rosado).
Finalmente las Gram – se encontraran
teñidas de rosado y las Gram + violetas. (4)
Luego de hacer la tinción fueron
observados los microorganismos en el
microscopio óptico para ver sus
características morfológicas, con aceite de
inmersión fue posible verlos en aumento
de 100x.
Fig 9. Aumento de 100x de reacción + al
Gram, lo que indica la presencia de una
bacteria Gram +
Se observan bacterias en forma de cocos,
agrupadas a modo de racimos de uva,
fuertemente teñidas de violeta, lo que es
indicativo de bacterias Gram +, es decir; su
pared celular está formada por una gruesa
capa de peptidoglucano.
Es realmente difícil identificar el género y
especie de unos microorganismos con solo
su morfología, ya que existen muchas otras
características distintivas entre ellos.
En el caso de las Bacterias Gram +
comparten la características de constar con
de una pared gruesa que establece la forma
de la célula y una membrana citoplásmica.
Además estas pueden ser encapsuladas o
no, en cuanto a morfología; son esféricas,
bacilares o filamentosas; los bastones y
filamentos son ramificados o no
ramificados; y quizá muestren una
ramificación verdadera. Incluso algunas
bacterias de esta categoría producen
esporas, por ejemplo (1)
El resultado obtenido se corrobora gracias
a que el cultivo de donde se extrajo la
muestra para la coloración corresponde a
Puede producir una amplia gama de
enfermedades, que van desde infecciones
cutáneas y de las mucosas relativamente
benignas, tales como foliculitis,
forunculosis o conjuntivitis, hasta
enfermedades de riesgo vital, como
celulitis, abscesos profundos, osteomielitis,
meningitis, sepsis, endocarditis o
neumonía. Además, también puede afectar
al aparato gastrointestinal, ya sea por
presencia física de o
por la ingesta de la enterotoxina
estafilocócica secretada por la bacteria. (5)
Las cepas habituales de
son resistentes a la penicilina,
dejando como los antibióticos más eficaces
para combatirlos a los aminoglucósidos, las
cefalosporinas, la oxacilina o la nafcilina.
(6)
Morfológicamente es un coco inmóvil, de
0.8 a 1 micrómetro de diámetro, que se
divide en tres planos para formar racimos
de uvas, responde positivamente a la
tinción de Gram, es aerobio y anaerobio
facultativo por lo que puede crecer tanto en

6. una atmósfera con o sin oxígeno, no
presenta movilidad ni forma cápsula.
Posee un endopigmento color amarillo -
naranja a blanco porcelana color dorado al
cual se le conoce como” ”. Fermenta
glucosa, lactosa y maltosa. El crecimiento
ocurre en un amplio rango de temperatura
6,5 a 50º C, siendo óptimo 30-40º C. (7)
Sus colonias lisas, brillantes y convexas.
Fig 10. Aumento de 100x de reacción - al
Gram, lo que indica la presencia de una
bacteria Gram –
Se observan bacterias en forma de
cocobacilos de color rosa, por lo que se
identifica que esta muestra fue obtenida de
una colonia de bacterias Gram -, con una
delgada capa de peptidoglucano en su
pared celular.
Del mismo como que se comentó
anteriormente sobre las bacterias Gram +,
sucede con las Gram -, presentan amplios
aspectos tanto morfológicos como
funcionales que hacen difícil identificarlas
tan solo con este método.
El cultivo de esta muestra es de
es decir; bacterias Gram -.
es la bacteria anaerobia facultativa
comensal más abundante de la microbiota;
asimismo, es uno de los organismos
patógenos más relevantes en el hombre,
tanto en la producción de infecciones
gastrointestinales como de otros sistemas
(urinario, sanguíneo, nervioso). (8)
La es un Bacilo Gram
negativo que no forma esporas, miden 0.5
µ de ancho por 3 µ de largo y se encarga de
producir vitamina B y K.
Las colonias de en agar E.M.B.
tienen 2 a 4 mm de diámetro, un centro
grande de color oscuro e incluso negro, y
tienen brillo verde metálico cuando se
observan con luz refleja. En agar
MacConkey las colonias son rojas con halo
turbio. (9)
Por último, es importante resaltar la
relevancia que tiene la coloración de Gram
en la práctica de microbiología, ya que
permite identificar el tipo de
microorganismo (en este caso fueron;
cocos y cocobacilos), Reacción al Gram
(Bacterias Gram + y Gram -) y respuesta
leucocitaria.
CAUSAS DE ERROR
Una reacción Gram positiva falsa
 Frotis fijado antes de estar seco o
demasiado grueso
 Colorante Cristal-Violeta con
sedimento (filtrarlo).
 El Lugol no se escurrió
completamente.
 No se decoloró suficientemente.
 La solución de Safranina se dejó
por demasiado tiempo.
Una reacción Gram negativa falsa

