Este documento describe los procedimientos para realizar una tinción de Gram. La tinción de Gram es un método para diferenciar bacterias en dos grupos (Gram positivas y Gram negativas) basado en las propiedades de sus paredes celulares. El documento explica los pasos para realizar una tinción de Gram simple y una tinción de Gram compuesta, incluyendo la preparación de muestras, los reactivos utilizados y la interpretación de los resultados bajo el microscopio.

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ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO
CARRERA INGENIERÍA AGROPECUARIA
SANTO DOMINGO
Asignatura: Microbiología
Estudiante: Renato Andrade Cevallos
Fecha: Miércoles 22 de mayo del 2013
Práctica No.8

2. 1. TEMA
Tinción de Gram.
2. OBJETIVO GENERAL
Conocer las técnicas de preparación y observación microscópica de bacterias.
3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Aprender a desarrollar de manera adecuada la tinción de Gram
Observar y diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Estudiar las características morfológicas de diferentes géneros de bacterias
Determinar la reacción Gram negativa y positiva de bacterias.
4. REVISIÓN DE LITERATURA
La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX. La
Tinción de Gram (o método de Gram) es un método para diferenciar especies
bacterianas en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gram-negativas). El nombre
proviene de su inventor, Hans Christian Gram.
Tinción de Gram diferencia las bacterias por las propiedades químicas y físicas de sus
paredes celulares mediante la detección de peptidoglicano, que está presente en una
capa espesa en las bacterias Gram positivas. Los resultados Gram positivos se denotan
por un color púrpura / azul, mientras que las gram negativas son rosa / rojo.
La tinción de Gram es casi siempre el primer paso en la identificación de un organismo
bacteriano. Mientras que la tinción de Gram es una herramienta de diagnóstico valiosa,
tanto en entornos de investigación clínica, no todas las bacterias pueden ser clasificadas
definitivamente por esta técnica. Esto da lugar a grupos de Gram-variables y Gram-
indeterminado. (Forbes, 2009)
La Tinción de Gram es una técnica de laboratorio bacteriológico se utiliza para
diferenciar especies bacterianas en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gram-
negativas) sobre la base de las propiedades físicas de sus paredes celulares. La Tinción
de Gram no se utiliza para clasificar las arqueas, anteriormente arqueobacterias, ya que
estos microorganismos producen muy diversas respuestas que no siguen sus grupos
filogenéticos. (Cavallini, 2005 )
La tinción de Gram no es una herramienta infalible para el diagnóstico, identificación, o
filogenia, y es de uso muy limitado en la microbiología ambiental. Se ha sustituido en
gran medida por las técnicas moleculares, incluso en el laboratorio de microbiología
médica. Algunos organismos Gram son variables (que significa, que pueden manchar ya
sea negativo o positivo); algunos organismos no son susceptibles a la mancha ya sea
utilizado por la técnica de Gram. En un moderno laboratorio del medio ambiente o la
microbiología molecular, la mayoría identificación se realiza utilizando secuencias
genéticas y otras técnicas moleculares, que son mucho más específico e informativo que
la tinción diferencial. (Cavallini, 2005 )

3. Las bacterias Gram-positivas tienen generalmente una sola membrana rodeada por una
gruesa capa de peptidoglicano. Esta regla es seguida de dos filos-Firmicutes (a
excepción de las clases de Mollicutes y Negativicutes) y Actinobacteria. Por el
contrario, los miembros de la Chloroflexi (bacterias verdes no del azufre) son
monodermas pero poseen una capa delgada de peptidoglicano y pueden manchar
negativo, positivo o indeterminado. Los miembros del grupo Deinococcus-Thermus,
tiñen positivamente. (Forbes, 2009)
Las bacterias Gram-negativas poseen generalmente una fina capa de peptidoglicano
entre dos membranas (didermas). La mayoría son phyla bacteriana Gram-negativas,
incluyendo las cianobacterias, espiroquetas y bacterias verdes del azufre, y la mayoría
de Proteobacteria. (EUNED, 2004)
5. EQUIPOS:
Microscopio estereoscopio
Microscopio compuesto
Estufa de incubación
Estufa de esterilización
Cámara de flujo laminar
Autoclave
Cocineta eléctrica
6. MATERIALES:
Cultivos bacterianos
Placas porta objeto
Laminas cubre objeto
Vasos de precipitados
Kit de disección
Mechero de alcohol
Platos petri conteniendo medio de cultivo
Sacabocado
Asas de inoculación
Goteros
7. REACTIVOS E INSUMOS:
Alcohol antiséptico
Agua destilada
Cristal violeta
Alcohol cetona
Yoduro de potasio
Safranina

4. Aceite de inmersión
8. PROCEDIMIENTO:
Tinción simple
Se limpió bien las placas portaobjeto, eliminando la grasa y pelusas. Las grasas serán
eliminadas con xilol y las pelusas haciendo una o dos pasadas de la placa por sobre la
columna de calor del mechero,
- Frotis. Consiste en extender o repartir la suspensión de bacterias sobre la placa
portaobjeto, una vez que ha sido depositada la gota de agua-bacteria, éste extensión se
hará con la ayuda de un asa o placa portaobjeto limpia, lo que permitirá realizar una
mejor observación
- Fijación. Fije las bacterias a la placa haciendo pasar tres veces el portaobjeto en la
llama del mechero de alcohol a una altura prudencial, para no deformar las agrupaciones
bacterianas que pudieran existir.
- Tinción. emplee un solo colorante como el azul de metileno, fuscina, rojo congo,
tiñe la placa completamente y deje actuar el colorante por un minuto.
- Retire el colorante, enjuague y luego séquela a la columna del mechero de alcohol o
por simple exposición al aire con movimientos horizontales
- Agregue una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observe las bacterias al
microscopio, utilizando el lente húmedo o de inmersión.
Tinción Compuesta
- Se colocó el colorante A (violeta de genciana) por espacio de medio minuto.,
elimine el exceso.
- Se agregó el colorante B (solución de yodo) por un minuto. Elimine el exceso con
leves sacudimientos de la placa o con la pisceta.
- Añada la solución C (safranina) por 30 segundos.
- Se lavó la placa con agua corriente y luego séquela a la columna del mechero de
alcohol, o por simple exposición al aires con movimientos horizontales.
- Se agregó una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observe las bacterias al
microscopio, utilizando el lente húmedo o de inmersión.
9. RESULTADOS
10. CONCLUSIONES
11. CUESTIONARIO.
¿Qué es una tinción diferencial?
Defina cual es el rol de los colorantes utilizados en la Tinción compuesta
Es en la que se usa mas de un colorante, son tinciones usadas para diferenciar
estructuras bacterianas, como Schaefer-fulton para endosporas, como la tinción de Gram
para gram - y gram+.

5. 12. BIBLIOGRAFÍA
Cavallini, E. R. (2005 ). Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio.
Costa Rica: Universidad de Costa Rica.
EUNED. (2004). Introducción a la microbiología. Reverte.
Forbes, B. A. (2009). Diagnostico Microbiologico. Médica Panamericana.