El documento describe el procedimiento de la tinción de Gram. Explica que la tinción de Gram diferencia bacterias según su pared celular y que las bacterias Gram positivas se tiñen de violeta mientras que las Gram negativas se tiñen de rosa. Además, detalla los pasos del procedimiento, incluyendo el uso de cristal violeta, lugol, alcohol y safranina para teñir las muestras bacterianas.

1. UNIDAD 3:
BACTERIOLOGÍA
Tema 1:
Bacteriología
Dr. Abg. Gabriel P. Layedra R. MsC.
Especialista en Infectología y Medicina Tropical
MsC Criminalística, Infectólogo – Perito, Legista
Actualizado hasta
20/Jul/2021
Subtema 4: Práctica No. 9 Interpretar el fundamento de la tinción de Gram.
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2. ➢ ¿Cuáles son las características de la técnica Gram?
➢ ¿Cuáles son las diferencias entre Gram + y Gram -?.
➢ ¿Qué facilita la tinciones Gram?
INTRODUCCIÓN
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3. Conocer las características de las tinciones Gram.
OBJETIVO
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4. UNIDAD 3:
BACTERIOLOGÍA
Tema 1:
Bacteriología
Subtema 4: Práctica No. 9
Interpretar el fundamento de la
tinción de Gram.
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5. ACTIVIDAD DE INICIO
Observar vídeo motivador: La tinción Gram. https://www.youtube.com/watch?v=hSL6gOj7B4w
Presentar del syllabus y lineamientos generales para el desarrollo de la asignatura; metodología y sistema de
evaluación.
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6. Subtema 4: Práctica No. 9 Interpretar el fundamento de la tinción de Gram.
¿En qué consiste la Tinción de Gram?
❖ La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio diseñada por Christian Gramen el año 1884.
❖ El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de bacterias
para así poder estudiarlas y clasificarlas.
❖ Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra.
❖ Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan Gram negativas. Están formadas por una
pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda membrana rica en lípidos (que
repele la tinción Gram), al microscopio aparecen incoloras.
❖ El cristal violeta se une a la pared bacteriana y se estabiliza con el lugol.
❖ La mezcla alcohol-acetona disuelve la membrana externa de las bacterias Gram negativas (más fina que la de las
Gram positivas) extrayéndose el cristal violeta. Después se tiñen solo las Gram negativas con safranina.
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•Placa Petri con agar chocolate
•Asa de siembra o material estéril para sembrar
•Mechero de alcohol
•Agua destilada
•Colorantes de tinción Gram (cristal violeta, lugol,
alcohol-acetona 1:1, safranina)
•Cristalizador y varillas de tinción
•Portaobjetos
•Alcohol 96º
•Papel secante
•Microscopio óptico
Material necesario

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Procedimiento Tinción de Gram
1. Realizamos una tinción, con microorganismos sembrados.
Dichos microorganismos los hemos sembrado el día
anterior mediante la técnica de siembra de estría múltiple,
los hemos dejado incubar durante 24 horas a 37ºC en la
incubadora para así obtener las colonias de los diferentes
microorganismos.
2. En condiciones de esterilidad. Para conseguir estas condiciones
podemos utilizar un mechero Bunsen o un mechero de alcohol.
Con el mechero, conseguiremos que se forme un ambiente de
esterilidad alrededor de la llama, por lo tanto, si trabajamos cerca
del mechero, tendremos un ambiente estéril.

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3. A la hora de comenzar con la tinción, lo primero que hay que
realizar es un frotis del microorganismo, para ello hay que añadir
una gota pequeña de agua destilada (cuanto mayor sea la gota,
tardará más tiempo en secarse).
4. Debemos coger la muestra con el asa bacteriológica previamente
esterilizada. Para ello encendemos el mechero de alcohol y ponemos
el asa en posición vertical encima del mechero hasta que el hilo del
extremo del asa se quede totalmente incandescente.

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5. Esperamos a que se enfríe porque si tocamos con el hilo
incandescente las colonias podemos matar al microorganismo.
Abrimos la placa con las bacterias y con el asa tocamos en el agar
para comprobar que éste está frío.
6. Cogemos unas colonias de las bacterias y las extendemos
sobre la gota de agua destilada.

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7. Volvemos a esterilizar el asa (todo material debe ser
esterilizado antes de volver a ser guardado). Fijamos la
muestra, con metanol o con calor.
8. Una vez fijada la muestra apagamos el mechero por
seguridad. Ahora, vamos a teñir nuestra siembra de
microorganismos en el portaobjeto con diferentes tipos de
tinciones para poder visualizar cada microorganismo al
microscopio. Las tinciones se realizan en un cristalizador,
también utilizamos varillas de tinciones y el porta con la
muestra.

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9. Vamos a utilizar diferentes reactivos para la
tinción. En primer lugar el cristal violeta, en
segundo lugar el Lugol.
10. Usaremos también alcohol de 96º (el decolorante puede
estar formado por una mezcla de alcohol, alcohol-acetona y por
diferentes mezclas).

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11. Luego aplicamos la safranina.
Las bacterias gram + y las bacterias gram - tienen diferente grosor en el
peptidoglicano de su pared celular, de tal forma que cuando echemos el cristal
violeta se nos van a teñir tanto las gram + como las gram -.
El lugol lo que hará, será fijar el colorante del cristal violeta a las bacterias, con
el alcohol (o mezcla decolorante), lo que haremos será eliminar el cristal violeta
de las gram - y por último, la safranina, va a teñir solamente a las gram
negativas que son las que están decoloradas.
Por lo tanto, las gram + estarán teñidas de cristal violeta y las gram - de
safranina (color fucsia).

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11. Una vez que ha transcurrido el minuto lo lavamos con
agua destilada.
12. Ahora vamos a añadir el lugol justo por encima de la
zona de la muestra y esperamos otro minuto.
Se debe aplicar a las bacterias fijadas cristal violeta durante un minuto,
luego lavar con el frasco lavador. Luego, añadir lugol durante un
minuto, volver a lavar con el frasco lavador.
Después, añadir durante 10 o 15 segundos la mezcla de alcohol o
alcohol-acetona…, lavar la muestra con el frasco lavador.
Y finalmente, añadir safranina durante un minuto y lavar con agua
destilada.

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13. Lavamos con agua destilada. Decoloraremos la
muestra con el alcohol. Cada protocolo estipula un
tiempo pero con 15 segundos aproximadamente la
muestra quedará decolorada.
14. Tras los 15 segundos de decoloración, aclararemos con agua
destilada para que el alcohol no siga actuación, Por último,
aplicamos a la muestra la safranina y lo dejamos actuar durante
otro minuto.

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15. Transcurrido el minuto, volvemos a aclarar la muestra con agua
destilada y dejaríamos que la muestra se secara. Posteriormente
observaremos la muestra con el microscopio.

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20. ACTIVIDAD DE CIERRE
Realizar las conclusiones de la clases, resolver interrogantes y orientar los recursos que deben revisar para la
actividad práctica.
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21. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• Madigan M.T, Martinko J.M., Stahl D and Clark D.P., Brock Biology of microorganisms, 13th edition, UK, Pearson Benjamin
Cummings, 2010.
• Madigan M.T, Martinko J.M., Dunlap P.V. and Clark D.P., Brock Biología de los microorganismos, 12a edición, UK, Pearson
Education, 2009.
• Prescott L.M., Harley J.P. and Klein G.A., Microbiología, 3a edición, Madrid, México, Mc GrawHill-Interamericana, 2009.
• https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/01historia.htm
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