7.  No se dejó actuar suficiente la
solución de yodo.
 La preparación se sobre-decoloró.
CONSULTA
1. Investigar causas que alteran la
coloración de Gram
I: Edad de la bacteria. II: Errores del
operador. III: Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad de la tinción de
Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar
según la edad de las células (cultivos viejos
de bacterias Gram positivas pueden perder
capas de peptidoglicanos y teñirse como
Gram negativos) y la técnica empleada (al
decolorar por un tiempo muy prolongado
se puede correr el riesgo que bacterias
Gram positivas se tiñan como Gram
negativas). Por esta situación, junto a la
muestra deben teñirse controles con
bacterias Gram positivas (por ejemplo
Staphylococcus aureus) y Gram negativas
(por ejemplo, Escherichia coli).
2. Cuáles son las bacterias
resistentes a la coloración de
Gram?
Las siguientes bacterias de naturaleza Gram
positiva se tiñen como Gram negativas:
 Mycobacterias porque están
encapsuladas.
 Mycoplasmas, debido a que no
tienen pared.
 Formas L, ya que sufren pérdida
ocasional de la pared.
 Protoplastos y esferoplastos se da la
eliminación total y parcial de la
pared, respectivamente. (10)
3. ¿Qué fin tiene la fijación de las
muestras al realizar un frotis
bacteriano?
El Fijado al vidrio del portaobjetos se da
para poder aplicar los métodos habituales
de tinción que permiten la observación al
microscopio de las bacterias sin que la
muestra sea arrastrada en los sucesivos
lavados. La fijación de una extensión
bacteriana hace que las bacterias queden
inactivadas y adheridas al vidrio alterando
lo menos posible la morfología y bacteriana
y las posibles agrupaciones de células que
pudiera haber.
4. Mencione 4 géneros de
bacterias Gram + y Gram -.
Bacterias Gram +
• Responsable
de abscesos, dermatitis, infecciones
localizadas y posibles gastroenteritis.
• Causante
de infecciones supurativas en el trayecto
respiratorio, así como de fiebre reumática.
• Bacterias
responsables de los tétanos, entran al
cuerpo desde el suelo por traumatismos en
las extremidades.
• Se trata de la
conocida bacteria del ántrax, tanto en su
versión cutánea como en la pulmonar. (11)

8. Bacterias Gram –
• Habitante usual del
colon humano, está involucrada en las
llamadas “diarreas del viajero”, así como en
meningitis neonatal, sepsis e infecciones
urinarias.
• Bacteria
responsable de la enfermedad conocida
como fiebre tifoidea, suele transmitirse por
vía fecal-oral: contaminación de aguas,
mala disposición de excretas o higiene
defectuosa.
• Bacilo
usualmente aerobio, es responsable de
numerosas meningitis, otitis, sinusitis,
bronconeumonías, celulitis y artritis
séptica.
• . Causante de la
enfermedad conocida como Tos ferina, de
alta mortalidad infantil. (11)
CONCLUSIONES
 Es importante realizar minuciosamente
el procedimiento para la coloración de
Gram, para evitar resultados erróneos
 La muestra en fresco nos permite ver el
movimiento de los microorganismos
 Gracias a la coloración de Gram
podemos distinguir entre baterías Gram
+ y Gram -, también la morfología de las
mismas.

9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
1. JAWETZ, MELNICK Y ADELBERG.
MICROBIOLOGÍA MÉDICA. 25ava
edición. C.P. 01376, México, D.F.
Capítulo 2. Pág. 36.
2. Luis Esaú López-Jácome, Melissa
Hernández-Durán, Claudia Adriana Colín-
Castro, Silvestre Ortega-Peña, Guillermo
Cerón-González, Rafael Franco-Cendejas.
(marzo, 2014) Las tinciones básicas en el
laboratorio de microbiología. Obtenido de
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir
-2014/ir141b.pdf
3. Revista Portales Médicos (15 de marzo,
2013) Artículo de revisión. La coloración
de gram y su importancia en el diagnóstico
microbiológico. Obtenido de
http://www.revistaportalesmedicos.com/rev
istamedica/coloraciongramdiagnosticomicr
obiologico/
4. Jawest - Meinick y Edelberg, 16a
Edición- México - Manual Moderno
Microbiología Médica. Extraido de:
http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/mo
odle/pluginfile.php/231237/mod_resource
/content/0/2._PRACTICA_TINCIONES
_ESPECIALES_EN_MICROBIOLOGI
A.pdf
5. Hurtado, MP; de la Parte, MA; Brito A
(Julio de 2002). « :
Revisión de los mecanismos de
patogenicidad y la fisiopatología de la
infección estafilocócica.» (HTML). Rev
Soc Ven Microbiol (Venezuela: Scielo)
Pág. 22. Encontrado en:
https://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococc
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6. Lowy, Franklin D. (20 -agosto-1998).
« infections»
[Infección por ]
(PDF). NEJM (Massachusetts Medical
Society)Pág. 339. Extraído de internet:
https://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococc
us_aureus#cite_note-Lowy-3
7. Disponible en:
https://www.uv.mx/personal/sbonilla/files/
2011/06/Staphylococcus-aureus.pdf
8.Welch, R. A. (2007) «The genus
». En: Dworkin M.; Falkow, S.;
Eugene Rosenberg, E.; Schleifer, K.-H. y
Stackebrandt, E. (eds.) The Prokaryotes.
Volume 6: Proteobacteria: Gamma
Subclass. Springer-Verlag, Nueva York: 60-
71. Extraído de:
https://es.wikipedia.org/wiki/Escherichia_c
oli#Clasificaci.C3.B3n
Disponible en:
https://www.uv.mx/personal/sbonilla/files/
2011/06/Escherichia-coli-I.pdf
10. Gram, C. (1884). The differential
staining of Schizomycetes in tissue sections
and in dried preparations. Fortschritte der
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http://www.asmusa.org/ccLibraryFiles/FIL
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10. 11. Enciclopedia de Ejemplos (2017). "20
Ejemplos de Bacterias Gram positivas y
Gram negativas". Recuperado de:
http://www.ejemplos.co/20-ejemplos-de-
bacterias-gram-positivas-y-gram-negativas/